一种藏红花活性成分的提取方法及应用与流程

1.本发明涉及天然药物提取技术领域，特别是涉及一种藏红花活性成分提取方法及应用。


背景技术：

2.随着现代医学化学药物的毒副作用和抗药性日渐明显，天然药物来源广泛且其毒副作用较少，尤其天然植物药物中的许多活性成分具有抗变态反应、抗细菌病毒等诸多的作用，是新药开发的潜在先导物。
3.鼻炎即鼻腔炎性疾病，是病毒、细菌、变应原、各种理化因子以及某些全身性疾病引起的鼻腔黏膜的炎症，在很大程度上影响着现代人的生活。从鼻科医生角度来看，鼻粘膜出现炎症为鼻炎；鼻窦黏膜出现炎症为鼻窦炎；鼻腔鼻窦都有炎症称之为鼻鼻窦炎；针对不同的炎症，在治疗的方式上使用药物的种类、剂量、时间等与病变范围并不存在必然相关性。换而言之，鼻炎是个广义的概念，但是从鼻外科医生角度看，鼻炎、鼻窦炎及鼻鼻窦炎加以确切划分却有重要的临床价值，因为病变部位和范围的准确判断是确定鼻内镜外科手术如何实施的重要依据，多维性鼻炎事关常规内科治疗和鼻外科术后常规康复治疗。
4.其中藏红花作为传统藏医经常使用的治疗鼻黏膜炎性疾病的药物，历史悠久、效果良好，可以作为治疗的一个很好选择。藏红花可增加患者和动物的谷胱甘肽含量，降低氧化型谷胱甘肽水平，平衡还原型谷胱甘肽(保护性谷胱甘肽)和氧化型谷胱甘肽(损伤性谷胱甘肽)，显示出其在炎性疾病中避免氧化应激损伤的重要作用。同时，藏红花还可以抑制炎症相关酶如环氧化酶(cox)2、丝裂原活化激酶；炎症相关因子如白细胞介素－1、白细胞介素－2、白细胞介素－6等来起到降低炎症程度的作用。目前藏红花活性成份对鼻鼻窦炎相关领域中的研究还未见文献报道及相关医药产品。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种藏红花活性成分的提取方法及该活性成分在制备治疗慢性炎症药物中的应用，根据藏红花活性成分抗炎及抗变态反应的活性作用，在慢性炎性疾病中研究th2/ilc2轴炎症体系及藏红花素干预机制。
6.本发明的一个目的在于，提供了一种藏红花活性成分在制备治疗慢性炎症药物中的应用。
7.优选的，在上述应用中，所述慢性炎症包括慢性鼻炎、慢性鼻窦炎、慢性鼻鼻窦炎、慢性鼻息肉。
8.优选的，在上述应用中，所述慢性鼻窦炎为含鼻息肉的慢性鼻窦炎或不含鼻息肉的慢性鼻窦炎。
9.优选的，在上述应用中，所述慢性炎症是il－33介导的炎症。
10.优选的，在上述应用中，所述藏红花活性成分为藏红花素，且所述药物的剂型为溶液剂、颗粒剂、胶囊剂或者片剂。
11.优选的，在上述应用中，所述藏红花素的浓度为10ug/ml。
12.优选的，在上述应用中，所述药物包括所述藏红花活性成分和药学上可接受的辅料。
13.本发明的另一个目的在于，提供了一种藏红花活性成分的提取方法，应用于上述制备治疗慢性炎症的药物中，所述提取方法包括以下步骤：
14.(1)将藏红花粉碎、过筛，得藏红花粉末；
15.(2)将所述藏红花粉末溶解于纯化水或生理盐水中，溶解后进行过滤，即得藏红花提取物。
16.优选的，在上述藏红花活性成分的提取方法中，步骤(1)中所述过筛为过100目筛。
17.优选的，在上述藏红花活性成分的提取方法中，步骤(2)中当所述藏红花粉末溶解于纯化水时，所述溶解为：在室温下超声处理0.5－1.5h；
18.进一步优选的，步骤(2)中所述藏红花粉末质量与所述纯化水体积的比值为1g：(20－50)ml。
19.优选的，在上述藏红花活性成分的提取方法中，步骤(2)中当所述藏红花粉末溶解于生理盐水时，所述溶解为：在4℃的条件下浸泡2－4h。
20.进一步优选的，步骤(2)中所述藏红花粉末质量与所述生理盐水体积的比值为1g：100ml。
21.优选的，在上述藏红花活性成分的提取方法中，所述过滤是通过0.45μm微膜进行。
22.优选的，在上述藏红花活性成分的提取方法中，还包括步骤(3)：将步骤(2)得到的藏红花提取物进行冻干、内包装、灭菌、外包装。
23.优选的，在上述藏红花活性成分的提取方法中，所述冻干是将所述藏红花提取物的过滤液放置在低硼硅玻璃管注射剂瓶，进行冻干周期55－70h，即得藏红花提取物冻干粉。
24.进一步优选的，所述冻干周期为63h。
25.进一步优选的，所述藏红花提取物的灌装量为15ml。
26.进一步优选的，所述注射剂瓶的胶塞为无甘油的溴化丁基橡胶塞。
27.本发明实施例一种藏红花活性成分的提取方法及该活性成分在制备治疗慢性炎症药物中的应用，与现有技术相比，其有益效果在于：
28.本发明藏红花活性成分的提取方法过程简单，提取得到的藏红花素对气道黏膜具有明确的抗氧化、抗炎症反应以及调控th2免疫轴的作用，对鼻维炎相关治疗领域具有较好的康复疗效，开发藏红花活性成份产品不仅有助于普通内科型鼻炎治疗，同时更有助于术后鼻腔创面修复及功能康复等多维度的治疗效应，并且藏红花素还具有神经康复作用。
附图说明
29.图1是鼻息肉中细胞免疫表型的示意图一；
30.图2是鼻息肉中细胞免疫表型的示意图二；
31.图3是il－33对pbmc中炎症细胞转录因子的影响示意图(western blotting实验法)；
32.图4是il－33对pbmc中炎症细胞转录因子的影响示意图(qpcr定量分析法)；
33.图5是il－33对pbmc中炎症细胞分泌的细胞因子表达量的影响示意图(qpcr定量分析法)；
34.图6是il－33对pbmc中炎症细胞分泌的细胞因子表达量的影响示意图(elisa检测法)
35.图7是藏红花素对pbmc中炎症细胞转录因子的影响示意图一(western blotting实验法)；
36.图8是藏红花素对pbmc中炎症细胞转录因子的影响示意图二(qpcr定量分析法)；
37.图9是藏红花素对pbmc中炎症细胞分泌的细胞因子的影响示意图(qpcr定量分析法)；
38.图10是藏红花素对pbmc中炎症细胞分泌的细胞因子的影响示意图(elisa检测法)；
39.图11是藏红花素抑制pbmc炎症反应潜在机制的结果示意图(western blotting实验法)；
40.图12是藏红花素对鼻息肉外植体炎症细胞分泌的细胞因子的影响示意图(western blotting实验法)；
41.图13是藏红花素对鼻息肉外植体炎症细胞分泌的细胞因子的影响示意图(qpcr定量分析法)；
42.图14是藏红花素对鼻窦炎患者嗅觉康复的影响示意图。
具体实施方式
43.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.一、藏红花活性成分在制备治疗慢性炎症药物中的应用研究
45.1、th2/ilc2轴在鼻息肉中研究
46.收集进行鼻内镜外科手术病理证实为鼻息肉的组织标本，利用western blotting和rt－pcr等不同检测分析转录因子的表达情况，并用免疫荧光共染进行lic2细胞的定位。最终我们发现鼻息肉炎症反应(嗜酸性鼻息肉)为th2炎症优势的th2/th1混合型炎症，其中嗜酸性粒细胞浸润程度和2型炎症细胞数量呈正相关，并且在嗜酸性鼻息肉组织中存在gata3+crth2+和crth2+cd25+的2型炎症细胞。证明ilc2(ii型固有淋巴细胞)参与慢性鼻窦鼻息肉发病过程，尤其是嗜酸性鼻息肉。
47.如图1所示，将dapi+crth2+cd25合并后发现cd25和crth2共染淋巴细胞，这证实了在嗜酸性鼻息肉中有cd25+crth2+的炎症细胞存在。
48.如图2所示，在嗜酸性鼻息肉中有gata3和crth2共染淋巴细胞，其中crth2在细胞膜表达，gata3在细胞核表达、并与dapi重叠。
49.2、il－33活化pbmc中的1型和2型炎症细胞激发炎症反应
50.将从嗜酸性鼻息肉患者的外周血中利用密度梯度离心法提取的pbmc(外周血单核细胞)给予不同浓度的il－33刺激，探讨il－33对pbmc炎症细胞的活化情况。实验分为四
组，分别为：pbmc；pbmc+il－3310ng/ml；pbmc+il－33 20ng/ml；pbmc+il－33 40ng/ml，添加il－33与pbmc刺激培养72小时后，收获细胞提取总蛋白和总rna，进一步行western blotting实验和qpcr定量分析，收集上清液行elisa检测炎症细胞因子。
51.(1)western blotting实验
52.提取il－33刺激的pbmc的总蛋白，行western blotting实验。
53.如图3所示，发现il－33可以激活2型炎症细胞，其转录因子gata3和细胞受体crth2在il－33刺激后较对照组表达量增加明显(p＜0.05)，并且有浓度依赖性，在il－33为20ng/ml最为显著，并且在被il－33刺激后gata3和crth2表达量增加的同时，t－bet的表达量也有相同的增加趋势(p＜0.05)，il－33可以活化pbmc中的1型和2型炎症细胞。
54.(2)qpcr定量分析
55.我们用trizol提取不同浓度il－33刺激的pbmc的总rna，行qpcr定量分析。
56.如图4所示，发现在il－33的刺激浓度为10ng/ml和20ng/ml的时候pbmc中1型和2型炎症细胞的转录因子t－bet、gata3和细胞受体crth2表达量均有升高(p＜0.05)，其中il－33的刺激浓度为20ng/ml的时候其表达量显著升高(p＜0.01)。
57.(3)il－33对pbmc及上清液中炎症细胞因子的影响
58.qpcr定量分析
59.用qpcr定量分析pbmc中炎症细胞分泌的细胞因子的表达量，如图5所示，发现1型炎症细胞因子：inf－γ和2型炎性细胞因子：il－5，il－13表达情况明显上调，(p＜0.01)，这提示il－33可以活化pbmc中的1型和2型炎症细胞，并且表达了大量的炎症细胞因子。
60.elisa检测
61.将培养液离心后收集上清液，采用酶联免疫吸附法(elisa)检测上清液中炎症细胞分泌的细胞因子的变化情况，如图6所示，发现il－33刺激后pbmc的上清液中大量炎性细胞因子被释放出来，其中inf－γ、il－5和il－13表达量明显升高，这进一步提示il－33可以活化pbmc中的1型和2型炎症细胞。
62.综上，利用western blotting和qpcr定量分析发现il－33可以活化pbmc中的1型和2型炎症细胞，细胞转录因子gata3、t－bet以及细胞受体crth2表达量增加，并且促使炎性细胞释放出大量的炎症因子如：inf－γ、il－5和il－13。因此，il－33在eos crswnp患者pbmc中具有明显的促炎作用。
63.3、藏红花素对il－33活化后的pbmc炎症反应的抑制
64.将从eos crswnp患者的外周血中提取的pbmc用il－33和藏红花素(crocin)共刺激，实验分为四组，分别为pbmc+il－33 20ng/ml；pbmc+il－33 20ng/ml+藏红花素10ug/ml；pbmc+il－33 20ng/ml+藏红花素25ug/ml；pbmc+il－33 20ng/ml+藏红花素50ug/ml；il－33和藏红花素共刺激pbmc并培养72小时后，收集pbmc的总蛋白、提取总rna进一步行western blotting实验和qpcr定量分析，收集上清液行elisa检测炎性因子。
65.(1)藏红花素对pbmc中1型和2型炎症细胞的影响
66.western blotting实验
67.提取il－33和藏红花素共刺激的pbmc总蛋白，行western blotting实验。如图7所示，研究发现藏红花素可以有效抑制il－33激活的炎症反应，其中2型炎症细胞的转录因子gata3和细胞受体crth2，1型炎症细胞转录因子t－bet均表现出了浓度依赖的抑制现象，(p
＜0.05)，而且在相对小剂量，藏红花素为10ug/ml时这种抑制现象最为明显。
68.qpcr定量分析
69.提取il－33和藏红花素共刺激的pbmc总rna，行qpcr定量分析。如图8所示，发现藏红花素可以有效抑制炎症细胞的转录因子gata3和t－bet以及细胞受体crth2的表达，藏红花素刺激和不刺激组的细胞转录因子表达量有明显差异，(p＜0.05)，其中在浓度为10ug/ml时表达量下调最为明显(p＜0.05)，这说明藏红花素对pbmc中il－33激活的炎症细胞有抑制作用。
70.(2)藏红花素对pbmc及上清液中炎性因子的影响
71.qpcr定量分析
72.qpcr定量分析pbmc中炎症细胞分泌的炎性因子的表达量，如图9所示，发现1型炎症细胞因子：inf－γ和2型炎性细胞因子：il－5，il－13表达量明显下调(p＜0.01)，这说明藏红花素可以抑制pbmc中被il－33活化的1型和2型炎症细胞释放炎性因子。
73.elisa检测上清液
74.将培养液离心后收集上清，采用酶联免疫吸附法(elisa)检测上清液中炎性因子的变化情况。如图10所示，发现藏红花素可以抑制il－33刺激后pbmc中炎性因子的释放，其中藏红花素组上清液中inf－γ、il－5和il－13表达量明显下降，(p＜0.01)。
75.(3)藏红花素抑制pbmc炎症反应参与的信号通路
76.western blotting实验
77.提取il－33和藏红花素共刺激的pbmc的总蛋白行western blotting实验，如图11所示，发现藏红花素处理组中nf－κb(p65)蛋白呈现出明显的下降趋势(p＜0.5)，而且在磷酸化nf－κb(p－p65)中呈现出现相同的下调趋势，因此认为藏红花素在pbmc中是通过nf－κb途径发挥抗炎作用的。
78.western blotting发现藏红花素刺激后，p－65和p－p65表达水平均被抑制，其中浓度为10ug/ml时最为明显。
79.(4)鼻息肉外植体抗氧化研究
80.收集并培育鼻息肉外植体，以seb(金黄色葡萄球菌肠毒素b)刺激鼻息肉外植体诱发炎症反应，再给予不同浓度藏红花素进行共刺激，探讨藏红花素对鼻息肉外植体炎症细胞分泌的细胞因子的影响。通过藏红花素在鼻息肉外植体抗氧化研究中发现，鼻息肉同细菌毒素seb体外刺激后释放更多inos等氧化指标，而减少sod2等抗氧化酶，在等量seb刺激激发后再用不同浓度藏红花素干预后发现相对低浓度的藏红花素具有明显抑制氧化作用，如同前面抗炎的剂量。
81.对鼻息肉外植体行western blotting实验，如图12所示，发现seb使抗氧化性降低，氧化性增加，加入藏红花素培养后，抗氧化表达升高，而氧化表达降低；
82.对鼻息肉外植体行qpcr定量分析，如图13所示，与没有加入藏红花素相比，加入藏红花素培养后，抗氧化表达明显升高，而氧化表达降低，藏红花素为10ug/ml时，效果最好。
83.综上，藏红花素同样浓度上具有抗氧化进而发挥治疗鼻息肉作用的特点。
84.4、藏红花素对鼻息肉术后患者嗅觉康复作用研究
85.在鼻息肉术后患者的术后临床随访中发现，在嗜酸性息肉的治疗中，白三烯拮抗剂孟鲁司特口服联合鼻喷藏红花素的疗效显著，术腔上皮化良好，术后3个月、半年、一年后
随时间延长其症状评估总积分呈显著下降趋势，尤其术前术后及术后不同药物鼻腔冲洗后vas症状评估对比，如图14所示，发现藏红花提取物藏红花素无菌浸泡液鼻腔冲洗对术后上皮化良好并且总体症状有显著改善，其中嗅觉改善优于其他药物冲洗。因此认为藏红花的活性成份藏红花素不仅有抗炎作用而且对嗅神经具有康复作用。
86.5、藏红花活性成分提取方法的部分应用及拓展
87.目前以藏红花等五种藏医传统药材为原材料，我们已成功制备出藏红花活性成份提取物冻干粉。经西藏自治区人民医院伦理委员会批准，现正在进行临床药物试验，初步显示对过敏性鼻炎的疗效明显，可有有效减轻鼻塞、流涕、喷嚏等鼻黏膜刺激症状和焦虑、烦躁等鼻炎相关心理评分。
88.同时，我们查阅国内外文献、整理中藏医经典处方注意到，很多传统中草药具有抗变态反应、抗炎等诸多的作用，这些产物往往是新药开发的潜在的先导化合物，因此后续我们准备进一步推进中医(藏医)相关药物提取研究，为中药(藏药)新药的开发利用拓宽思路。我们发现草本植物锦葵，内含香豆素、花青素、锦葵多糖、皂苷等多种药理活性化合物，且已被证实具有抗炎、抗氧化、抑菌、促进粘膜再生愈合等广泛作用，可尝试与藏红花提取物制成复方制剂，可以有效弥补藏红花成本高、有异香、含色素等相关问题，目前锦葵活性成分提取正在研制中。
89.二、藏红花活性成分的测定方法研究
90.1、hplcc测定法
91.通过hplcc测定藏红花素－ⅰ、藏红花素－ⅱ峰面积计算含量，选择最佳的供试品制备条件。
92.(1)制备色谱条件
93.waters 5u c18(4.6mm 250mm，5um)色谱柱，以乙腈为流动相a，水为流动相d，按下表1中的规定进行梯度洗脱，检测波长为440nm。
94.表1流动相浓度与时间的梯度关系
[0095][0096]
(2)制备对照溶液
[0097]
精密称取藏红花素ⅰ对照品0.03mg、藏红花素ⅱ对照品0.12mg，分别置于10ml容量瓶中，加稀乙醇溶解稀释至刻度线，摇匀，即得浓度为30g/ml的藏红花素－ⅰ对照溶液与
12g/ml的藏红花素－ⅱ对照溶液，置于冰箱避光保存。
[0098]
(3)线性关系考察
[0099]
精密量取藏红花素－ⅰ对照品储备液47.04g/ml、藏红花素－ⅱ对照品储备液19.60g/ml，分别取藏红花素－ⅰ对照品储备液2ml、4ml、6ml、8ml、10ml；藏红花素－ⅱ对照品储备液0.5ml、1ml、3ml、7ml、10ml，分别置于10ml容量瓶中加稀甲醇定容至刻度，摇匀。在波长440nm处测定吸收度，以吸收度为纵坐标y，浓度为横坐标x绘制标准曲线，回归方程分别为藏红花素－ⅰ：y＝74554.0x+0、r＝0.9995，藏红花素－ⅱ：y＝69945.0x+0、r＝0.9999。
[0100]
(4)供试品溶液制备方法的优化
[0101]
(4－1)提取溶剂的选择
[0102]
称取两份0.1g的藏红花药材，分别在10ml蒸馏水、10ml生理盐水溶剂中在4℃条件下浸泡，浸泡时间2h；然后精密量取0.1ml，置于10ml容量瓶中加对应溶剂稀释至刻度线，摇匀，测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中藏红花素－ⅰ、藏红花素－ⅱ的浓度，结果如表2所示，结果表明，使用生理盐水提取藏红花素的效果更好。
[0103]
表1不同溶剂对藏红花素提取浓度的影响
[0104]
溶剂种类藏红花素
‑ⅰ
/％藏红花素
‑ⅱ
/％生理盐水7.783.56蒸馏水6.743.16
[0105]
(4－2)粉粹粒径的选择
[0106]
藏红花药材粉粹(过筛100目、70目)备用，各称取0.1g分别放置于10ml容量瓶，加10ml生理盐水溶剂，置于4℃浸泡2h备用，精密量取0.1ml，置于10ml容量瓶中加对应溶剂稀释至刻度线。摇匀，测定不同粒径的吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中藏红花素－ⅰ、藏红花素－ⅱ的浓度，如表3所示，结果表明粉粹过100目筛的提取效果最好。
[0107]
表3不同粉粹粒径对藏红花素提取浓度的影响
[0108]
粉粹粒径藏红花素
‑ⅰ
/％藏红花素
‑ⅱ
/％70目8.494.47100目11.34.45
[0109]
(4－3)浸泡时间的选择
[0110]
藏红花粉粹后过筛100目备用，称取0.1g，置于10ml量瓶中，加入10ml生理盐水溶剂，在4℃浸泡，浸泡时间为2h、4h、6h后备用。精密量取0.1ml浸泡液，置于10ml容量瓶中加对应溶剂稀释至刻度线，摇匀，测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中藏红花素－ⅰ、藏红花素－ⅱ的浓度，如表4所示，结果表明浸泡2h的提取效率最好。
[0111]
表4不同浸泡时间对藏红花素提取浓度的影响
[0112][0113]
(4－4)超声与未超声的选择
[0114]
藏红花粉粹过100目筛后备用，称取两份0.1g，分别置于10ml量瓶中，加10ml生理盐水溶剂，一份超声40min浸泡2h后备用，另一份浸泡2h后备用；分别精密量取0.1ml提取液，置于10ml容量瓶中加对应溶剂稀释至刻度线，摇匀，测定超声与未超声的吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中藏红花素－ⅰ、藏红花素－ⅱ的浓度，如表5所示，结果表明未超声的藏红花提取效率更高。
[0115]
表5超声与未超声对藏红花素提取浓度的影响
[0116]
超声情况藏红花素
‑ⅰ
/％藏红花素
‑ⅱ
/％超声9.383.82未超声11.34.45
[0117]
(4－5)供试品溶液的制备
[0118]
藏红花药材打粉过100目筛，称取0.1g，置于10ml容量瓶中，加生理盐水10ml，在4℃浸泡2h后，用0.45m水系滤膜过滤，精密取0.1ml浸泡液，置于10ml容量瓶加稀甲醇溶剂稀释至刻度线，即得供试品溶液。
[0119]
2、紫外分光光度测定法
[0120]
通过紫外分光光度仪测定藏红花素－ⅰ、藏红花素－ⅱ吸光度计算含量，选择最佳的供试品制备条件。
[0121]
(1)制备对照溶液
[0122]
精密称取藏红花素ⅰ对照品2.8mg、藏红花素ⅱ对照品2.0mg，分别置于50ml容量瓶中，加稀乙醇溶解稀释至刻度线，摇匀，即得浓度为54.88g/ml的藏红花素－ⅰ对照溶液与39.2g/ml的藏红花素－ⅱ对照溶液，置于冰箱避光保存。
[0123]
(2)制备工作曲线
[0124]
精密量取藏红花素－ⅰ对照品储备液54.88g/ml，藏红花素－ⅱ对照品储备液39.2g/ml，分别取藏红花素－ⅰ对照品储备液2ml、4ml、6ml、8ml、10ml；藏红花素－ⅱ对照品储备液1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml分别置于10ml容量瓶中加稀甲醇定容至刻度，摇匀，在波长440nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标y，浓度为横坐标x绘制标准曲线，回归方程分别为藏红花素－ⅰ对照品储备液：y＝24.3306x－0.5171、r＝0.9990，藏红花素－ⅱ对照品储备液：y＝19.6688x－0.1806、r＝0.9998。
[0125]
(3)供试品溶液制备方法的优化
[0126]
(3－1)提取实验条件的选择
[0127]
藏红花粉粹过100目筛后备用，称取三份0.1g，分别置于10ml量瓶中，加10ml纯化水溶剂，分别在表7的实验条件，精密量取0.1ml提取液，置于10ml容量瓶中加对应溶剂稀释至刻度线，摇匀，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中藏红花素－ⅰ、藏红花素－ⅱ的浓度，如表6所示，结果表明室温超声1h的提取率高。
[0128]
表6不同提取实验条件对藏红花素提取率的影响
[0129][0130]
(3－2)不同溶质与溶剂比例的选择
[0131]
藏红花粉粹过100目筛备用，分别称取0.1g、0.2g、0.25g、0.5g分别置于10ml量瓶中，加10ml纯化水溶剂，室温超声1h后，将各溶液稀释工作曲线范围内，摇匀，测定吸光度，准曲线上读出供试品溶液中藏红花素－ⅰ、藏红花素－ⅱ的浓度，如表7所示，结果表明溶质与溶剂比例为1：20时藏红花的提取率高。
[0132]
表7不同溶质与溶剂比例对藏红花素提取率的影响
[0133][0134]
(3－3)提取时间的选择
[0135]
藏红花粉粹过100目筛备用，称取六份0.5g，分别置于10ml量瓶中，加10ml纯化水溶剂，分别在表8的实验条件，精密量取0.005ml提取液，置于10ml容量瓶中加对应溶剂稀释至刻度线，摇匀，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中藏红花素－ⅰ、藏红花素－ⅱ的浓度，结果表明室温超声1h的提取率高。
[0136]
表8提取时间对藏红花素提取率的影响
[0137][0138]
(3－4)制备供试品
[0139]
藏红花药材打粉过100目筛，称取0.5g，置于10ml容量瓶中，加纯化水10ml，在室温超声1h，0.45m过滤，精密取0.002ml滤液，置于10ml容量瓶加稀甲醇溶剂稀释至刻度线，即得供试品溶液。
[0140]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的方案而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
[0141]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。