葫芦素B及其衍生物在制备抗肿瘤耐药的药物中的应用的制作方法

葫芦素b及其衍生物在制备抗肿瘤耐药的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及葫芦素b及其衍生物在制备抗肿瘤耐药的药物中的应用。


背景技术：

2.卵巢癌的生物学习性与其他妇科恶性肿瘤不同，早期临床症状不明显，大多数患者就诊时已出现大量腹水、盆腔肿物，临床分期往往在iii-iv期，无法得到满意的治疗效果。由于卵巢癌发病隐匿，往往局限于腹腔，超过2/3的患者在诊断时已属晚期。手术联合化疗提高了晚期卵巢癌患者的近期疗效，但仍有70%
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80%的复发率。根据《2021 nccn卵巢癌包括输卵管癌及原发性腹膜癌临床实践指南（第1版）》，对于ii-iv期卵巢癌患者，采用卡铂、顺铂或紫杉醇联用的化疗或新辅助化疗方案为主。
3.目前国内常用的铂类抗肿瘤药物共有五种（顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂）。顺铂作为第一代铂类抗肿瘤药物，缺乏对肿瘤组织的选择性，副作用严重。第二代铂类药物中的卡铂，虽然化学稳定性好，水溶性是顺铂的17倍，但是与顺铂具有相同的载体基团，对顺铂产生耐药性的患者，再用卡铂时效果也不佳。另一个第二代铂类药物奈达铂，肾毒性较顺铂和卡铂低。第三代铂类药物中的奥沙利铂，虽然避开了顺铂的某些耐药机制（如错配修复缺陷和旁路复制机制），但并未完全解决铂类耐药的问题。第三代铂类药物中的洛铂，其作用机制除影响 dna 的合成、复制以外，还可以影响原肿瘤基因 c-myc的表达，亦没有改善铂类耐药的问题。因此寻找克服对铂类耐药肿瘤的小分子化合物，显得尤为重要。
4.卵巢癌对顺铂耐药性的发生与ⅰ类磷脂酰肌醇-3-激酶(pi3k)/蛋白激酶b(akt)/雷帕霉素靶体蛋白(mtor)通路的异常激活及其相关基因突变有关，且在乳腺癌各个亚型中该通路的变化不同。由磷脂酰肌醇 3-激酶（pi3ks）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（akt，也称为 pkb）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mtor）组成的 pi3k-akt-mtor 通路作为细胞内非常重要的信号转导途径，在细胞的生长、存活、增殖、凋亡、血管生成、自噬等过程中发挥着极其重要的生物学功能，该通路的紊乱会引起一系列的疾病，包括癌症、神经病变、自身免疫性疾病和血液淋巴系统疾病。该通路过度表达和活化是肿瘤发生的经典通路。由于磷脂酰肌醇-3-激酶(pi3k)/蛋白激酶b(akt)信号通路由于在细胞生长、增殖、迁移和凋亡解除中的作用，一直是乳腺癌研究热点。也有研究发现，pi3k抑制剂在体内诱导的抗肿瘤作用并不一定是癌细胞内在机制的结果，因为这些药物也被证明会影响肿瘤微环境，在胚胎发育和肿瘤发生过程中，血管生成都高度依赖于pi3k信号传导。特异性针对 p110
ɑ
的抑制剂已被证明会损害功能血管生成，这也可能导致肿瘤收缩。总体来说，目前经该通路靶向抑制剂治疗已成为研究热点。
5.研究发现，pi3k依赖性信号通路在肿瘤发生和发展中起关键作用 。pi3k根据其编码基因，结构特点和底物特异性可分为ⅰ、ⅱ、ⅲ三种类型。其中ⅰ型又可分为ⅰa型（pi3kα、pi3kβ和pi3kδ）和ⅰb型（pi3kγ）。ⅰa型pi3k是异源二聚体酶，包含一个催化亚基p110和一个调节亚基p85。目前研究的激酶抑制剂主要是与催化亚基p110的atp结合位点作用，通过与
atp竞争性结合其结合位点阻断信号传导。p110催化亚基可具体分为pi3kα、pi3kβ、pi3kγ和pi3kδ四种亚型。其中用于肿瘤治疗的主要是pi3kα抑制剂和pi3kδ。一般来说，激酶的atp结构域都类似，因此对于pi3k的四种蛋白结构，药物的抑制活性都类似，很难区分。
6.虽然pik3ca是癌症中最常见的致癌基因之一，而且一些研究已经证明了它作为pi3k抑制的生物标志物的有效性，但对认为这一途径是一个合适和令人满意癌症治疗的靶点仍然存在怀疑。这可能有很多原因。首先，pik3ca突变并不一定会转化为预后不良或侵袭性表型，如肺癌中的其他癌基因，如egfr。其次，pi3k途径与正常细胞稳态的相关性可以限制pi3k抑制剂的治疗。靶向pi3k的可占性少，治疗窗狭也是主要障碍，因为正常细胞也需要pi3k信号以存活，因此，在充分抑制肿瘤细胞中的靶标之前，严重的不利影响常用于靶向。即使在对这种信号级联的增殖和生存而高度相关的肿瘤中，一定剂量的抑制剂毒性也会导致短时间和不完整的靶点参与。第三，对该途径的抑制剂通常会导致分子反馈环的快速和组织依赖性的激活，从而限制了这些药物的长期有效性。然而，这也可以是一个机会来设计基于基本原理的组合策略和新的药物发现方法，以提高pi3k抑制剂的有效性和安全性。
7.自 2004 年首次发现实体恶性肿瘤中 pi3k 途径发生突变以来，有400种 pi3k 靶向抑制剂进入临床试验，然而它们并没有像其他靶向药物一样，产生令人振奋的治疗效果。仅有三种 pi3k 抑制剂（阿培利司、艾代拉利司、库潘尼西）和两种 mtor 抑制剂（依维莫司、西罗莫司）被 fda 批准进入临床。广泛应用的pi3k抑制剂如copanlisib属于pan-pi3k抑制剂，会与四种亚型同时作用，所以需要的药用剂量较高，这样会导致患者不耐受，而且还会容易脱靶。这些缺点的存在使得开发高选择性的pi3k抑制剂迫在眉睫。为什么大多pi3k 靶向抑制剂无法进入临床呢，目前普通认为，pi3k/akt/mtor 信号在体内广泛性表达，导致大多化合物治疗窗狭窄，细胞毒性大，阻碍其临床应用。同时，肿瘤本身可以重新激活药物靶点或者药物靶点发生突变，诱导交叉信号通路，导致药物耐药。因此，亟需采用新的策略抑制肿瘤耐药的发生。
8.葫芦素（cucurbitacin）是一类从葫芦科植物中分离提取的四环三萜类化合物，其母核结构为四环三萜，具有高度氧化性。据报道，葫芦科家族（包括葫芦科、苦瓜属、黄瓜属等）中至少有 100 种葫芦素存在。已知的葫芦素及其衍生物主要有40种，按化学结构分为葫芦素 a、b、c、d、e、i、h、q、r 和二氢葫芦素 b 等 12类。其中，葫芦素b是葫芦素家族中含量最丰富的成员之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、保肝、免疫调节等药理作用。且相关研究发现，葫芦素b对多种恶性肿瘤具有显著的抗肿瘤作用，其作用机制涉及多个肿瘤表型和信号通路；另外，葫芦素b还可改善肿瘤治疗的耐药现象，与多种抗肿瘤药物联合应用可发挥协同增效的作用。葫芦素b对多种恶性肿瘤具有广谱的抗肿瘤作用，其作用机制主要是通过调控 jak/stat3、mark、pi3k/akt、notch、wnt、cip2a/pp2a、integrinher2、hippo-yap、vegf/fak/mmp-9 等信号通路，发挥抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭、抗血管生成、破坏细胞骨架、改变表观遗传、诱导自噬、诱导细胞衰老等作用。此外，葫芦素b的抗肿瘤作用往往涉及多个肿瘤表型，是一种多靶点、多途径的抗肿瘤药物，其对信号通路的效应具有肿瘤差异。


技术实现要素：

9.本发明的目的是提供葫芦素b或其衍生物、或其立体异构体、差向异构体、构型异
构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物，在制备抗肿瘤耐药的药物中的应用。
10.本发明发现，葫芦素b（结构见图1）抑制卵巢癌顺铂耐药细胞株增殖，对c13*和a2780ddp细胞的ic50值分别是：64.28
±
14.54nm和29.20
±
2.26nm；促进c13*细胞凋亡，抑制c13*细胞侵袭和迁移；抑制c13*和a2780ddp细胞中的pi3k/akt信号通路。
11.因此，本发明提供了葫芦素b或其衍生物、或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物，在制备抗肿瘤耐药的药物中的应用。
12.优选，是在制备卵巢癌顺铂耐药的药物中的应用。
13.进一步优选，是在抑制卵巢癌顺铂耐药细胞株增殖、侵袭和迁移或pi3k/akt信号通路的药物中的应用。
14.所述的卵巢癌顺铂耐药细胞株是人卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*。
15.所述的卵巢癌顺铂耐药细胞株是人卵巢癌顺铂耐药细胞株a2780ddp。
16.肿瘤是威胁人类健康的疾病之一。目前治疗肿瘤的手段有化疗、放疗、手术治疗、免疫疗法等。虽然肿瘤的治疗方法不断更新，但是化疗仍然是肿瘤治疗中最常见的手段。但是在化合物肿瘤靶向治疗的过程中，会产生许多药物副作用。并且随着治疗时间的延长，肿瘤往往会对化合物产生耐药。因此需要开发新的化合物来抑制肿瘤耐药性的产生。pi3k/akt/mtor通路是细胞增殖、周期、凋亡等生理活动的重要调节通路，该信号通路过度激活在癌症进展和癌症耐药性中起着重要作用。研究发现，pi3k/akt/mtor通路异常激活是诱导肿瘤对化疗耐药的重要原因。本发明发现，葫芦素b可抑制pi3k/akt/mtor信号通路，明显抑制肿瘤耐药细胞增殖、促进细胞凋亡。葫芦素b具有较好的开发前景。
附图说明
17.图1是葫芦素b的结构式；图2是葫芦素b抑制卵巢癌耐药细胞增殖；图3是葫芦素b促进c13*细胞凋亡；图4是葫芦素b抑制c13*细胞迁移和侵袭；图5是葫芦素b抑制卵巢癌耐药细胞p13k、akt、p-akt表达；图6是葫芦素b抑制卵巢癌耐药细胞p13k/akt信号通路；图7是葫芦素b通过p13k/akt信号通路，促进a2780ddp和c13*细胞凋亡。
具体实施方式
18.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制实施例11、葫芦素b抑制人卵巢癌顺铂耐药细胞株增殖。
19.我们将葫芦素b（购自陶素生物，其结构式如图1所示）用二甲基亚砜（dmso，购自sigma-aldrich公司）配成的100mm的原液，细胞实验使用之前用pbs稀释所需浓度。
20.将处于对数生长期的人卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*和a2780ddp细胞以1000-2000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，24小时后更换为含有不同浓度（8000nm、2000nm、500nm、125nm、31.25nm、7.8125nm、0nm）葫芦素b的完全培养基处理细胞72小时，用cck-8法（日本同仁化学研究所），检测细胞增殖情况，检测方法参见《医学免疫学实验技术》（苏州大学出版
社，出版日期：2011年2月）。我们发现，葫芦素b抑制人抑制卵巢癌顺铂耐药细胞株增殖，对c13*和a2780ddp细胞的ic50值分别是：64.28
±
14.54nm和29.20
±
2.26nm（图2）2、葫芦素b促进人卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*细胞凋亡。
21.将处于对数生长期的人卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*（购自中国非典型物收藏中心），葫芦素b（0μm、0.04μm、0.2μm、1μm、5μm）与人卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*细胞共孵育48小时，用pbs洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）。收集5
×
105个细胞：加入500
µ
l的结合缓冲液悬浮细胞；加入500
µ
l annexin v-fitc混匀后，加入5
µ
l propidium iodide，混匀；室温、避光、反应10分钟；用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，激发波长ex=488 nm；发射波长em=530mn。annexin v-fitc的绿色荧光通过fitc通道(fl1)检测；pi红色荧光通过pi通道(fl3)检测。加入2
µ
g/ml的pi与培养基共浴1h后，用倒置荧光显微镜观察细胞膜损伤之后pi的吸收能力。用甲醇和丙酮（1:1）处理细胞5min，用pbs清洗3次，pi染色，流式细胞仪检测细胞周期情况。 我们用葫芦素b（0μm、0.04μm、0.2μm、1μm、5μm）处理人卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*细胞48小时，发现，葫芦素b能通过pi3k/akt通路，促进卵巢癌耐药细胞凋亡（图3，图7）3、葫芦素b抑制c13*迁移和侵袭（图4）。
22.a、细胞侵袭实验（1）按体积比将基质胶：基础培养基=1：4稀释基质胶，将稀释好的基质胶以45μl/孔的量均匀铺于-20℃上预冷的上室中；（2）将铺好的小室装在24孔transwell板中，37℃培养箱内凝固1-2h；（3）下室加入600μl 10%完全培养基，把小室卡在下室上，使小室底部完全浸没在下室的培养基中，注意小室底部的膜与下室培养基接触的部分不能有气泡；（4）葫芦素b（0μm、0.04μm、0.2μm、1μm、5μm）与人卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*细胞共孵育48小时进行药物处理后，经胰酶消化，1000rpm离心5min，去除上清液，用无血清的培养基重悬；（5）进行细胞计数，按照20万个/孔的细胞数量，将细胞悬液均匀滴加入上室中，上室每孔体积为200 μl；（6）37℃培养，24-48h后，去除上室培养基，小室浸泡在加有足量甲醇的24孔transwell板中固定2h；（7）pbs与棉签去除上室残余基质胶和细胞；（8）结晶紫染色30min；（9）pbs洗去残余结晶紫，晾干后显微镜拍照后计算侵袭面积。
23.b、细胞迁移实验（1）将铺好的小室装在24孔transwell板中，37℃培养箱内凝固1-2h；（2）下室加入600μl 10%完全培养基，把小室卡在下室上，使小室底部完全浸没在下室的培养基中，注意小室底部的膜与下室培养基接触的部分不能有气泡；（3）葫芦素b（0μm、0.04μm、0.2μm、1μm、5μm）与人卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*细胞共孵育48小时进行药物处理后，经胰酶消化，1000rpm离心5min，去除上清液，用无血清的培养基重悬；（4）进行细胞计数，按照20万个/孔的细胞数量，将细胞悬液均匀滴加入上室中，上室每孔体积为200 μl；
（5）37℃培养，24-48h后，去除上室培养基，小室浸泡在加有足量甲醇的24孔transwell板中固定2h；（6）pbs与棉签去除上室残余基质胶和细胞；（7）结晶紫染色30min；（8）pbs洗去残余结晶紫，晾干后显微镜拍照后计算侵袭面积。
24.我们用葫芦素b（0μm、0.04μm、0.2μm、1μm、5μm）处理人卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*细胞48小时，发现，葫芦素b能抑制卵巢癌耐药细胞侵袭和迁移（图4）4、葫芦素b抑制人卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*细胞和a2780ddp细胞中pi3k/akt信号通路。
25.4.1细胞样本的处理：取处于对数生长期的卵巢癌顺铂耐药细胞株（购自中国非典型物收藏中心），葫芦素b（0μm、0.25μm、0.5μm、1μm、2μm）处理后，将原培养基移入15ml离心管中待用。用pbs轻轻洗涤2次，每孔加入1ml预热的胰酶，37℃孵育4-5min后，使细胞完全脱落，使用原培养基1ml终止消化，吹打均匀，转移回15ml离心管。装有细胞样品的15ml离心管于1000rpm，离心5min，去除上层培养基，用pbs洗涤细胞沉淀2次（1000rpm，离心5min），样品去除pbs后备用或置于-80℃保存。
26.4.2 ripa裂解法：整个裂解过程在冰上操作，防止蛋白裂解。将ripa和pmsf（蛋白酶抑制剂），按100:1的比例配好，充分混匀。按细胞沉淀的量加入适当体积的裂解液，吹打混匀，置于冰中裂解30min，使细胞完全裂解，然后于4℃、16000 rcf，离心15min。取上清蛋白至新的离心管中，置于-80℃保存。
27.4.3 蛋白样品的定量（bca法）：采用novagen公司的bca法进行蛋白浓度的测定，方法如下：1）以浓度分别为0mg/ml、0.0625 mg/ml、0.125 mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml的标准蛋白制作标准曲线；2）取2
µ
l蛋白样品加入18
µ
l的生理盐水，每孔样品体积20
µ
l，设置一个复孔；3）以a液：b液=200:1的体积均匀混合，在标准蛋白和待测样品中每孔加入200
µ
l bca混合液，将96孔板置于37℃培养箱中孵育30min；4）酶标仪检测蛋白浓度5）在540nm波长下检测每孔蛋白的吸光度，以标准蛋白的浓度为x轴，吸光度为y轴制作标准曲线，将样品蛋白的吸光度的平均值计代入标准曲线计算蛋白浓度，计算出的数值乘以10，得出原样品蛋白的浓度。
28.4.4 制胶：根据mica、gapdh的分子量，选用12%及8%sds-page分离胶和5%sds-page浓缩胶。使用1.5cm的玻璃板，配方如下：
4.5 电泳：将配制好的电泳液倒入电泳槽中，用10
µ
l 微量移液枪上样，将预冷好的蛋白样品和maker缓慢加入加样孔中。上样后，浓缩胶电压为80v，待溴酚蓝电泳至分离胶时，改为110v，维持电压至溴酚蓝移至分离胶底部时，停止电泳，取出胶板。
29.4.6 转膜：根据彩虹蛋白预染maker指示条带，将目的蛋白对应分子量的胶保留下来，完全浸泡于转膜液中，以防干燥。取将与胶大小一致的醋酸纤维膜pvdf膜放于甲醛中浸泡10s活化，然后放置于转膜液中。由负极到正极放置顺序：海绵垫，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵垫，放置过程中保持胶和膜的湿润，用玻璃棒赶出胶与膜之间的气泡。将做好的夹板放入装有转膜液的电泳槽中，加入适当冰袋，4℃250ma恒流条件下转膜60min。
30.4.7 封闭、杂交：1）取出转膜后的pvdf膜，蛋白面朝上并于左上角剪角作为标识，然后pvdf膜用1
×
tbst洗涤1次；2）用5%脱脂奶粉室温封闭2h，再用1
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tbst洗涤1次；3）加入一抗稀释液稀释好的一抗，4℃下摇床孵育过夜；4）次日取出，1
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tbst洗涤4次，10min/次；5）加入5%脱脂奶粉稀释好的二抗，室温摇床上孵育1.5h；6） 1
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tbst洗涤4次，10min/次。
31.4.8 显影（bio-rad凝胶成像系统成像）：用滤纸将pvdf膜表面的tbst溶液吸干，然3将pvdf膜放在保鲜膜上，根据pvdf膜大小配制ecl显色液，a、b液按1:1的比例混合，将混合液滴在pvdf膜表面，使液体覆盖整张膜，避光室温孵育2-3min，操作过程中应避光。放入bio-rad凝胶成像系统成像，根据显影条带背景情况调整曝光时间，选择满意的图片，同时利用系统软件分析各组条带灰度值，结果进行统计学分析。本实验重复三次以上。
32.我们发现，葫芦素b抑制人卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*细胞和a2780ddp细胞pi3k/akt信号通路（图5、图6）。