一种防晒抗光老化中药组合物及其应用

1.本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种防晒抗光老化中药组合物及其应用。


背景技术：

2.皮肤老化是一个复杂的生物学过程，分为内源性老化和外源性老化两种类型。内源性老化是随时间推移而发生的皮肤老化，存在基因依赖性。外源性老化是由外界环境因素引起，其中uv辐射为主要因素，占外界影响的80％，因此外源性老化又被称为光老化。
3.光老化最为显著的临床特征是皮肤干燥、松弛结节、细纹增多、弹性下降以及色斑沉着。组织学上，光老化皮肤的黑色素细胞增多，色素过度沉着，朗格汉斯细胞明显减少，真皮层增厚，胶原蛋白纤维的显著减少，但弹性纤维却大量增多变性。细胞水平光老化的特征主要表现为活性氧自由基(ros)的过度蓄积以及细胞外基质成分的改变。
4.研究发现80％～90％的皮肤老化由外源性因素引起，其中uv辐射是加速皮肤衰老的最主要原因。皮肤光老化涉及多种信号分子和多条信号转导通路，其分子机制主要包括dna损伤、氧化应激、炎症反应、胶原结构改变以及细胞凋亡，uv诱导的光老化机制见开放科学(资源服务)标识码(osid)。中药中含有丰富的蛋白质和各种氨基酸、脂类、多糖类、黄酮类、维生素、有机酸、生物碱、皂苷等营养物质，其作用机制有修复dna损伤、抗氧化、抗炎、修复皮肤屏障功能和抗凋亡等，中药在防治和延缓皮肤光老化中起重要作用。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种防晒抗光老化中药组合物。
6.本发明的另一目的在于提供上述防晒抗光老化中药组合物的应用。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种防晒抗光老化中药组合物，由有效成分和dmso组成，其中，有效成分由台湾山芙蓉甲醇回流提取物、延龄草95％乙醇提取物和栀子蒸馏水提取物以4∶3∶3的质量比组成，有效成分在dmso中的浓度为4-8mg/ml。
9.在本发明的一个优选实施方案中，所述台湾山芙蓉甲醇回流提取物的制备方法包括：取风干的台湾山芙蓉的根茎研磨成粉末，用甲醇回流提取，再经减压浓缩合并萃取物，得到深棕色糖浆，浓缩之后得到膏状物，即为所述台湾山芙蓉甲醇回流提取物。
10.在本发明的一个优选实施方案中，所述延龄草95％乙醇提取物的制备方法包括：取延龄草的块根于恒温烘箱中干燥，用中药粉碎机粉碎后过60目筛，用95％乙醇充分浸泡，利用多用强制渗漉罐提取，反复多次，减压浓缩提取液，冷冻干燥，得到所述延龄草95％乙醇提取物。
11.在本发明的一个优选实施方案中，所述栀子蒸馏水提取物的制备方法包括：准确称取干栀子果实粉，过60目筛，将过筛粉溶于蒸馏水，搅拌后进行冷凝蒸发，收集液体并过滤，得第一滤液；将该第一滤液重复离心收集上清液；将该上清液进行抽滤并保留第二滤液，该第二滤液于65-75℃进行旋转蒸发，得黏稠液；将该粘稠液进行冷冻干燥，得干粉，即
为所述栀子蒸馏水提取物。
12.上述防晒抗光老化中药组合物在制备化妆品中的应用。
13.在本发明的一个优选实施方案中，所述防晒抗光老化中药组合物在所述化妆品中的含量为0.05-10wt％。
14.进一步优选的，所述防晒抗光老化中药组合物在所述化妆品中的含量为0.1-10wt％。
15.一种化妆品，含有上述防晒抗光老化中药组合物。
16.在本发明的一个优选实施方案中，所述防晒抗光老化中药组合物的含量为0.05-10wt％。
17.进一步优选的，所述防晒抗光老化中药组合物的含量为0.1-10wt％。
18.本发明的有益效果是：
19.1、本发明具有具防晒和抗光老化功效，可用于化妆品中，达到防晒和抗衰老的效果，尤其适用于太阳光照射导致的皮肤粗糙、皱纹增多、萎黄等。
20.2、本发明纯天然、无刺激、安全无毒副作用。
附图说明
21.图1为本发明实施例5中防晒抗光老化中药组合物清除dpph自由基能力的检测结果图。
22.图2为本发明实施例5中防晒抗光老化中药组合物对hacat细胞毒性检测结果图。
23.图3为本发明实施例5中防晒抗光老化中药组合物对uvb诱导的hacat细胞损伤修复活性检测结果图。
24.图4为本发明实施例5中防晒抗光老化中药组合物对光老化hacat细胞中ros含量的影响结果图。
25.图5为本发明实施例5中防晒抗光老化中药组合物对hacat细胞中i型胶原蛋白、mmp1和timp1的mrna水平的影响结果图。
26.图6为本发明实施例5中防晒抗光老化中药组合物在不同浓度下对红细胞中血红蛋白溶血率的影响结果图。
具体实施方式
27.以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
28.实施例1台湾山芙蓉甲醇回流提取物制备
29.取风干的台湾山芙蓉根茎(20kg)研磨成粉末，用甲醇回流提取6次。减压浓缩合并萃取物，得到深棕色糖浆(850g)，浓缩之后得到膏状物(400g)。
30.实施例2延龄草95％乙醇提取物制备
31.取延龄草块根(6.4kg)于48℃恒温烘箱中干燥，用中药粉碎机粉碎后过60目筛，用95％乙醇浸泡数h后，利用多用强制渗漉罐提取，反复多次，减压浓缩提取液，冷冻干燥，得到延龄草乙醇提取物(2.4kg)。
32.实施例3栀子蒸馏水提取物制备
33.准确称取干栀子果实粉200g，用0.6mm筛子过筛，称取5g过筛粉溶于250ml蒸馏水，
搅拌10min，然后冷凝蒸发2h，收集液体并过滤。滤液在3000r/min的条件下离心10min，收集上清液，重复离心2次；将上清液进行抽滤并保留滤液，滤液于温度70℃的旋转蒸发仪中蒸发30min，得黏稠液，放入玻璃平皿中，-20℃冰箱预冻过夜，然后冷冻干燥24h，研钵研磨成粉末状，得干粉(2g)。
34.实施例4防晒抗光老化中药组合物制备
35.按照质量比例为4∶3∶3，分别取实施例1、2、3制备的台湾山芙蓉甲醇回流提取物、延龄草95％乙醇提取物和栀子蒸馏水提取混合均匀组成有效成分，加入dmso充分溶解，使有效成分的终浓度为5mg/ml，得到防晒抗光老化中药组合物。
36.实施例5防晒抗光老化中药组合物效果实验
37.a清除dpph自由基能力的研究
38.使用dpph自由基清除能力检测试剂盒(碧云天，bc4750)检测多肽清除自由基的活性。取500μl试剂二溶液，冰上解冻后，加入试剂一溶液(无水乙醇)2625μl，充分混匀，置于冰上待用。取iml试剂盒提供的提取液加入到试剂三的棕色玻璃管中，充分混匀后，分装保存50μl每管，置于-20℃；从-20℃冰箱中取出防晒抗光老化中药组合物储存液，加入dmso稀释，置于冰上待用同时准备溶剂备用。分光光度计预热30min以上，调节波长至515nm，无水乙醇调零。将10mg/ml维生素c溶液(试剂三)用提取液配制成大于0.3mg/ml的维生素c溶液待用(向储存离心管加入1.2ml的提取液，充分混匀)。在1.5mlep管中分别加入防晒抗光老化中药组合物溶液、dmso、提取液以及工作液，使防晒抗光老化中药组合物终浓度为62.5μm、125μm、250μm、500μm、1000μm。混匀后室温避光静置30min，于515nm处的吸光度。空白管、阳性对照管、对照管和测定管的吸光值分别记为a空白、a阳性对照、a对照和a测定。空白管只需测1-2次。仪器开机预热，调试参数。使用仪器进行检测，记录检测数据并分析得出结果如图1所示，防晒抗光老化中药组合物具有较强的自由基清除活性，并且具有浓度依赖性。
39.b cck-8法检测防晒抗光老化中药组合物对hacat的细胞毒性
40.将hacat细胞种植到96孔板(约4
×
104/孔)，24h细胞完全贴壁后，去除培养基，加入含不同浓度的防晒抗光老化中药组合物的100μl无血清培养基，24h后，向96孔板加入10μl的cck-8试剂，2h后，在450nm的波长下，检测od值。结果如图2所示，防晒抗光老化中药组合物在浓度为0～40μg/ml时对hacat细胞无毒性，当其浓度达到80μg/ml时，表现出微弱的细胞毒性。
41.c防晒抗光老化中药组合物对uvb诱导的hacat细胞损伤修复活性检测
42.将hacat细胞种植到96孔板(约4
×
104/孔)，24h细胞完全贴壁后，去除培养基，加入含不同浓度的防晒抗光老化中药组合物的100μl无血清培养基预处理24h，之后用pbs洗3遍，采用uvb紫外辐照仪对hacat细胞进行一定辐照剂量辐照细胞。hacat细胞辐照后，更换1％fbs的新鲜培养基，24h后，向96孔板加入10μl的cck-8试剂，2h后，在450nm的波长下，检测od值。结果如图3所示，可以看到，防晒抗光老化中药组合物在浓度为0～40μg/ml时对hacat细胞受到的光损伤具有显著的保护作用，当其浓度为80μg/ml时保护作用减弱。
43.d防晒抗光老化中药组合物对光老化hacat细胞中ros含量的影响
44.使用dcfh2-da通过荧光显微镜测定uvb辐射后hacat细胞内ros的产生。首先，hacat细胞(1.5
×
105/孔)在补充有10％fbs的培养基中培养。然后，当达到80％细胞密度时更换新鲜的培养基。一定浓度的防晒抗光老化中药组合物预处理和uvb照射后，用pbs洗涤
细胞，与10μm dcfh2-da在pbs中37℃孵育30min，然后用pbs缓冲液洗涤。最后，在485nm激发和535nm发射记录分光光度计下测量荧光，结果如图4所示，防晒抗光老化中药组合物在浓度为0～40μg/ml时能够显著降低光老化hacat细胞中ros的含量。
45.e实时荧光定量pcr
46.使用rneasy迷你试剂盒(qiagen，pudong，shanghai，china)从经40μg/ml防晒抗光老化中药组合物预处理和uvb诱导过的hacat细胞中提取rna，然后使用goscript逆转录混合物(promega，wi)逆转录每个样品500ng rna。然后将eva green supermix(bio-rad，ca)用于实时定量pcr，β-actin用作内参。mmp1、i型胶原和timp1的引物用primer5设计，如表1所示。2-δct
方法用于量化相对基因表达。
47.表1
[0048][0049]
结果如图5所示，40μg/ml的防晒抗光老化中药组合物能够部分逆转hacat细胞因uvb诱导导致的i型胶原蛋白和timp1的mrna表达下降以及mmp1的mrna表达上调。
[0050]
f红细胞溶血实验
[0051]
健康家兔心脏取血7ml，加2％草酸钾溶液1ml，制备成新鲜抗凝兔血，加pbs10ml稀释，4℃冰箱保存备用。配制样品系列溶液。每种样品均设立8个试验剂量必须保证各稀释样品悬液充分混匀。溶血及蛋白变性测定：样品组每个浓度2支具塞试管，每管加入样品悬液10ml；阴性对照组2支具塞试管，每管加入pbs10ml；阳性对照组2支具塞试管，每管加入蒸馏水10ml。每支试管加入0.2ml稀释兔血，轻轻混匀，37c孵育30min。结束后，离心10min，2000rmin，吸取上清液移入比色皿内，于分光光度计540nm，560nm及575nm测其吸光度(a)值。按公式
①
计算溶血率(％)，公式
②
计算血红蛋白变性指数(d i，％)。其中r1为空白对照蒸馏水的离心上清液a
575
/a
540
值；r2为样品离心上清液a
575
/a
540
值；r3为阳性对照sds离心上清液a
575
/a
540
值。主要观察指标为50％红细胞发生溶血时的样品浓度(hd
50
)、蛋白质变性指数(di)、hd
50
与变性指数di的比值(ip＝hd
50
/d i)。
[0052][0053][0054]
结果如图6所示，防晒抗光老化中药组合物浓度在100μg/ml以下呈不溶血。
[0055]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即
依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。