一种多肽在制备马卵巢发育保护剂中的应用的制作方法

一种多肽在制备马卵巢发育保护剂中的应用
1.本案为分案申请，原申请的发明名称为：一种马属动物繁殖促进剂，原申请的申请日为：2020-12-11，原申请的申请号为：cn202011459061.6。
技术领域
2.本发明属于动物繁殖技术领域，尤其涉及一种多肽在制备马卵巢发育保护剂中的应用。


背景技术：

3.卵巢是一种动态变化的实质性器官，在哺乳动物的发情周期中，卵巢中的卵泡需要经历募集，选择，优势化等生理过程。卵泡的发育是涉及多种细胞，多个阶段的复杂过程。其中，颗粒细胞和卵母细胞是构成卵泡的重要细胞，卵泡的形成需要颗粒细胞与卵母细胞之间密切的相互作用。颗粒细胞能够有效的支持卵母细胞的发育。因此，有效的促进颗粒细胞的增殖，减少颗粒细胞的凋亡，可以有效的促进哺乳动物的繁殖能力。
4.snakin-z是来源于枣树果实的一种多肽。其包括31个氨基酸，具体的氨基酸序列为carlncvpkgtsgntetcpcyaslhscrkyg，分子质量为3318.82da。目前，snakin-z的已知功能为抑制细菌和真菌，并能够抑制乙酰胆碱酯酶，而关于snakin-z在马属动物繁殖中的应用尚未可知。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种马属动物繁殖促进剂。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明提供了snakin-z多肽在马属动物繁殖中的应用。
7.其次，本发明提供了snakin-z多肽在制备马属动物繁殖促进剂中的应用。
8.其次，本发明提供了snakin-z多肽在制备促进马属动物卵泡发育促进剂中的应用。
9.其次，本发明提供了snakin-z多肽在制备促进马属动物卵巢颗粒细胞增殖促进剂中的应用。
10.其次，本发明提供了snakin-z多肽在制备抑制马属动物卵巢颗粒细胞凋亡抑制剂中的应用。
11.其次，本发明提供了一种马属动物繁殖促进剂，所述促进剂包括有效剂量的snakin-z多肽。
12.其次，本发明提供了一种马属动物卵泡发育促进剂，所述促进剂包括有效剂量的snakin-z多肽。
13.其次，本发明提供了一种马属动物卵巢颗粒细胞增殖促进剂，所述促进剂包括有效剂量的snakin-z多肽。
14.其次，本发明提供了一种马属动物卵巢颗粒细胞凋亡抑制剂，所述抑制剂包括有
效剂量的snakin-z多肽。
15.本发明的有益效果是：本发明发现snakin-z多肽能够有效的促进马卵巢颗粒细胞的增殖，并有效的降低马卵巢颗粒细胞的凋亡，从而可以用于制备马属动物卵巢颗粒细胞促进剂，卵巢颗粒细胞凋亡抑制剂，并进而用于马属动物卵泡发育促进剂和马属动物繁殖促进剂。
附图说明
16.图1 edu染色结果图。
17.图2 edu染色结果定量结果图。
18.图3 caspase-3酶活力检测结果图。
19.图4 western blot检测结果图。
具体实施方式
20.为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
21.实施例1马卵巢颗粒细胞的分离培养（1）本试验所使用的马卵巢来源于本公司，将取出的马卵巢使用含有双抗的pbs溶液进行多次漂洗后，小心的去除卵巢周围的脂肪组织和被膜；（2）将卵巢置于含有双抗的dmem-f12培养液中，在显微镜下使用无菌注射器刺破卵泡，引导卵巢颗粒细胞流出；（3）收集含有马卵巢颗粒细胞的培养液，使用200目的细胞筛将细胞收集至15ml的离心管中；（4）在4℃，1000rpm/min条件下，离心5min，去除上清，收集马卵巢颗粒细胞；（5）使用含有双抗的pbs洗涤细胞，再次进行离心，离心后去除上清，使用含5%胎牛血清和双抗的dmem-f12培养基进行重悬；（6）调整细胞密度为1
×
106/m l后，将细胞接种于细胞培养板中，24h后更换培养液，待细胞生长至90%左右时进行传代。
22.实施例2edu染色实验（1）将马卵巢颗粒细胞接种于96孔板中，使用0mg/ml的snakin-z多肽和0.5 mg/ml的snakin-z多肽进行处理；（2）处理24h之后，去除培养基，加入100ul edu进行孵育；（3）弃去edu，使用pbs清洗细胞2次，加入4%的多聚甲醛室温条件下固定30min；（4）弃去4%多聚甲醛，加入100ul的甘氨酸孵育5min；（5）弃去甘氨酸，使用pbs清洗细胞2次，加入100ul 0.5% triton-100处理10min；（6）弃去triton-100，使用pbs清洗细胞2次，加入100ul apollo处理10min；（7）弃去apollo，加入100ul 0.5% triton-100处理2次，每次10min；（8）加入100ul的甲醇清洗2次，每次5min，加入dapi染色10min，pbs清洗3次，显微镜下观察拍照，选取随机3个视野edu染色细胞数。
23.实验结果如图1和图2所示，从图中可知，0.5mg/ml snakin-z多肽组的edu染色数量显著多于0mg/ml snakin-z多肽组，说明snakin-z多肽能够促进马卵巢卵母细胞的增殖。
24.实施例3caspase3酶活性检测（1）将马卵巢颗粒细胞接种于细胞培养板中，对照组添加0mg/ml的snakin-z多肽，实验组1添加150umol h2o2和0mg/ml的snakin-z多肽，实验组2添加150umol h2o2和0.5mg/ml的snakin-z多肽处理6h；（2）按照碧云天caspase3活性检测试剂盒说明书（c1115）测定pna标准曲线；（3）吸取细胞培养液，备用，使用胰酶将马卵巢颗粒细胞消化，收集至备用的细胞培养液中；（4）600g 4℃离心5min收集细胞，小心吸除上清，使用pbs洗涤一次；（5）按照每200万细胞加入100ul裂解液的比例加入细胞裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15min；（6）4℃ 16000g离心15min，将上清转移至冰浴预冷的离心管中，按照说明书测定caspase3酶活性。
25.从图3可以看出，snakin-z多肽能够有效的减少h2o2导致的马卵巢颗粒细胞凋亡（对照组为19.13
±
2.70，实验组1为57.65
±
3.91，实验组2为24.89
±
4.20，差异具有统计学意义）。
26.实施例4western blot检测（1）将马卵巢颗粒细胞接种于细胞培养板中，对照组添加0mg/ml的snakin-z多肽，实验组1添加150umol h2o2和0mg/ml的snakin-z多肽处理6h，实验组2添加150umol h2o2和0.5mg/ml的snakin-z多肽处理6h；（2）药物处理结束后，使用pbs洗涤细胞2次，加入100ul含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，冰上使用细胞刮刮下细胞，收集细胞裂解液；（3）冰上裂解30min，4℃ 12000rpm离心30min，吸取上清至新的ep管中；（4）采用bca蛋白浓度测定试剂盒检测每组细胞的蛋白浓度；（5）调整蛋白浓度为20ug/ul，100℃加热5min；（6）配置5%浓缩胶和10%分离胶，组装电泳装置，每孔加入20ul蛋白样品；（7）恒定电压80v将样品电泳至分离胶界面，调整电压为120v，当溴酚蓝接近底部时，停止电泳；（8）将滤纸浸泡于转膜液中，pvdf膜浸泡于甲醇中，按照3层滤纸-pvdf膜-胶-3层滤纸的顺序安装转膜夹，恒定电流250ma电转1.5h；（9）电转结束后，将pvdf膜置于5%脱脂奶粉中，封闭1h，封闭结束后，使用tbst漂洗pvdf膜上残留的脱脂奶粉；（10）将pvdf膜置于bax，bcl-2，cleaved caspase-3和β-actin的一抗中，4℃孵育过夜；（11）次日，使用tbst洗涤pvdf膜3次，每次10min；（12）孵育相应的二抗，摇床避光孵育1h，tbst洗涤3次，每次10min，洗涤结束后，使
用ecl化学发光法进行显影。
27.从图4可以看出，snakin-z多肽能够有效的逆转h2o2所导致的促凋亡蛋白bax和cleaved caspaase-3升高和抑凋亡蛋白bcl-2降低，说明snakin-z多肽能够有效的降低h2o2所导致的马卵巢颗粒细胞凋亡。