缓解口腔溃疡的组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药制备技术领域，具体涉及一种缓解口腔溃疡的组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.口腔溃疡是指出现在口腔内唇、上腭以及舌颊等部位黏膜上，呈现圆形或者椭圆形的疼痛溃疡点，疼痛明显。口腔溃疡是一种常见的口腔黏膜疾病，目前在我国发病率较高。我国10％～25％的人群患有复发性口腔溃疡，在特定人群中，该病的患病率甚至可以达到50％。具有周期性、复发性及自限性的特点。
3.目前口腔溃疡的治疗主要在疼痛难忍时使用止痛药物，如利多卡因凝胶、复方苯佐卡因凝胶、苄达明喷雾剂等。将其涂于溃疡面，有迅速麻醉止痛效果。或者氯己定含漱液、西地碘片等，有抗菌、抗病毒、收敛和消肿、止血作用。这些用药属于西药，应防止常用成瘾。
4.在植物中分离提纯的一些天然小分子化合物被证明对皮肤具有一定的光损伤保护作用，例如中药中含有的肽类、酚类、小分子化合物等具有抗氧化损伤、清除自由基、抗炎、抗老化、抗癌等多种生物活性，可起到预防和治疗皮肤光损伤的作用，受到临床的广泛重视和应用。因此，开发更多的结构新颖的具有上述任一生物活性的肽类、酚类等小分子化合物具有重要的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的是要提供一种由天然活性成分组成，能够止疼消炎、减少反复次数、增加溃疡面愈合效果，且副作用小、疗效独特的缓解口腔溃疡的组合物及其制备方法和应用。
6.为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
7.一种缓解口腔溃疡的组合物，其包括活性多糖、天然提取物及天然多酚类化合物，所述的活性多糖、天然提取物及天然多酚类化合物的质量百分比为 1.1～2：0.03～3：0.003～0.3。
8.上述的一种缓解口腔溃疡的组合物，其所述活性多糖包括枸杞活性多糖和/ 或沙棘活性多糖。
9.上述的一种缓解口腔溃疡的组合物，其所述活性多糖采用如下方法的制备获得:分别取枸杞多糖或沙棘多糖，加入与枸杞多糖或沙棘多糖体积5～10倍的纯水溶解，将水溶液用孔径小于等于15kd的透析袋透析，收集透析液，冻干获得分子量小于15kd的枸杞活性多糖和/或沙棘活性多糖。
10.上述的一种缓解口腔溃疡的组合物，其所述活性多糖的分子量低于15kda，优选地，枸杞多糖的分子量为3～5kda、沙棘多糖的分子量为1～3kda。
11.上述的一种缓解口腔溃疡的组合物，其所述天然提取物包括薄荷提取物冻干物、百香果提取物冻干物、水蜜桃提取物冻干物中的一种或几种。
12.上述的一种缓解口腔溃疡的组合物，其所述天然提取物采用如下方法获得：分别取新鲜薄荷或百香果或水蜜桃，加入5～10倍的纯水或体积分数为10％～70％的乙醇，超声提取20分钟，收集提取液，冻干即制得薄荷提取物冻干物、百香果提取物冻干物、水蜜桃提取物冻干物。
13.上述的一种缓解口腔溃疡的组合物，其所述天然多酚类化合物从陈皮中分离提取，包括结构式为的陈皮多酚-a，结构式为的陈皮多酚-b，结构式为的陈皮多酚-c。
14.上述的一种缓解口腔溃疡的组合物，其所述天然多酚类化合物采用如下分离提取方法获得：取陈皮，粉碎，加水超声提取30分钟，离心20分钟，取上清液，减压浓缩，得到浸膏；浸膏加适量水混悬，用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部位以及水部位；将乙酸乙酯部位或水部位采用200-300目的硅胶柱层析分离，以乙酸乙酯-甲醇系统按100:10
→
1:100的梯度洗脱，获得多个不同馏分；将具有最佳保护活性的馏分经制备型hplc甲醇-三氟乙酸水系统得到含陈皮多酚-a，陈皮多酚-b，陈皮多酚-c的天然多酚类化合物。
15.一种缓解口腔溃疡的组合物的制备方法，其包括：制备活性多糖、天然提取物及天然化合物；将制备好的活性多糖、天然提取物及天然化合物按质量百分比为1.1～2：0.03～3：0.003～0.3的配方比进行混合混匀，加去离子水调成固含量为3-30％的浆状液体，将浆状液体经过冻干制成组合物粉末。
16.一种缓解口腔溃疡的组合物的应用，其将缓解口腔溃疡的组合物负载于载体上制作成负载组合物，所述缓解口腔溃疡的组合物与负载组合物的质量百分数为3％-80％，所述载体包括溶剂、聚合物、脂质体、稀释剂和/或赋形剂中的至少一种，添加辅料基质，所述辅料基质选自单糖、寡糖、多糖、氨基酸、防腐剂、ph调节剂、抗炎助剂中的至少一种，获得片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂的食品、保健品或药品，作为舒缓、抗炎效果的应用。
17.有益效果：
18.本发明通过筛选、分析，选用活性多糖、天然提取物及天然化合物为原料制备组合物，能够抑制苯酚诱导的人永生化口腔上皮细胞(hioec)活力降低，抑制炎性细胞因子分泌，减少口腔溃疡面积，减轻局部病理变化，减轻口腔溃疡水肿程度，同时还可用于防治龋齿、牙周炎治疗。
附图说明
19.20.图1为本发明陈皮多酚-a的hr-esi-ms图
21.图2为本发明陈皮多酚-a的1h nmr图
22.图3为本发明陈皮多酚-a的
13
c nmr图
23.图4为本发明陈皮多酚-a的dept-135图
24.图5为本发明陈皮多酚-a的1h-1
h cosy图
25.图6为本发明陈皮多酚-a的hmbc图
26.图7为本发明陈皮多酚-b的hr-esi-ms图
27.图8为本发明陈皮多酚-b的1h nmr图
28.图9为本发明陈皮多酚-b的
13
c nmr图
29.图10为本发明陈皮多酚-b的dept-135图
30.图11为本发明陈皮多酚-b的1h-1
h cosy图
31.图12为本发明陈皮多酚-b的hmbc图一
32.图13为本发明陈皮多酚-b的hmbc图二
33.图14为本发明陈皮多酚-c的hr-esi-ms图
34.图15为本发明陈皮多酚-c的1h nmr图
35.图16为本发明陈皮多酚-c的
13
c nmr图
36.图17为本发明陈皮多酚-c的dept-135图
37.图18为本发明对苯酚诱导的人永生化口腔上皮细胞活力及细胞内ros含量影响；
38.图19为本发明对苯酚诱导的人永生化口腔上皮细胞炎性因子分泌影响；
39.图20为本发明对苯酚诱导的人永生化口腔上皮细胞nf-κb,nlrp3炎症小体相关蛋白表达影响。
具体实施方式
40.以下提供具体实施例以实现本发明所述的技术方案，但不限于这些实施例。应理解，这些具体实施方式及附图仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
41.除非另有定义，否则在公开本发明时使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。借助于进一步引导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。
42.实施例1
43.本实施例的缓解口腔溃疡的组合物包括活性多糖、天然提取物及天然多酚类化合物，活性多糖包括分子量为3-5kda的枸杞活性多糖与分子量为1-3kda 的沙棘活性多糖。天然提取物包括薄荷乙醇提取物冻干物、百香果乙醇提取物冻干物、水蜜桃乙醇提取物冻干物。天然多酚类化合物从陈皮中分离提取，包括结构式为的陈皮多酚-a，
结构式为的陈皮多酚-b，结构式为的陈皮多酚-c。枸杞活性多糖、沙棘活性多糖、薄荷30％乙醇提取物冻干物、百香果10％乙醇提取物冻干物、水蜜桃50％乙醇提取物冻干物、、陈皮多酚-a、陈皮多酚-b、陈皮多酚-c的质量比为1：1：0.1：0.1：0.1： 0.01：0.01：0.01。
44.本实施例将上述的缓解口腔溃疡的组合物负载于载体上制作成负载组合物，缓解口腔溃疡的组合物与负载组合物的质量百分数为20％-25％，载体包括溶剂、聚合物、脂质体、稀释剂和/或赋形剂中的至少一种。其中所述溶剂包括但不限于水、生理盐水，以及其他非水性溶剂；所述聚合物可以但不限于为聚乙烯亚胺及其改性物、壳聚糖、聚乳酸、明胶等；所述脂质体可以但不限于为胆固醇、豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂等。所述稀释剂选自淀粉类、糖类、纤维素类、无机盐中的一种或多种。所述赋形剂包括片剂中的黏合剂、填充剂、润滑剂，半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分，液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、着色剂中的至少一种。添加辅料基质，所述辅料基质选自单糖、寡糖、多糖、氨基酸、防腐剂、ph调节剂、抗炎助剂中的至少一种，获得片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂的食品、保健品或药品，作为舒缓、抗炎效果的应用。
45.本发明的制备方法如下：
46.(1)枸杞活性多糖的分离制备方法
47.取枸杞多糖100g并加入1000g的纯水溶解，枸杞多糖水溶液用孔径为5kd 的透析袋透析，收集透析液，冻干获得分子量为3-5kda的枸杞活性多糖。基于构建的苯酚诱导的人永生化口腔上皮细胞氧化损伤、炎性损伤模型评价枸杞多糖透析液冻干物的活性。实验结果显示，分子量为3-5kda的枸杞活性多糖保护活性最佳。
48.(2)沙棘活性多糖的分离制备方法
49.取沙棘多糖100g并加入500g的纯水溶解，沙棘多糖水溶液用孔径为3kd 的透析袋透析，收集透析液，冻干获得分子量为1-3kda的沙棘活性多糖。基于构建的苯酚诱导的人永生化口腔上皮细胞氧化损伤、炎性损伤模型评价沙棘多糖透析液冻干物的活性。实验结果显示，分子量为1-3kda的沙棘多糖保护活性最佳。
50.(3)天然多酚类化合物的分离方法
51.取陈皮1kg，粉碎，加水3l，超声提取30分钟，6000g离心20分钟，取上清液，减压浓缩，得到浸膏102g。将浸膏加适量水混悬，用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部位46g以及水部位。基于构建的苯酚诱导的人永生化口腔上皮细胞氧化损伤、炎性损伤模型，筛选不同萃取物的保护活性。将具有最佳保护活性的水部位采用200-300目的硅胶柱层析分离，以乙酸乙酯-甲醇系统按100:10
ꢀ→
1:100的梯度洗脱，获得7个馏分(fr.1-7)。基于构建的苯酚诱导的人永生化口腔上皮细胞氧化损伤、炎性损伤模型，筛选不同馏分的保护活性。
52.将具有最佳保护活性的乙酸乙酯-甲醇按20:80的洗脱组分经制备型hplc 甲醇-三氟乙酸水系统得到含量最多的组分，并最终鉴定为陈皮多酚-a，陈皮多酚-b，陈皮多酚-c。
53.陈皮多酚-a：
54.黄色油状物，薄层层析后，香草醛-浓硫酸加热反应显蓝色。如图1所示， hr-esi-ms显示准分子离子峰m/z 373.1985[m+na]
+
(c
20h30
o5na,理论计算值: 373.1985)，确定分子式为c
20h30
o5，不饱和度为7。
[0055]
如图2所示，1h nmr(400mhz,cdcl3)谱中共显示30个质子信号。其中δ
h 13.59(1h,s),9.54(1h,s)为两个苯环上的羟基氢信号；δ
h 5.21(1h,t,j＝8.0 hz)为1个烯烃质子信号；δ
h 4.92(1h,dd,j＝12.0,4.0hz)为1个连氧次甲基氢信号；此外，高场区还可见7个甲基质子信号[δ
h 3.73(3h,s),3.39 (3h,s),2.68(3h,s),1.77(3h,s),1.70(3h,s),0.96(3h,d,j＝5.4 hz),0.95(3h,d,j＝5.4hz)]，其中δ
h 3.73(3h,s),3.39(3h,s),2.68(3h,s)为 3个连氧甲基氢信号。
[0056]
如图3所示，
13
c nmr(100mhz,cd3od)谱中共出现20个碳信号，如图4 所示，结合dept-135谱可知其分别为8个季碳、3个次甲基、2个亚甲基和7 个甲基。低场区可见δ
c 203.7的酮羰基信号；δ
c 131.6,123.4为1对双键信号；δ
c 162.2,161.3,160.8,114.9,108.9,108.5为苯环的碳信号，推测化合物陈皮多酚-a可能是酰基间苯三酚类。
[0057]
如图5所示，在1h-1
h cosy谱中，h-3
″
(δ
h 1.83)与h-4
″
(δ
h 0.95),h-5
″
(δ
h 0.96),h-2
″
(δ
h 1.43)有相关，可以推测存在结构片段c-4
″
/5
″‑
c-3
″‑
c-2
″
； h-1
″
(δ
h 4.92)与h-2
″
(δ
h 1.43)有相关，可以推测存在结构片段c-1
″‑
c-2
″
，因此可确定苯环一侧取代基的结构。
[0058]
如图6所示，在hmbc谱中，可观察到h-1
″
(δ
h 4.92)与c-4
′
(δ
c 162.2), c-5
′
(δ
c 108.9)有相关，证明该结构片段连接在c-5
′
位。
[0059]
综合以上数据，证实了苯环上的取代基团的结构，从而推断出该化合物结构。结合表1所示，1d和2d nmr谱信息，对陈皮多酚-a进行了全归属。
[0060]
表1 陈皮多酚-a 1d and 2d nmr数据(cdcl3,δppm)
[0061][0062]
综合以上的结构解析，鉴定化合物结构，命名为陈皮多酚-a。
[0063]
陈皮多酚-b：
[0064]
黄色油状物，薄层层析后，香草醛-浓硫酸加热反应显红色。如图7所示， hr-esi-ms显示准分子离子峰m/z 335.1862[m+h]
+
(c
19h27
o5,理论计算值: 335.1853)，确定分子式为c
19h26
o5，不饱和度为7。
[0065]
如图8所示，1h nmr(400mhz,cdcl3)谱中共显示26个质子信号。其中δ
h 13.74(1h,s),8.64(1h,s)为两个苯环上的羟基氢信号；δ
h 5.22(1h,t,j＝6.6 hz),3.34(2h,d,j＝6.6hz),1.79(3h,s),1.72(3h,s)提示分子中含有1个3
‑ꢀ
甲基-2-丁烯基团。此外高场区可见δ
h 3.82(2h,s)的1个连氧亚甲基氢信号；δ
h 2.84(1h,m)为1个连氧次甲基氢信号；δ
h 3.73(3h,s),2.68(3h,s),1.17(6h,d,j＝6.9hz)提示该化合物还有4个甲基质子信号，其中δ
h 3.73,2.68为2个连氧甲基信号。
[0066]
如图9所示，
13
c nmr(100mhz,cdcl3)谱中共出现19个碳信号，如图10 所示，结合dept-135谱可知其分别为9个季碳、2个次甲基、2个亚甲基和6 个甲基。低场区可见δ
c 217.8,203.8的2个酮羰基信号；δ
c 133.4,122.8 为1对双键信号；δ
c 162.4,161.5,160.6,
114.8,109.2,105.5可推测为苯环的碳信号。根据以上数据，推测化合物可能是酰基间苯三酚类化合物。
[0067]
如图11所示，在1h-1
h cosy谱中，h-3
″′
(δ
h 2.84)与h-4
″′
(δ
h 1.17), h-5
″′
(δ
h 1.17)有相关，可以推测该化合物中存在异丙基片段。
[0068]
如图12、图13所示，在hmbc谱，可见h-1
″′
(δ
h 3.82)和h-4
″′
/5
″′
(δ
h 1.17)皆与c-2
″′
(δ
c 217.8),c-3
″′
(δ
c 41.7)有相关，可证实此结构中存在一个3-甲基-2-丁酮片段。同时可观察到h-1
″′
(δ
h 3.82)与c-2
′
(δ
c 161.5),c-3
′
(δ
c 105.3),c-4
′
(δ
c 162.4)有相关，因此证明3-甲基-2-丁酮片段在苯环上的连接位置是c-3
′
位。
[0069]
综合以上数据，证实了苯环上的取代基团的结构，从而推断出该化合物结构。结合表2 1d和2d nmr谱信息，进行全归属。
[0070]
表2 陈皮多酚-b 1d and 2d nmr数据(cdcl3,δppm)
[0071][0072][0073]
综合以上的结构解析，鉴定化合物的结构，命名为陈皮多酚-b。
[0074]
陈皮多酚-c：
[0075]
白色粉末，薄层层析后浓硫酸-香草醛反应显红色。图14所示，hr-esi-ms 显示准分子离子峰m/z 251.1281[m+h]
+
(c
14h19
o4,理论计算值:251.1278)，确定其分子式为c
14h18
o4，分子量为250，不饱和度是6。
[0076]
图15所示，1h nmr(400mhz,cdcl3)图谱中共显示17个质子信号。其中δ
h 13.15(1h,s)为苯环上的羟基氢信号；δ
h 6.22(1h,s),5.21(1h,t,j＝6.6hz) 为2个不饱和质子信号；
δ
h 3.35(2h,d,j＝6.7hz)提示有1个连氧亚甲基氢信号；δ
h 3.73(3h,s),2.68(3h,s)为2个连氧甲基氢信号，δ
h 1.82(3h,s),1.76(3h,s)为2个甲基质子信号。
[0077]
图16所示，
13
c nmr(100mhz,cdcl3)谱中共出现14个碳信号，图17所示，结合dept-135谱可知其分别为7个季碳、2个次甲基、1个亚甲基和4个甲基。低场区可见1个酮羰基信号(δ
c 203.7)；1对双键信号(δ
c 135.4,122.0)； 1个苯环的碳信号(δ
c 164.3,162.6,161.5,113.0,109.8,100.8)。根据表3的碳谱数据，推测化合物可能是酰基间苯三酚类化合物。
[0078]
表3 陈皮多酚-c 1d and 2d nmr数据(cdcl3,δppm)
[0079][0080][0081]
最终，确定化合物结构式，命名为陈皮多酚-c。
[0082]
(4)薄荷乙醇提取物冻干物的分离方法
[0083]
取新鲜薄荷100g并加入1000ml的体积分数为30％的乙醇，超声提取20分钟，收集提取液，冻干获得薄荷乙醇提取物冻干物。基于构建的苯酚诱导的人永生化口腔上皮细胞氧化损伤、炎性损伤模型评价不同提取液冻干物的保护活性。实验结果显示，新鲜薄荷30％乙醇提取物冻干物保护活性最佳。
[0084]
(5)百香果乙醇提取物冻干物的分离方法
[0085]
取百香果100g并加入1000ml体积分数为10％的乙醇，超声提取20分钟，收集提取液，冻干获得百香果乙醇提取物冻干物。基于构建的苯酚诱导的人永生化口腔上皮细胞氧化损伤、炎性损伤模型评价不同提取液冻干物的保护活性。实验结果显示，百香果10％乙醇提取物冻干物保护活性最佳。
[0086]
(6)水蜜桃乙醇提取物冻干物的分离方法
[0087]
取新鲜水蜜桃100g并加入1000ml的体积分数为50％的乙醇，超声提取20 分钟，收集提取液，冻干水蜜糖50％乙醇提取物冻干物。基于构建的苯酚诱导的人永生化口腔上皮
细胞氧化损伤、炎性损伤模型评价不同提取液冻干物的保护活性。实验结果显示，水蜜糖50％乙醇提取物冻干物保护活性最佳。
[0088]
(7)本发明组合物的制备方法
[0089]
活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物具体配方如下:
[0090]
配方:分子量为3-5kda的枸杞多糖1g与分子量为1-3kda的沙棘多糖1g、新鲜薄荷30％乙醇提取物冻干物0.1g，百香果10％乙醇提取物冻干物0.1g，水蜜糖50％乙醇提取物冻干物0.1g、陈皮多酚-a 0.01g，陈皮多酚-b 0.01g，陈皮多酚-c 0.01g。
[0091]
按照实施例1-6步骤进行活性多糖、天然提取物及天然化合物的制备、筛选，将制备好的活性多糖、天然提取物及天然化合物按照上述配方比进行混合混匀，加去离子水调成固含量为3-30％的浆状液体，经过冻干制成组合物粉末。
[0092]
本发明抑制苯酚暴露诱导的人永生化口腔上皮细胞损伤实验
[0093]
人永生化口腔上皮细胞(hioec)复苏后于dk-sfm培养液37℃、5％co2培养。细胞长至50％-70％汇合时，10nm苯酚刺激细胞12h，dk-sfm洗涤3次，含 10μg/ml活性多糖(分子量为3-5kda的枸杞多糖与分子量为1-3kda的沙棘多糖质量比为1:1)或天然提取物(新鲜薄荷30％乙醇提取物冻干物与百香果10％乙醇提取物冻干物、水蜜糖50％乙醇提取物冻干物质量比为1:1:1)或天然化合物(陈皮多酚-a与陈皮多酚-b，陈皮多酚-c质量比为1:1:1)或本发明活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物的dk-sfm培养液继续培养24h。
[0094]
①
cck8方法检测细胞活力变化；
[0095]
②
elisa方法检测细胞内ros及相关炎性细胞因子(tnf-α、no、pge2及 il-1β、il-6、il-8)的变化；
[0096]
从图18a中可以看出，苯酚暴露使hioec细胞活力显著降低，而活性多糖、天然提取物及天然化合物作用后，细胞活力有一定的提高。其中，活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物组细胞活力显著高于苯酚组。此外，活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物组细胞活力高于活性多糖组、天然提取物组及天然化合物组，我们推测活性多糖、天然提取物及天然化合物可能发挥了协同保护作用。
[0097]
hioec细胞按实验设计处理后，收集细胞；参考elisa试剂盒操作说明书检测ros的分泌量。结果如图18b所示，与空白对照组相比，苯酚暴露使hioec 细胞内ros含量(细胞活性氧含量)显著增加，而活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物组苯酚暴露诱发的ros明显降低。类似的，活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物组细胞内ros含量低于活性多糖组、天然提取物组及天然化合物组，进一步的的说明活性多糖、天然提取物及天然化合物可能是通过协同作用发挥保护活性的。
[0098]
hioec细胞按实验设计处理后，收集细胞培养液；参考elisa试剂盒操作说明书检测il-6、il-8、il-1β、no、pge2、tnf-α的分泌量。结果如图19a及图19b所示，苯酚暴露使hioec细胞il-6、il-8、il-1β、no、pge2、tnf-α分泌显著增加，我们推测苯酚暴露诱发hioec细胞严重的炎症反应。而活性多糖、天然提取物及天然化合物使苯酚暴露诱导的hioec细胞il-6、il-8、il-1 β、no、pge2、tnf-α分泌降低。其中，活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物可显著降低苯酚暴露诱发的hioec细胞炎性细胞因子il-6、il-1β、tnf
‑ꢀ
α分泌，活性强于活性多糖、天然提取物及天然化合物单独作用。
[0099]
hioec细胞按实验设计处理后，收集细胞；提取细胞蛋白，基于western blotting
检测nf-κb、nlrp3炎症小体信号通路相关蛋白表达变化。结果如图 20所示，苯酚暴露显著激活hioec细胞nf-κb、nlrp3炎症小体信号通路。而活性多糖、天然提取物及天然化合物抑制了苯酚暴露诱导的hioec细胞nf-κb、 nlrp3炎症小体信号通路激活。其中，活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物对nf-κb、nlrp3炎症小体信号通路的抑制作用强于活性多糖、天然提取物及天然化合物单独作用。
[0100]
本发明组合物外用缓解口腔溃疡实验
[0101]
除空白对照组外，模型组和治疗组大鼠用3％的戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉后，将1块预制好的直径5mm、厚约1mm的滤纸片，蘸取90％苯酚溶液(完全浸透)，然后将滤纸片置于大鼠左侧颊黏膜上烧灼60s；24h后观察烧灼区，可以看到大鼠口腔黏膜上出现直径约4-5mm的白色损害，口腔溃疡模型制作成功。
[0102]
给药方法：模型组和各治疗组分别用消毒棉签黏取相应药物(模型组吸附 0.5ml的0.9％氯化钠溶液)，涂布于大鼠口腔溃疡处3min。每天给予治疗药物2次，连续治疗5天。空白对照组不做任何处理。于给予治疗药物后的第1 天、第3天和第5天(给予治疗药物后3h)。
[0103]
摄下大鼠口腔溃疡情况，采用医学图像分析软件(osi-ris4.19通用)进行溃疡面积计算，按照评判标准进行大鼠口腔溃疡程度评价。
[0104]
于最后1次评分结束后，将对照组和治疗组采用脊髓脱臼的方法将大鼠处死，取下局部口腔溃疡，放入10％甲醛固定，之后行石蜡包埋、切片，光镜观察治疗组和对照组大鼠口腔溃疡组织形态变化(空白组取相对应的口腔溃疡局部组织)。
[0105]
口腔溃疡程度评价标准：0，表示口腔黏膜处于正常状态，无溃疡；ⅰ，表示有溃疡，但溃疡表面无明显的假膜；ⅱ，表示口腔溃疡表面有一层薄的黄白色假膜，但周围无水肿表现；ⅲ，表示口腔溃疡表面出现较厚的假膜，并且周围伴有明显炎性水肿表现；ⅳ，表示口腔溃疡表面出现厚的假膜，溃疡周围伴有明显的炎性水肿。
[0106]
病理标准：
“‑”
表示口腔黏膜上皮完整，表面被覆完整的鳞状上皮，黏膜下层为疏松的结缔组织，毛囊腺体下面为肌组织；“+”表示口腔黏膜溃疡缩小 2/3，余1/3的溃疡面积被新生的肉芽组织所取代；“++”表示口腔黏膜溃疡缩小1/2，余1/2的溃疡面被新生的肉芽组织所取代；“+++”表示口腔黏膜溃疡缩小1/3或未缩小，余2/3的溃疡面被新生肉芽组织所取代。
[0107]
①
、活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物对大鼠口腔溃疡面积的影响：本实验中空白对照组没有溃疡。与空白对照组比较，在第1-5天，模型组形成溃疡显著(p＜0.05)，说明口腔溃疡造模成功。而与模型组比较，在第1天，各治疗组大鼠口腔溃疡面积，差异无统计学意义(p＞0.05)；在第3-5天，活性多糖、天然提取物及天然化合物组均可见大鼠口腔溃疡面积显著减小(p＜ 0.05)，见表4。
[0108]
表4 活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物对大鼠口腔溃疡面积的影响
[0109][0110]
(mm2,mean
±
sd)
[0111]
②
、活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物对大鼠口腔溃疡程度的影响：本实验中空白对照组没有溃疡。与空白对照组比较，在造模成功后第1-5 天内，模型组溃疡边缘红色充血、发红、中心有灰白色溃烂、溃烂面直径较正常组差异有统计学意义(p＜0.05)，说明口腔溃疡造模成功。
[0112]
与模型组比较，在造模成功后第1天，各药物治疗组溃疡程度差异无统计学意义(p＞0.05)；在第3天，活性多糖、天然提取物及天然化合物治疗组口腔溃疡程度显著减轻(p＜0.05)；在第5天，活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物治疗组口腔溃疡程度显著减轻(p＜0.05)，见表5。
[0113]
表5 活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物对大鼠口腔溃疡程度的影响
[0114][0115]
(3)活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物对大鼠口腔溃疡组织病理变化的影响：各组大鼠局部口腔黏膜组织病理观察结果，本实验中空白对照组大鼠没有溃疡，黏膜组织结构正常；模型组大鼠口腔黏膜溃疡缩小1/4或未缩小，其余1/2溃疡面被新生的肉芽组织所取代；活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物治疗组大鼠口腔黏膜溃疡缩小2/3，其余1/3溃疡面积被新生的肉芽组织所取代，见表6。
[0116]
表6 活性多糖、天然提取物及天然化合物组合物对大鼠口腔溃疡组织病理变化的影响
[0117][0118]
实施例2
[0119]
本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例天然提取物包括薄荷提取物冻干
物、百香果提取物冻干物、水蜜桃提取物冻干物。薄荷提取物冻干物、百香果提取物冻干物、水蜜桃提取物冻干物分别取新鲜水蜜桃、百香果、水蜜桃 100g并加入800ml的纯水超声提取。
[0120]
实施例3
[0121]
本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例包括活性多糖、天然提取物及天然多酚类化合物，活性多糖包括枸杞活性多糖，天然提取物包括薄荷提取物冻干物。天然多酚类化合物包括从陈皮中分离提取的陈皮多酚-a，陈皮多酚
ꢀ‑
b，陈皮多酚-c。所述的枸杞活性多糖、薄荷提取物冻干物和陈皮多酚-a，陈皮多酚-b，陈皮多酚-c的质量百分比为2：3：0.1：0.1：0.1。
[0122]
本实施例将上述的缓解口腔溃疡的组合物负载于载体上制作成负载组合物，缓解口腔溃疡的组合物与负载组合物的质量百分数为3％-80％。
[0123]
进一步地，所述天然提取物的制备过程中:枸杞多糖或沙棘多糖水溶液可以用孔径为15kd，10kd，5kd，3kd，1kd的透析袋透析，收集透析液，冻干获得分子量分别为10-15kd，5-10kd，3-5kd，1-3kd，以及低于1kd的枸杞活性多糖或沙棘活性多糖。
[0124]
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。