一种提高免疫力的益生菌组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种提高免疫力的益生菌组合物及其制备方法。


背景技术：

2.免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)。处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。正常机体在免疫系统的作用下，突变的细胞会被抑制和分解。但对于免疫力低下的人群来说，由于免疫活性细胞不能识别突变细胞，致使突变细胞无序繁殖，最终导致疾病产生。特别是儿童，由于其生理结构和功能发育的不完善，更容易受到环境病原体及家长为了“预防感染”而给孩子使用抗生素所带来的不良影响，需要借助外来的免疫制剂来提高对某些疾病的抵抗能力。因此，提高身体免疫力，预防生物性因子或变态反应感染，找到副作用少的较安全的微生态食品，已成为当今迫切解决的一个话题。
3.益生菌是利用葡萄糖等碳水化合物时能产生乳酸的一类细菌。益生菌有一个共同特征，就是在有氧和无氧条件下都能生长，即它们多是兼性厌氧菌。益生菌与人类关系十分密切，其是人体肠道中最重要的有益菌群，对人体的营养、免疫、保健，甚至抗衰老、长寿都有重要作用。人体肠道内益生菌的比例越高，微生态环境就越好，肠道就越显年轻有活力。目前已被发现并使用的益生菌主要有以下3类：
①
乳杆菌类，如乳酸菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌等。
②
双歧杆菌类，如长双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌等。
③
其他菌属，如嗜热链球菌、乳酸片球菌、酵母菌类等。以上这3大类益生菌均来源于人体或动物体，其中当前被人们使用最多的主要是乳杆菌和双歧杆菌这些能产生乳酸的肠道菌，如嗜酸乳杆菌、罗氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌等。
4.中国发明专利申请cn107752040a公开了一种促进婴幼儿机体免疫力的复合益生菌粉制剂，筛选出5种益生菌婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌v9、保加利亚乳杆菌pzlb5、植物乳杆菌pp12和嗜热链球菌qh，并分别对其培养基和培养条件进行优化，利用菌种之间的独特协同作用，实现增强免疫细胞活性，提高婴幼儿免疫力的目的。但是该专利使用的上述5种菌种分离筛选过程复杂，生产成本高，给消费者带来极大的经济负担。
5.中国发明专利申请cn105641209a公开了一种提高免疫力的益生菌组合物，其包括益生菌干粉、黄芪提取物粉、枸杞提取物粉，并辅以维生素k，维生素b12、吡哆醇、生物素、叶酸、烟酸和硫胺素等营养成分，利用传统中药与益生菌合理配伍用药，协同发挥作用，显著提高免疫力，促进机体健康。但是中药中成分复杂，不免存在一些成分会导致益生菌失活而降低疗效。
6.中国发明专利cn103478530b公开了一种低聚糖益生菌组合物及其应用以及利用该组合物制备胶囊剂的方法，该文献主要采用低聚糖粉、羟丙级甲基纤维素组成，中国发明专利cn104983746b公开了一种复合益生菌及制备方法，主要采用益生元、膳食纤维、氨基酸以及维生素b来作为填充剂，但都存在容易失活的缺陷。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提出一种提高免疫力的益生菌组合物及其制备方法，含有丰富的益生菌组分以及其他营养因子，包括黄芪甲苷、山药多糖、党参、连翘水提取物和黄豆，以及它们的发酵产物，制得的组合物具有良好的调节菌群的效果，促进人体益生菌的生长繁殖，能刺激体内免疫调节，提高机体免疫力，调节血糖、血脂、血压，预防粥样动脉硬化及糖尿病等，减少炎症和感染，促进人体健康。
8.本发明的技术方案是这样实现的：
9.本发明提供一种提高免疫力的益生菌组合物的制备方法，将枯草芽孢杆菌接种到熟黄豆发酵后，与党参和连翘的水提取物、黄芪甲苷、山药多糖一同加入培养基中，进一步接种凝结芽孢杆菌tq33和富硒酵母，发酵培养，依次加入维生素、氨基酸后，进一步发酵培养，得到提高免疫力的益生菌组合物。
10.作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
11.s1.菌种的活化：将凝结芽孢杆菌tq33、枯草芽孢杆菌和富硒酵母分别接种到高氏培养基中，微氧条件下培养成菌种种子液；
12.s2.黄豆的处理：将黄豆洗净、煮熟后，粉碎，得到熟黄豆粉；
13.s3.黄豆的初步发酵处理：将步骤s1中活化的枯草芽孢杆菌菌种种子液接种到步骤s2中得到的熟黄豆粉中，微氧条件下，发酵培养，得到初步发酵处理的黄豆；
14.s4.中药的提取：将党参、连翘分别洗净后，干燥，粉碎，加入水中微波沸腾提取，过滤，滤液浓缩干燥，得到中药水提取物；
15.s5.液体培养基的制备：将黄芪甲苷、山药多糖、碳源、氮源和无机盐用无菌水溶解，混合均匀后，用pbs溶液调节培养基ph值，灭菌备用；
16.s6.发酵：将步骤s3中得到的初步发酵处理的黄豆、步骤s4制得的中药水提取物加入步骤s5中制得的液体培养基中，接种步骤s1中活化的凝结芽孢杆菌tq33和富硒酵母菌种种子液，微氧条件下，发酵培养，得到发酵产物；
17.s7.促发酵：将维生素加入步骤s6中的发酵产物中，微氧条件下，发酵培养第一时间段后，加入氨基酸，微氧条件下，发酵培养第二时间段，得到提高免疫力的益生菌组合物。
18.作为本发明的进一步改进，所述微氧条件为氧含量为5-10％，二氧化碳含量为3-7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
19.作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述菌种种子液的含菌量为10
7-109cfu/ml；步骤s3中所述枯草芽孢杆菌的接种量为5-10％；所述发酵培养温度为35-39℃，时间为12-24h；步骤s4中所述党参、连翘的质量比为(5-10)：2；所述微波沸腾提取次数为2-3次，微波功率为1000-1500w，每次提取时间为1-2h。
20.作为本发明的进一步改进，步骤s5中所述黄芪甲苷、山药多糖、碳源、氮源、无机盐和无菌水的质量比为(1-2)：(3-5)：(15-25)：(7-15)：(1-3)：1000；所述碳源选自糖蜜、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉中的至少一种；所述氮源选自氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、鱼粉中的至少一种；所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁、氯化亚铁、硫酸亚铁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的至少一种；所述pbs溶液调节培养基ph值至6.8-7.2。
21.作为本发明的进一步改进，步骤s6中所述初步发酵处理的黄豆、中药水提取物、液
体培养基的质量比为(5-12)：(2-5)：20；所述凝结芽孢杆菌tq33的接种量为2-5％；所述富硒酵母的接种量为4-7％；所述发酵培养条件为35-38℃，培养24-36h；步骤s7中所述发酵培养条件为35-38℃，所述第一时间段为8-12h，所述第二时间段为24-48h。
22.作为本发明的进一步改进，所述维生素选自维生素c、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素b12、维生素a、维生素k、维生素d、维生素e中的至少一种。
23.优选地，为维生素b6和维生素b12的复配混合物，质量比为(3-5)：2。
24.作为本发明的进一步改进，所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯氨酸、牛磺酸中的至少一种。
25.优选地，为牛磺酸和甲硫氨酸的复配混合物，质量比为2：(2-3)。
26.作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
27.s1.菌种的活化：将凝结芽孢杆菌tq33、枯草芽孢杆菌和富硒酵母分别接种到高氏培养基中，微氧条件下培养成菌种种子液，含菌量为10
7-109cfu/ml；
28.s2.黄豆的处理：将黄豆洗净、煮熟后，粉碎，得到熟黄豆粉；
29.s3.黄豆的初步发酵处理：将步骤s1中活化的枯草芽孢杆菌菌种种子液接种到步骤s2中得到的熟黄豆粉中，枯草芽孢杆菌的接种量为5-10％，微氧条件下，35-39℃发酵培养12-24h，得到初步发酵处理的黄豆；
30.s4.中药的提取：将5-10重量份党参、2重量份连翘分别洗净后，干燥，粉碎，加入50重量份水中，1000-1500w微波沸腾提取2-3次，每次提取时间为1-2h，过滤，滤液浓缩干燥，得到中药水提取物；
31.s5.液体培养基的制备：将1-2重量份黄芪甲苷、3-5重量份山药多糖、15-25重量份碳源、7-15重量份氮源、1-3重量份无机盐用1000重量份无菌水溶解，混合均匀后，用pbs溶液调节培养基ph值至6.8-7.2，紫外线灭菌备用；
32.s6.发酵：将5-12重量份步骤s3中得到的初步发酵处理的黄豆、2-5重量份步骤s4制得的中药水提取物加入20重量份步骤s5中制得的液体培养基中，接种步骤s1中活化的凝结芽孢杆菌tq33和富硒酵母菌种种子液，凝结芽孢杆菌tq33的接种量为2-5％；富硒酵母的接种量为4-7％，微氧条件下，35-38℃发酵培养24-36h，得到发酵产物；
33.s7.促发酵：将0.5-1重量份维生素加入步骤s6中的100重量份发酵产物中，微氧条件下，35-38℃发酵培养8-12h，再加入1-2重量份氨基酸，微氧条件下，35-38℃发酵培养24-48h，得到提高免疫力的益生菌组合物；
34.以上，微氧条件为氧含量为5-10％，二氧化碳含量为3-7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
35.本发明进一步保护一种如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的提高免疫力的益生菌组合物。
36.本发明具有如下有益效果：本发明中凝结芽孢杆菌tq33既能像乳酸菌和双歧杆菌具有益生作用，又具有芽孢菌的抗逆性强、耐高温高压和易贮藏等优点，能够改善肠道菌群结构、调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体免疫水平、促进营养物质代谢和利用等功效，凝结芽胞杆菌tq33具有很好的耐酸耐碱性能，在模拟胃液中处理12h仍能存活率达到75％以上，在模拟肠液中处理12h，存活率达到85％，从而，该益生菌能在体内有很大的存活率，同时，凝结芽孢杆菌tq33的发酵上清液及细胞壁成分可通过调节细胞因子、抑制
活性氧和增强细胞吞噬作用来提高肠道免疫能力，另外凝结芽孢杆菌能促进消化道粘膜发生免疫反应，从而，起到主要的免疫调节作用。同时，该凝结芽胞杆菌tq33不会像其他芽孢杆菌一样产生肠毒素，也不含有肠毒素基因，没有明显的细胞毒性，且不会产生诱变效应，具有极好的安全性，可以放心的加入食品中使用。
37.枯草芽孢杆菌可以分泌大量且多种消化酶(主要为淀粉酶)，促进人体对食品中中营养物质的消化吸收；分泌维生素及氨基酸等多种营养物质供人体吸收和利用，促进生长和发育；抑制体内有害菌的生长发育，从而预防各种疾病，提高免疫力；迅速消耗消化道内环境中的游离氧，形成厌氧环境，促进有益厌氧菌生长。
38.硒是人体必需的微量元素之一，对维持人体健康具有重要的作用，同时，硒在预防心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗癌、免疫功能调节等方面具有重要的作用。本发明添加的富硒酵母菌的主要代谢产物包括富硒生物质、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸、二甲基硒、二甲基二硒以及单质硒等，甚至还包括一些含硒多糖、含硒磷脂和含硒核酸等大分子化合物，为人体提供丰富的有机硒来源，促进人体微量元素平衡，起到很好的抗癌、免疫提高的效果。同时，富硒酵母也是一种有益菌，也能通过调节肠道有益菌群的作用，起到很好的促进免疫力提升的效果。
39.本发明凝结芽孢杆菌tq33、枯草芽孢杆菌和富硒酵母之间通过协同增效，共同作用，在进入体内并在体内正常生长繁殖后，对肠道有害菌有明显的拮抗作用，可以抑制有害菌的生长繁殖，阻止病原菌的感染，避免许多疾病的发生，同时，其代谢产生的细菌素、肽聚糖和蛋白质等均可以活化机体内部免疫细胞，激发机体产生免疫抗体，提高机体免疫力。还可以通过调节机体非特异性和特异性免疫反应，增强机体免疫力。
40.同时，这三种益生菌相互作用，通过自身代谢产生的产物有机酸类，如凝结芽胞杆菌tq33能分解小分子糖类生成l-1乳酸，能降低肠道环境的ph值，促进肠道对微量元素的吸收，提高人体对外界摄入的微量元素的利用率，枯草芽孢杆菌还能合成b族维生素等多种维生素，这些维生素和微量元素能很好的促进人体免疫力的提高，如锌不仅可以促进免疫力，还可以改善食欲，改善贫血等，富硒酵母菌产生的有机硒能够增强巨噬细胞、t淋巴细胞和自然杀伤细胞的活性，从而促进免疫系统的功能，铁是血红蛋白、细胞色素酶及氧化酶体系的重要组成成分，参与机体免疫功能的调节等效果，铜参与多种酶的组成、活化及生物转化，促进白细胞的吞噬作用，提到免疫调节的效果，维生素b1能够以辅酶的形式参与糖分代谢，维生素b12能够参与制作骨髓红细胞等，从而改善免疫功能。
41.本发明通过将枯草芽孢杆菌接种到熟大豆上发酵后，大量产生抗癌物质大豆异黄酮，以及调节血脂物质纳豆激酶等，抑制癌细胞的增殖、有效破坏或杀死癌细胞，还可以通过刺激免疫系统诱发产生干扰素，还能提高机体巨噬细胞的活性，并加强吞噬细胞的吞噬能力，增强机体免疫力。
42.本发明中药水提取物中党参、连翘水提取物促进小鼠肠道对甘氨酸的吸收和利用，增加肠道屏障通透性，使得血液循环中的甘氨酸增加，进而促进肺组织中发挥抗炎、抗氧化作用的谷胱甘肽合成，提高机体抗肺/肝等炎症、抗病毒感染的能力；
43.本发明添加的黄芪甲苷能调节肠道中免疫细胞th1/th2的失衡，减少嗜酸性粒细胞浸润，增加肠黏膜siga的分泌，siga是肠黏膜上的主要免疫球蛋白，从而减少肠道炎症反应，提高机体免疫力；山药多糖是一种很好的益生元，促进肠道中益生菌属的生长，抑制病
原菌的定植，两者协同作用下，能选择性的促进本发明添加的凝结芽孢杆菌tq33、枯草芽孢杆菌和富硒酵母以及双歧杆菌和乳酸杆菌的繁殖，调节次级代谢产物，恢复肠道屏障功能，干预动脉粥样硬化及冠心病，改善肠道微生态环境，发挥降压作用，增强机体的氧化能力，有效改善血脂状况。
44.本发明制得的提高免疫力的益生菌组合物含有丰富的益生菌组分以及其他营养因子，包括黄芪甲苷、山药多糖、党参、连翘水提取物和黄豆，以及它们的发酵产物，制得的组合物具有良好的调节菌群的效果，促进人体益生菌的生长繁殖，能刺激体内免疫调节，提高机体免疫力，调节血糖、血脂、血压，预防粥样动脉硬化及糖尿病等，减少炎症和感染，促进人体健康。
具体实施方式
45.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.凝结芽孢杆菌tq33由天津轻工业学院应用微生物教研室提供。枯草芽孢杆菌由艾柏森(北京)生物科技有限公司提供。富硒酵母由安琪酵母股份有限公司提供。黄芪甲苷，纯度在98％以上，由广州宏程生物科技有限公司提供。山药多糖，纯度在90％以上，由四川省维克奇生物科技有限公司提供。
47.下述实施例中，微氧条件为氧含量为7％，二氧化碳含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
48.实施例1
49.本实施例提供一种提高免疫力的益生菌组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
50.s1.菌种的活化：将凝结芽孢杆菌tq33、枯草芽孢杆菌和富硒酵母分别接种到高氏培养基中，微氧条件下，35℃培养16h，培养成菌种种子液，含菌量为107cfu/ml；
51.s2.黄豆的处理：将黄豆洗净，100℃蒸煮15min后，粉碎，得到熟黄豆粉；
52.s3.黄豆的初步发酵处理：将步骤s1中活化的枯草芽孢杆菌菌种种子液接种到步骤s2中得到的熟黄豆粉中，枯草芽孢杆菌的接种量为5％，微氧条件下，35℃发酵培养12h，得到初步发酵处理的黄豆；
53.s4.中药的提取：将5重量份党参、2重量份连翘分别洗净后，干燥，粉碎，加入50重量份水中，1000w微波沸腾提取2次，每次提取时间为1h，过滤，滤液浓缩干燥，得到中药水提取物；
54.s5.液体培养基的制备：将1重量份黄芪甲苷、3重量份山药多糖、10重量份葡萄糖、5重量份麦芽糖、7重量份尿素、0.5重量份氯化钾、0.3重量份氯化钙、0.2重量份氯化镁用1000重量份无菌水溶解，混合均匀后，用pbs溶液调节培养基ph值至6.8，紫外线灭菌备用；
55.s6.发酵：将5重量份步骤s3中得到的初步发酵处理的黄豆、2重量份步骤s4制得的中药水提取物加入20重量份步骤s5中制得的液体培养基中，接种步骤s1中活化的凝结芽孢杆菌tq33和富硒酵母菌种种子液，凝结芽孢杆菌tq33的接种量为2％；富硒酵母的接种量为4％，微氧条件下，35℃发酵培养24h，得到发酵产物；
56.s7.促发酵：将0.5重量份维生素加入步骤s6中的100重量份发酵产物中，微氧条件下，35℃发酵培养8h，再加入1重量份氨基酸，微氧条件下，35℃发酵培养24h，得到提高免疫力的益生菌组合物。
57.所述维生素为维生素b6和维生素b12的复配混合物，质量比为3：2；所述氨基酸为牛磺酸和甲硫氨酸的复配混合物，质量比为2：2。
58.实施例2
59.本实施例提供一种提高免疫力的益生菌组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
60.s1.菌种的活化：将凝结芽孢杆菌tq33、枯草芽孢杆菌和富硒酵母分别接种到高氏培养基中，微氧条件下，38℃培养24h，培养成菌种种子液，含菌量为109cfu/ml；
61.s2.黄豆的处理：将黄豆洗净，100℃蒸煮15min后，粉碎，得到熟黄豆粉；
62.s3.黄豆的初步发酵处理：将步骤s1中活化的枯草芽孢杆菌菌种种子液接种到步骤s2中得到的熟黄豆粉中，枯草芽孢杆菌的接种量为10％，微氧条件下，39℃发酵培养24h，得到初步发酵处理的黄豆；
63.s4.中药的提取：将10重量份党参、2重量份连翘分别洗净后，干燥，粉碎，加入50重量份水中，1500w微波沸腾提取3次，每次提取时间为2h，过滤，滤液浓缩干燥，得到中药水提取物；
64.s5.液体培养基的制备：将2重量份黄芪甲苷、5重量份山药多糖、15重量份乳糖、5重量份蔗糖、5重量份果糖、5重量份尿素、10重量份硝酸铵、2重量份氯化钠、0.2重量份硫酸铜、0.3重量份硫酸锰、0.2重量份氯化锌、0.3重量份氯化铁用1000重量份无菌水溶解，混合均匀后，用pbs溶液调节培养基ph值至7.2，紫外线灭菌备用；
65.s6.发酵：将12重量份步骤s3中得到的初步发酵处理的黄豆、5重量份步骤s4制得的中药水提取物加入20重量份步骤s5中制得的液体培养基中，接种步骤s1中活化的凝结芽孢杆菌tq33和富硒酵母菌种种子液，凝结芽孢杆菌tq33的接种量为5％；富硒酵母的接种量为7％，微氧条件下，38℃发酵培养36h，得到发酵产物；
66.s7.促发酵：将1重量份维生素加入步骤s6中的100重量份发酵产物中，微氧条件下，38℃发酵培养12h，再加入2重量份氨基酸，微氧条件下，38℃发酵培养48h，得到提高免疫力的益生菌组合物。
67.所述维生素为维生素b6和维生素b12的复配混合物，质量比为5：2；所述氨基酸为牛磺酸和甲硫氨酸的复配混合物，质量比为2：3。
68.实施例3
69.本实施例提供一种提高免疫力的益生菌组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
70.s1.菌种的活化：将凝结芽孢杆菌tq33、枯草芽孢杆菌和富硒酵母分别接种到高氏培养基中，微氧条件下，37℃培养20h，培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/ml；
71.s2.黄豆的处理：将黄豆洗净，100℃蒸煮15min后，粉碎，得到熟黄豆粉；
72.s3.黄豆的初步发酵处理：将步骤s1中活化的枯草芽孢杆菌菌种种子液接种到步骤s2中得到的熟黄豆粉中，枯草芽孢杆菌的接种量为7％，微氧条件下，37℃发酵培养18h，得到初步发酵处理的黄豆；
73.s4.中药的提取：将7重量份党参、2重量份连翘分别洗净后，干燥，粉碎，加入50重量份水中，1200w微波沸腾提取3次，每次提取时间为1.5h，过滤，滤液浓缩干燥，得到中药水
提取物；
74.s5.液体培养基的制备：将1.5重量份黄芪甲苷、4重量份山药多糖、15重量份葡萄糖、5重量份果糖、2重量份尿素、8重量份硝酸铵、2重量份鱼粉、1重量份氯化钠、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜、0.2重量份硫酸锰、0.2重量份硫酸镁用1000重量份无菌水溶解，混合均匀后，用pbs溶液调节培养基ph值至7，紫外线灭菌备用；
75.s6.发酵：将7重量份步骤s3中得到的初步发酵处理的黄豆、3.5重量份步骤s4制得的中药水提取物加入20重量份步骤s5中制得的液体培养基中，接种步骤s1中活化的凝结芽孢杆菌tq33和富硒酵母菌种种子液，凝结芽孢杆菌tq33的接种量为3.5％；富硒酵母的接种量为5％，微氧条件下，37℃发酵培养30h，得到发酵产物；
76.s7.促发酵：将0.7重量份维生素加入步骤s6中的100重量份发酵产物中，微氧条件下，37℃发酵培养10h，再加入1.5重量份氨基酸，微氧条件下，37℃发酵培养36，得到提高免疫力的益生菌组合物。
77.所述维生素为维生素b6和维生素b12的复配混合物，质量比为4：2；所述氨基酸为牛磺酸和甲硫氨酸的复配混合物，质量比为2：2.5。
78.实施例4
79.与实施例3相比，维生素为单一的维生素b6，其他条件均不改变。
80.实施例5
81.与实施例3相比，维生素为单一的维生素b12，其他条件均不改变。
82.实施例6
83.与实施例3相比，氨基酸为单一的牛磺酸，其他条件均不改变。
84.实施例7
85.与实施例3相比，氨基酸为单一的甲硫氨酸，其他条件均不改变。
86.对比例1
87.与实施例3相比，未进行步骤s7，其他条件均不改变。
88.对比例2
89.与实施例3相比，步骤s3中未添加凝结芽孢杆菌tq33，即未进行步骤s3，其他条件均不改变。
90.对比例3
91.与实施例3相比，步骤s6中未添加枯草芽孢杆菌，其他条件均不改变。
92.具体的，s6.发酵：将7重量份步骤s3中得到的初步发酵处理的黄豆、3.5重量份步骤s4制得的中药水提取物加入20重量份步骤s5中制得的液体培养基中，接种步骤s1中活化的富硒酵母菌种种子液，富硒酵母的接种量为8.5％，微氧条件下，37℃发酵培养30h，得到发酵产物。
93.对比例4
94.与实施例3相比，步骤s6中未添加富硒酵母，其他条件均不改变。
95.具体的，s6.发酵：将7重量份步骤s3中得到的初步发酵处理的黄豆、3.5重量份步骤s4制得的中药水提取物加入20重量份步骤s5中制得的液体培养基中，接种步骤s1中活化的凝结芽孢杆菌tq33菌种种子液，凝结芽孢杆菌tq33的接种量为8.5％；微氧条件下，37℃发酵培养30h，得到发酵产物。
96.对比例5
97.与实施例3相比，步骤s5中未添加黄芪甲苷，其他条件均不改变。
98.具体的，s5.液体培养基的制备：将5.5重量份山药多糖、15重量份葡萄糖、5重量份果糖、2重量份尿素、8重量份硝酸铵、2重量份鱼粉、1重量份氯化钠、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜、0.2重量份硫酸锰、0.2重量份硫酸镁用1000重量份无菌水溶解，混合均匀后，用pbs溶液调节培养基ph值至7，紫外线灭菌备用。
99.对比例6
100.与实施例3相比，步骤s5中未添加山药多糖，其他条件均不改变。
101.具体的，s5.液体培养基的制备：将5.5重量份黄芪甲苷、15重量份葡萄糖、5重量份果糖、2重量份尿素、8重量份硝酸铵、2重量份鱼粉、1重量份氯化钠、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜、0.2重量份硫酸锰、0.2重量份硫酸镁用1000重量份无菌水溶解，混合均匀后，用pbs溶液调节培养基ph值至7，紫外线灭菌备用。
102.对比例7
103.与实施例3相比，步骤s6中未添加中药水提取物，其他条件均不改变。
104.具体的，s6.发酵：将7重量份步骤s3中得到的初步发酵处理的黄豆加入20重量份步骤s5中制得的液体培养基中，接种步骤s1中活化的凝结芽孢杆菌tq33和富硒酵母菌种种子液，凝结芽孢杆菌tq33的接种量为3.5％；富硒酵母的接种量为5％，微氧条件下，37℃发酵培养30h，得到发酵产物。
105.测试例1
106.将本发明实施例1-7和对比例1-7制得的提高免疫力的益生菌组合物置于温度为38
±
2℃下，相对湿度为70
±
5％的恒温恒湿箱中12周，每周取样检测活菌数，结果见表1。
107.活菌数检测方法参照gb 4789.35-2016。
108.表1各组活菌数(单位：cfu/g)
109.组别0周4周8周12周实施例16.72
×
10
10
6.45
×
10
10
6.12
×
10
10
5.77
×
10
10
实施例27.24
×
10
10
7.02
×
10
10
6.75
×
10
10
6.32
×
10
10
实施例38.25
×
10
10
7.97
×
10
10
7.46
×
10
10
7.15
×
10
10
实施例45.65
×
1098.25
×
1082.41
×
1087.65
×
107实施例56.23
×
1099.42
×
1083.17
×
1088.17
×
107实施例61.45
×
10
10
7.84
×
1092.14
×
1098.73
×
108实施例72.11
×
10
10
8.02
×
1092.56
×
1098.91
×
108对比例11.24
×
1093.51
×
1088.22
×
1071.24
×
107对比例24.72
×
1099.17
×
1084.25
×
1081.21
×
108对比例35.17
×
1090.11
×
1097.63
×
1083.21
×
108对比例44.82
×
1099.54
×
1085.67
×
1082.17
×
108对比例53.66
×
10
10
7.58
×
1092.15
×
1097.98
×
108对比例62.67
×
10
10
6.82
×
1091.57
×
1096.79
×
108对比例75.62
×
10
10
2.17
×
10
10
9.27
×
1095.22
×
109110.益生菌类产品中益生菌的活菌数直接影响到产品功效的发挥，一般来说益生菌活
菌数越多，衰减越慢，其功效也越明显。由上表可知，本发明实施例1-3制得的提高免疫力的益生菌组合物的活菌数含量最高，且具有良好的耐受性，长时间能保持较高的活菌数。
111.测试例2
112.测试本发明实施例1-7和对比例1-7制得的提高免疫力的益生菌组合物中粗多糖、硒和异黄酮含量，结果见表2。
113.粗多糖含量检测方法苯酚-硫酸法,标准曲线按gb/t 15672-2009中葡萄糖标准曲线绘制。
114.硒含量检测方法参照db34/t 2578-2015。
115.异黄酮含量检测方法参照gb/t23788-2009。
116.表2
[0117][0118][0119]
粗多糖对于人体的抗炎效果有很大影响，硒元素也是人体必须的微量元素之一，参与免疫条件，异黄酮也是一种高效的抗癌物质。由上表可知，本发明实施例1-3制得的提高免疫力的益生菌组合物含有丰富的多糖以及有机硒，异黄酮含量丰富。
[0120]
测试例3对小鼠nk细胞活性的影响
[0121]
分组和给药：将体重在20
±
2g的昆明种小鼠随机分为15组，分别为空白组、实施例1-7组和对比例1-7组。空白组灌胃给予生理盐水10ml/kg，实施例1-7组和对比例1-7组给予本发明相应组制得的提高免疫力的益生菌组合物10g/kg，每日一次，连续15天。
[0122]
鸡红细胞混悬液的制备：将鸡血用生理盐水洗涤3次，3000r/min离心10min，去上清液，用生理盐水配制成体积分数为20％的鸡红细胞混悬液。
[0123]
1、吞噬功能的测定
[0124]
将各组小鼠分别腹腔注射上述鸡红细胞混悬液，1ml/只，30min后，颈椎脱臼处死
小鼠，剪开腹部，经腹腔注射2ml生理盐水，转动10次后，然后吸出腹腔洗液1ml，滴于载玻片上，干燥，染色，油镜下计数巨噬细胞，每只鼠计数100个。计算吞噬百分数：
[0125]
吞噬百分数＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞/计数的巨噬细胞
×
100％
[0126]
结果见表3。
[0127]
组别吞噬百分数(％)空白组24.25
±
1.24实施例174.52
±
7.23
*
实施例275.71
±
8.21
*
实施例376.57
±
7.89
*
实施例456.73
±
5.67实施例555.25
±
6.13实施例658.38
±
6.24实施例752.26
±
5.36对比例149.25
±
5.74对比例259.23
±
6.43对比例362.14
±
5.26对比例461.25
±
6.14对比例563.55
±
5.37对比例664.15
±
5.82对比例767.25
±
6.72
[0128]
注释：*为与空白组相比，具有显著性差异(p《0.05)。
[0129]
2、对小鼠nk细胞活性的影响
[0130]
无菌取小鼠脾脏，置于无菌hanks液中，撕碎脾脏，得到单细胞悬液，过滤，洗涤，10000r/min离心10min，然后将细胞浮于培养液中，调整细胞浓度为106个/ml，得到效应细胞。将靶细胞(yac-l细胞)进行传代培养，用培养液调整细胞浓度为105个/ml，得到靶细胞。
[0131]
ldh混合液的配制：用ph＝8.2的tris-hcl溶液配制含有0.05mol/l乳酸锂0.05mol/l、0.00066mol/l硝基氯化四氮唑、0.00028mol/l吩嗪二甲酯硫酸盐、0.0013mol/l氧化型辅酶i的混合溶液，得到ldh混合液。
[0132]
nk细胞活性检测：
[0133]
反应组：将靶细胞和效应细胞按照靶效比1:50加入96孔培养板中，其中靶细胞和效应细胞各100μl；
[0134]
靶细胞自然释放组：将加靶细胞和培养液各100μl加入96孔培养板中；
[0135]
靶细胞最大释放孔组：将靶细胞和1％np40裂解液各100μl加入96孔培养板中。
[0136]
将上述各组均设有5个平行，于37℃，7％co2培养箱中培养4h，然后离心，每孔吸取上清液100μl，加入ldh混合液反应5min，然后加入2mol/lhcl溶液10μl，用酶标仪测定490nm吸光度，计算nk细胞活性：
[0137]
nk细胞活性(％)＝(反应孔的吸光度-自然释放孔吸光度)/(最大释放孔吸光度-自然释放孔吸光度)
×
100％
[0138]
结果见表4。
[0139]
组别nk细胞活性(％)空白组14.52
±
3.10实施例164.53
±
6.73
*
实施例265.75
±
7.23
*
实施例366.64
±
7.52
*
实施例442.52
±
5.26实施例543.15
±
4.98实施例648.67
±
6.11实施例740.27
±
5.27对比例137.52
±
4.67对比例254.25
±
4.91对比例350.27
±
5.15对比例452.45
±
5.32对比例557.24
±
4.98对比例656.98
±
5.37对比例760.21
±
4.76
[0140]
注释：*为与空白组相比，具有显著性差异(p《0.05)。
[0141]
由上表可知，本发明实施例1-3制得的提高免疫力的益生菌组合物能明显提高吞噬百分数，提高nk细胞活性，起到很好的提高免疫力的效果。
[0142]
实施例4、5与实施例3相比，维生素为单一的维生素b6或维生素b12，其活菌数下降，且活菌的衰减加快，及代谢产物含量下降。维生素的加入能够促进益生菌的增殖，且能延长对数期，提高活性菌的抗逆性，从而降低活菌的衰减。维生素b6和b12的添加还具有协同增效的作用。
[0143]
实施例6、7与实施例3相比，氨基酸为单一的甲硫氨酸或牛磺酸，其活菌数下降，及代谢产物含量下降，实施例7中吞噬百分数和nk细胞活性下降。氨基酸的添加为益生菌提供了丰度的氮源，增加其活性，产生更多的有益代谢产物，且牛磺酸作为一种人体所需的活性氨基酸，也能明显提高机体的免疫能力，两者的添加具有协同增效的作用。
[0144]
对比例1与实施例3相比，未进行步骤s7，其活菌数下降，且活菌的衰减加快，及代谢产物含量下降，吞噬百分数和nk细胞活性下降。可见，步骤s7的促发酵步骤能明显提高本发明组合物的综合效果。
[0145]
对比例2、3、4与实施例3相比，未添加凝结芽孢杆菌tq33、枯草芽孢杆菌、富硒酵母，其活菌数下降，及代谢产物含量下降，吞噬百分数和nk细胞活性明显下降。这三种益生菌相互作用，通过自身代谢产生的产物有机酸类，如凝结芽胞杆菌tq33能分解小分子糖类生成l-1乳酸，能降低肠道环境的ph值，促进肠道对微量元素的吸收，提高人体对外界摄入的微量元素的利用率，枯草芽孢杆菌还能合成b族维生素等多种维生素，这些维生素和微量元素能很好的促进人体免疫力的提高，如锌不仅可以促进免疫力，还可以改善食欲，改善贫血等，富硒酵母菌产生的有机硒能够增强巨噬细胞、t淋巴细胞和自然杀伤细胞的活性，从而促进免疫系统的功能，铁是血红蛋白、细胞色素酶及氧化酶体系的重要组成成分，参与机体免疫功能的调节等效果，铜参与多种酶的组成、活化及生物转化，促进白细胞的吞噬作
用，提到免疫调节的效果，维生素b1能够以辅酶的形式参与糖分代谢，维生素b12能够参与制作骨髓红细胞等，从而改善免疫功能。
[0146]
对比例5、6与实施例3相比，步骤s5中未添加黄芪甲苷或山药多糖，其活菌数下降，粗多糖含量下降，吞噬百分数和nk细胞活性下降。本发明添加的黄芪甲苷能调节肠道中免疫细胞th1/th2的失衡，减少嗜酸性粒细胞浸润，增加肠黏膜siga的分泌，siga是肠黏膜上的主要免疫球蛋白，从而减少肠道炎症反应，提高机体免疫力；山药多糖是一种很好的益生元，促进肠道中益生菌属的生长，抑制病原菌的定植，两者协同作用下，能选择性的促进本发明添加的凝结芽孢杆菌tq33、枯草芽孢杆菌和富硒酵母以及双歧杆菌和乳酸杆菌的繁殖，调节次级代谢产物，恢复肠道屏障功能，干预动脉粥样硬化及冠心病，改善肠道微生态环境，发挥降压作用，增强机体的氧化能力，有效改善血脂状况。
[0147]
对比例7与实施例3相比，步骤s6中未添加中药水提取物，其吞噬百分数和nk细胞活性下降。本发明中药水提取物中党参、连翘水提取物促进小鼠肠道对甘氨酸的吸收和利用，增加肠道屏障通透性，使得血液循环中的甘氨酸增加，进而促进肺组织中发挥抗炎、抗氧化作用的谷胱甘肽合成，提高机体的免疫能力，两者的添加具有协同增效的作用。
[0148]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。