具有抗肿瘤活性的黄芩和黄连提取物及其质量检测方法与应用与流程

1.本发明涉及一种中药技术领域，具体涉及具有抗肿瘤活性的黄芩和黄连提取物及其质量检测方法与应用。


背景技术：

2.高效液相色谱以液体为流动相，通过高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。中药化学成分复杂多样，如何高效分离识别中药化学成分是中药药效物质基础研究中的一个关键性难题，以往常用的薄层色谱等方法因其精密度、准确度、灵敏度等方面较差，不能满足现代中药研究的需要。高效液相色谱法通过简单的前处理后，将少量的药品上机检测，简单高效、易于操作地对中药成分进行快速准确的分析，目前高效液相已经被广泛应用于生物碱、黄酮、皂苷等各种中药有效成分的测定。
3.黄芩为唇形科植物黄芩(scutellaria baicalensis georgi)的干燥根，是中医临床和中成药种最为常用的中药之一，其主要化学成分包括黄酮及其苷类、萜类、挥发油以及多种微量元素。黄连为毛茛科植物黄连(coptis chinensis franch.)、三角叶黄连(coptis deltoidea c.y.cheng et hsiao)或云连(coptis teeta wall.)的干燥根茎，其主要有效成分为药根碱、巴马汀、小檗碱等生物碱，以及木脂素、黄酮、糖(苷)类等，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等功效。黄芩-黄连是清热燥湿配伍的经典药对，二者均属苦寒之品，均能清热燥、泻火解毒。根据中医理论黄连偏泻心胃之火；黄芩善清肺、大肠热。黄连和黄连均入手阳明大肠经，两药合用，泄火解毒、清肠止痢功著。临床中被用于结直肠癌治疗，具有良好的疗效。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，经过大量实验筛选，提供一种具有抗肿瘤活性的黄芩和黄连提取物及其质量检测方法与应用。
5.技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
6.一种具有抗肿瘤活性的黄芩和黄连提取物，它是通过以下方法制备得到的：取一定重量比的黄芩和黄连药材，先加适量水浸泡，然后加水提取，合并滤液，浓缩得到。
7.作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的黄芩和黄连提取物，它是通过以下方法制备得到的：取重量比为1～4:1～4的黄芩和黄连药材，加适量水浸泡0.5～1小时，然后加5～20倍量水提取1～3次，每次0.5～2小时，合并滤液，浓缩、得到。
8.作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的黄芩和黄连提取物，它是通过以下方法制备得到的：取重量比为1:1的黄芩和黄连药材，加适量水浸泡0.5小时，然后加10倍量水提取2次，每次1小时，合并滤液，浓缩、得到。
9.一种具有抗肿瘤活性的黄芩和黄连提取物的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.步骤(1)对照品溶液的制备
11.分别精密称取盐酸黄连碱、药根碱、表小檗碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和白杨素标准品，转移至容量瓶中，加甲醇定容，制成以上化合物的标准品母液；
12.分别精密量取以上化合物的标准品母液适量，加甲醇配置为含黄连碱：34.99μg/ml、表小檗碱：28.25μg/ml、药根碱：17.945μg/ml、小檗碱：25.798μg/ml、巴马汀：38.988μg/ml、黄芩苷：82.969μg/ml、汉黄芩苷：51.519μg/ml、黄芩素：9.717μg/ml、汉黄芩素：2.0226μg/ml、白杨素：1.6766μg/ml的混合标准品溶液；
13.步骤(2)供试品溶液的制备
14.取重量比为1～4:1～4的黄芩和黄连药材，加适量水浸泡0.5～1小时，然后加5～20倍量水提取1～3次，每次0.5～2小时，合并滤液，浓缩，加甲醇溶解，进样之前过微孔滤膜；
15.步骤(3)线性回归方程的建立
16.取步骤(1)的混合标准品溶液，依次稀释5倍，通过0.22μm纤维素膜过滤，得到系列浓度的混合对照品溶液，依次注入hplc，以系列对照品浓度作为横坐标x，对应的峰面积为纵坐标y，对各化学成分进行线性回归分析并计算线性回归方程；
17.步骤(4)含量测定
18.取步骤(2)的黄芩和黄连药对供试品溶液，注入hplc进行分析，将峰面积代入步骤(3)的线性回归方程，计算供试品溶液中各成分的含量。
19.作为优选方案，以上所述的质量检测方法，步骤(1)对照品溶液的制备
20.分别精密称取盐酸黄连碱、药根碱、表小檗碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和白杨素标准品，转移至容量瓶中，加甲醇定容，制成以上化合物的标准品母液；
21.分别精密量取以上化合物的标准品母液适量，加甲醇配置为含黄连碱：34.99μg/ml、表小檗碱：28.25μg/ml、药根碱：17.945μg/ml、小檗碱：25.798μg/ml、巴马汀：38.988μg/ml、黄芩苷：82.969μg/ml、汉黄芩苷：51.519μg/ml、黄芩素：9.717μg/ml、汉黄芩素：2.0226μg/ml、白杨素：1.6766μg/ml的混合标准品溶液，4℃保存，进样前，过0.22μm微孔滤膜。
22.作为优选方案，以上所述的质量检测方法，步骤(2)供试品溶液的制备
23.取重量比为1:1的黄芩和黄连药材，加适量水浸泡0.5小时，然后加10倍量水提取2次，每次1小时，合并滤液，浓缩，加甲醇溶解，进样之前过微孔滤膜。
24.作为优选方案，以上所述的质量检测方法，步骤(3)和步骤(4)中的hplc的色谱条件为：
25.色谱柱：inertsil ods-sp，规格4.6
×
150mm，5μm；agilent 1660自动高效液相系统；dad多波长检测器；流动相：含0.1％甲酸和0.05％三乙胺的水溶液为a相：甲醇为b相，流速为1ml/min，检测波长275nm，梯度洗脱程序：0-5min,b:20％-27％；5-30min,b:27％-36.4％；30-40min,b:36.4％-46.5％；40-55min,b:46.5％-60％；55-61min,b:60％-63.5％；61-61.1min,b:63.5％-20％；61.1-65min,b:20％-20％；柱温40℃，进样量10μl。
26.作为优选方案，以上所述的质量检测方法，步骤(3)中10种对照品的线性回归方程如下表：
27.成分标准线性方程成分标准线性方程黄连碱y＝36.494x+3.3671黄芩苷y＝40.797x-11.134表小檗碱y＝33.686x-4.2635汉黄芩苷y＝45.155x-4.0352药根碱y＝40.86x+3.945黄芩素y＝58.563x+2.7329小檗碱y＝33.615x-7.7111汉黄芩素y＝112.6x+3.8589巴马汀y＝39.105x-8.4981白杨素y＝54.151x+0.6312
28.。
29.本发明通过实验发现，黄芩和黄连提取物具有较好的抗结肠癌的功效。
30.有益效果：本发明提供的黄芩和黄连药对的提取物和现有技术相比具有以下优点：
31.本发明根据黄芩和黄连药对中碱性的生物碱和酸性的黄酮成分的结构及其性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，洗脱程序、流速，色谱柱、质谱条件等分析条件。经方法学实验验证表明，本发明能够同时检测不同结构生物碱和黄酮化合物。该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确的评价黄芩和黄连药对药材及其提取物与制剂的质量，对控制质量和保证临床疗效具有重要意义。
32.另外本发明通过mtt方法测定黄芩-黄连提取液对结直肠癌细胞活力具有很好的抑制作用。
附图说明
33.图1为混合标准品(a)和供试品溶液(b)的色谱图。
34.图2为黄芩-黄连提取物抑制结直肠癌细胞活力的柱形图。
具体实施方式
35.下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定的范围。
36.以下实施例所用的仪器与试剂
37.agilent 1660自动高效液相系统、万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器)、tecan spark 10m多功能酶标仪，sw620细胞株，盐酸黄连碱、药根碱、黄芩苷购自上海源叶生物有限公司；表小檗碱、巴马汀购自成都普菲德生物技术有限公司；汉黄芩苷购自成都瑞芬思生物科技有限公司；汉黄芩素购自南通飞宇生物科技有限公司；盐酸小檗碱购自中国药品生物制品检定所；黄芩素购自天津一方科技有限公司；白杨素购于中国食品药品检定研究院；超纯水(屈臣氏)；甲醇、甲酸、三乙胺购自阿拉丁。
38.实施例1
39.一种具有抗肿瘤活性的黄芩和黄连提取物，它是通过以下方法制备得到：取重量比为1:1的黄芩和黄连药材，加适量水先浸泡0.5小时，然后加10倍量水煎煮提取2次，每次1小时，合并滤液，浓缩、得到。
40.实施例2
41.1、一种具有抗肿瘤活性的黄芩和黄连提取物的质量检测方法，包括以下步骤：
42.步骤(1)对照品溶液的制备
43.分别精密称取盐酸黄连碱、药根碱、表小檗碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和白杨素标准品各10mg，将标准品分别转移至10ml容量瓶中，加甲醇定容至10ml，分别制成1mg/ml的盐酸黄连碱、药根碱、表小檗碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和白杨素标准品标准品母液。
44.分别精密量取各个标准品母液适量加甲醇配置为含黄连碱：34.99μg/ml、表小檗碱：28.25μg/ml、药根碱：17.945μg/ml、小檗碱：25.798μg/ml、巴马汀：38.988μg/ml、黄芩苷：82.969μg/ml、汉黄芩苷：51.519μg/ml、黄芩素：9.717μg/ml、汉黄芩素：2.0226μg/ml、白杨素：1.6766μg/ml的混合标准品溶液。
45.步骤(2)供试品溶液的制备
46.取5份重量比为1:1的黄芩和黄连药材，分别加适量水浸泡0.5小时，然后加10倍量水提取2次，每次1小时，合并滤液，浓缩，加甲醇溶解，得到5份供试品溶液，进样之前过微孔滤膜。
47.步骤(3)线性回归方程的建立
48.取步骤(1)的混合标准品溶液，依次稀释5倍，通过0.22μm纤维素膜过滤，得到系列浓度的混合对照品溶液，依次注入hplc，以系列对照品浓度作为横坐标x，对应的峰面积为纵坐标y，对各化学成分进行线性回归分析并计算线性回归方程，如表1所示；
49.步骤(4)含量测定
50.取步骤(2)的5份黄芩和黄连药对供试品溶液，注入hplc进行分析，将峰面积代入步骤(3)的线性回归方程，计算供试品溶液中各成分的含量，测定5份供试品溶液各成分的含量见表2所示。如图1所示，各对照品成分的出峰时间分别为，(a)黄连碱：15.33min；(b)黄芩苷：36.863min；(c)表小檗碱：17.085min；(d)汉黄芩苷：45.171；(e)药根碱：19.505min；(f)黄芩素：51.215min(g)小檗碱：22.209min；(h)汉黄芩素：57.600min；(i)巴马汀：24.256min；(j)白杨素：59.736min。供试品色谱图如图2所示。
51.以上步骤(3)和步骤(4)中的hplc的色谱条件为：
52.色谱柱：inertsil ods-sp，规格4.6
×
150mm，5μm；agilent 1660自动高效液相系统；dad多波长检测器；流动相：含0.1％甲酸和0.05％三乙胺的水溶液为a相：甲醇为b相，流速为1ml/min，检测波长275nm，梯度洗脱程序：0-5min，b:20％-27％；5-30min,，b:27％-36.4％；30-40min,，b:36.4％-46.5％；40-55min，b:46.5％-60％；55-61min，b:60％-63.5％；61-61.1min，b:63.5％-20％；61.1-65min，b:20％-20％；柱温40℃，进样量10μl。
53.表1 10种对照品的线性回归方程如下表
54.成分标准线性方程r2线性范围(μg/ml)黄连碱y＝36.494x+3.3671r2＝11.09-87.48表小檗碱y＝33.686x-4.2635r2＝10.88-70.63药根碱y＝40.86x+3.945r2＝10.56-44.86小檗碱y＝33.615x-7.7111r2＝0.99960.81-64.50巴马汀y＝39.105x-8.4981r2＝0.99971.22-97.47
黄芩苷y＝40.797x-11.134r2＝0.99952.59-207.42汉黄芩苷y＝45.155x-4.0352r2＝0.99981.61-128.80黄芩素y＝58.563x+2.7329r2＝0.99980.61-24.29汉黄芩素y＝112.6x+3.8589r2＝0.99970.13-5.07白杨素y＝54.151x+0.6312r2＝0.99950.10-4.19
55.。
56.表2黄芩-黄连提取物中10个成分的含量测定结果
57.成分样品1(μg/ml)样品2(μg/ml)样品3(μg/ml)样品4(μg/ml)样品5(μg/ml)表小檗碱4757.444625.994761.454897.754885.81黄连碱3873.773773.563794.634076.124181.89药根碱4339.664849.863688.643596.935122.66小檗碱17743.6918589.6218936.6819708.5519622.68巴马汀6160.196052.416379.476591.436943.53黄芩苷29506.2130736.5730649.0530887.1332734.20汉黄芩苷8049.068062.028151.458383.409290.49黄芩素1037.811057.951082.581032.121164.29汉黄芩素363.10365.63372.94380.31416.92白杨素156.87160.07162.50164.83182.80
58.。
59.2、加样回收率的考察
60.取已知含量的“黄芩-黄连”提取液6份，每份1ml，精密量取，以加标量100％为例，精密加入黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素的对照品分别为11.89、9.68、10.85、44.36、15.40、73.76、20.12、2.60、0.91、0.39μg。按上述色谱条件进样，计算回收率，结果如下表3。
61.表3.黄芩-黄连提取物中10种成分的加样回收率
[0062][0063][0064]
以上加样回收实验表明本发明建立的方法准确度高。另外方法学考察中，日内精密度实验rsd＜4.3％，说明仪器的精密度良好；重复性实验rsd＜3.5％，表明该方法的重复性良好；稳定性实验rsd＜3.7％，表明各待测化合物在4℃条件下24h内能稳定存在。
[0065]
实施例3黄芩-黄连提取液抑制结直肠癌细胞活力(mtt测定)
[0066]
1、黄芩-黄连提取液
[0067]
取比为1:1的黄芩和黄连药材，分别加适量水浸泡0.5小时，然后加10倍量水提取2次，每次1小时，合并滤液，浓缩，得到提取物。
[0068]
2、将sw620细胞铺设在96孔板中培养24h，将细胞暴露在不同浓度黄芩-黄连提取物中24h(0.3g/l、0.5g/l、1g/l、1.5g/l、3g/l、4g/l、5g/l)，未经处理组作为空白对照，各空加入10μl 5mg/ml(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)溴化物(mtt)孵育4小时后每孔加入100μl dmso溶液，使用酶标仪在490nm处测量吸光度。黄芩-黄连提取物能够浓度依赖性抑制sw620细胞活力，ic50为2.321g/l。显示较好的抗结直肠癌的活性。
[0069]
本发明提供的检测方法能同时准确检测黄芩和黄连药对供试品中生物碱类成分和黄酮类10个成分，并且本发明提供的黄芩和黄连药对供试品及其提取物的质量控制方法，精密度高，灵敏度高，稳定性和准确度高，可以客观、全面、准确地评价黄芩和黄连药对供试品药材及其提取物与制剂的质量，对准确控制黄芩和黄连药对供试品药材及其制剂的质量具有重要意义。
[0070]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。