镁离子在防治水生病毒感染中的应用

1.本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及镁离子的用途，含有镁离子的化合物可用于制备预防或治疗水生病毒(尤其是gcrv或svcv)感染的药物或添加剂。


背景技术：

2.镁离子是维持神经、肌肉和心脏功能的重要离子之一。镁离子的生理功能主要包括：(一)通过抑制突触的乙酰胆碱释放，阻止神经系统及肌肉的信号传导，具有镇静作用；(二)作用于周围血管系统，使血管扩张，起到降低血压的作用；(三)作为多种酶的催化剂参与到物质代谢和能量代谢过程中，如磷酸酶、磷酸化酶、胆碱酯酶、羧化酶、激酶、dna聚合酶、rna聚合酶等等；(四)作为重要组分存在于体内，如分布于骨骼和牙齿中，组成磷酸镁盐，或在血浆中以游离镁离子形态存在，参与多种生理活动。目前，镁离子在抗病毒过程中扮演的角色尚不清楚，尚未有报道将镁离子应用于水生动物病毒性疾病防治。
3.鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus，svcv)属弹状病毒科，水疱病毒属，是一种单股负义链rna病毒。svcv引起的鲤春病毒血症(svc)是一种具高传染性、高致死性的水产疾病，能够造成巨大的经济损失。目前关于svcv的研究较为丰富，药物研究较多，但仍然缺乏行之有效的防治手段，尚无商品化的特效药。预防方面，svcv的疫苗开发目前尚处于探索阶段，尚未研发出保护率、成本、接种方式三项均满足规模化生产，能够实现市场投放的疫苗。因此，在当前的研究背景下，寻找高效安全的药物仍是svcv防治的首选。
4.草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，gcrv)，属呼肠孤病毒科，水生呼肠孤病毒属。gcrv引起的草鱼出血病是危害草鱼养殖产业的主要病毒性疾病。目前，针对gcrv的防治方式主要聚焦于疫苗研究。随着基因工程疫苗研制的发展，以亚单位疫苗和核酸疫苗为代表的各类草鱼出血病疫苗相继出现。但是疫苗的大规模生产应用仍然受到制约，主要是因为疫苗专一性强的特性使其无法应用于易变异的病毒。基于此，找寻具有良好抗病毒效果的抗gcrv药物相比于使用疫苗具有显著的优势。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供镁离子在防治水生病毒感染中的应用，镁离子能够显著抑制鱼类离体培养细胞中病毒相关基因(svcv相关基因g、l、n、p及gcrv相关基因s6、s9)的转录，抗病毒实验证实镁离子对于svcv与gcrv病毒感染起到保护作用，含有镁离子的化合物能够用于制备防治水生病毒(尤其是svcv与gcrv)感染的药物或添加剂。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.镁离子在防治水生病毒感染中的应用：在本发明的具体实施例中，感染svcv的epc细胞系或感染gcrv的cik细胞系在加入20mm mgcl2处理后，病毒造成的细胞病变效应被显著抑制。进一步检测细胞中病毒相关基因扩增情况显示，mgcl2处理之后，epc和cik细胞中病毒相关基因(svcv相关基因g、l、n、p及gcrv相关基因s6、s9)的表达被显著抑制，epc细胞中svcv病毒的n、p、g蛋白表达水平显著降低。
8.本发明实施例中选取的两种鱼类细胞系分别是来源于svcv和gcrv重要宿主的细胞系，因此通过建立两种细胞感染病毒的疾病模型，以及对病毒相关基因表达的检测，可知镁离子适用于水生病毒(尤其是svcv或gcrv)的病毒防治。
9.含有镁离子的化合物作为预防或治疗svcv或gcrv病毒感染的药物或添加剂，药物可以以注射剂或口服剂形式使用，具有给药剂量低，成分单一，防治效果佳的优点。
附图说明
10.图1为mgcl2对svcv与gcrv 873感染细胞的影响。
11.图2为mgcl2对细胞中svcv与gcrv 873病毒基因转录水平的影响。
12.图3为mgcl2对细胞中svcv病毒蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
13.实施例1：mgcl2对svcv与gcrv 873感染细胞的影响
14.抗病毒实验用于检测svcv与grcv病毒在细胞中的滴度。在24孔细胞培养板及96孔细胞培养板中进行。cik细胞用于检测gcrv病毒滴度，epc细胞用于检测svcv病毒滴度。取生长状态良好的细胞传代接入24孔板，28℃培养过夜；接种moi＝10的svcv于epc细胞或接种moi＝1的gcrv于cik细胞，同时加入20mm mgcl2处理；接种后继续培养72h，将贴壁细胞使用4％细胞组织固定液固定1h，1％结晶紫染色过夜，次日对染色完成的细胞进行拍照，观察病变效应。结果如图1所示，20mm mgcl2处理后的感染病毒细胞中，细胞病变显著减少。
15.实施例2：mgcl2对svcv与gcrv 873病毒基因转录的影响
16.检测感染svcv或gcrv 873之后的细胞用20mm mgcl2处理后，细胞中病毒相关基因的转录水平。取生长状态良好的细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法及病毒滴度接种病毒并进行药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，用trizol(invitrogen)裂解细胞沉淀后提取细胞总rna，由goscript逆转录试剂盒(promega)逆转录得到cdna。通过qpcr检测病毒相关基因的转录水平，包括gcrv 873相关基因s6、s9，svcv相关基因g、ln和p，相关方法参照文献
1.。结果表明：20mm mgcl2处理后，细胞中svcv病毒相关基因(包括g，l，n，p)及gcrv 873相关基因(包括s6、s9)的转录水平显著下降。
17.实施例3：mgcl2对svcv病毒增殖的影响
18.检测感染svcv之后的细胞用20mm mgcl2处理后，细胞中病毒相关基因的表达情况。取生长状态良好的细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法接种病毒及药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，pbs润洗一遍后放入-80℃冰箱保存；向冰冻保存的细胞沉淀中加入适量ripa弱裂解液，置于4℃裂解1小时，使细胞充分裂解；吸取细胞裂解物至新的1.5ml离心管中，样品加入1/4体积的5
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sds sample buffer，涡旋混匀，100℃沸水浴10min，置于冰上备用。使用western blot实验检测mgcl2处理后svcv蛋白表达水平(核蛋白n、磷酸化蛋白p、糖蛋白g)，相关方法参照文献
2.。实验结果表明，20mm mgcl2处理后，细胞中svcv病毒的n、p、g蛋白表达水平显著降低(图3)。
19.参考文献
20.[1]zhou x y,lu l f,li z c,et al.temperature effects on svcv propagation and the related ifn response in zebrafish[j].aquaculture,2021,
533.
[0021]
[2]lu l f,zhang c,li z c,et al.a novel role of zebrafish tmem33 in negative regulation of interferon production by two distinct mechanisms[j].plos pathog,2021,17(2):e1009317.