海藻及其提取物在制备抗神经炎症药物上的应用及抗神经炎症药物

1.本发明涉及医药技术领域，具体讲是一种海藻及其提取物在制备抗神经炎症药物上的应用及抗神经炎症药物。


背景技术：

2.神经炎症是一种常见的中枢神经系统疾病，并含有感染性相关脑病的主要特点。神经炎症的发生会诱发、影响或加重许多精神疾病，如阿尔兹海默症(alzheimer’s sclerosis)、中风(stroke)、癫痫(epilepsy)、焦虑(anxiety)、抑郁(depression)等。神经炎症反应主要是细胞因子引起的，也会由趋化因子和活性氧自由基等引导，细胞因子在大脑中会介导激发胶质细胞，调节控制神经递质的代谢而造成神经毒性等严重危害，细胞因子还会给脑组织中的海马体造成危害，使得神经元无法保持正常形态而对人体的记忆和学习带来不良影响。此外，炎症因子会对神经递质的代病情谢和传递起到阻碍作用，影响人体的情绪调节而加重焦虑、抑郁症人群的病情。因此，对于神经炎症的研究和治疗，对于多种神经精神疾病的有效防治与控制显得尤为迫切和重要。
3.肠道微生物群的变化可以促进肠道和外周神经的炎症反应，进而导致中枢神经系统的神经炎症或者神经退行性变。越来越多的证据支持微生物-肠-脑轴参与大脑功能和神经及精神疾病的发病机制，包括帕金森病、阿尔茨海默病、抑郁症等。保持或者恢复正常的肠道菌群状况可以有助于预防或者治疗神经炎症。并且，重塑和改善肠道微生态不仅有助于脑健康的恢复，还有助于稳固机体代谢活动，帮助人体抵抗病原体，促进机体合成维生素和提高免疫力。
4.海藻，属马尾藻科海洋草本植物，其中大叶海藻习称海蒿子，味苦性寒，具有软坚散结，消痰利水，破散结气等功效，主要生长于我国黄海、渤海沿岸。相关研究显示，海蒿子所含成分具有抗肿瘤，抗氧化活性，有一定的抗菌作用，羊栖菜所含成分具有降血糖活性，还能减轻动脉粥样硬化，这两种海藻具有药用价值的同时，中国、韩国、日本等地人民将其作为营养丰富且绿色健康的美食，在沿海地区也有人工种植地，是极具前景的“药食”两用植物。目前对海藻的研究主要集中在其多糖分子及结构上，并没有完整的成分与药理活性研究。
5.海藻在我国沿海海域生长，天然储量巨大，获取简单，价格低廉，市场供应量大提取工艺简单。此外，作为天然植物药，又属于药食同源类的药物，有着安全，低毒，无耐药性从而可重复使用等特点。但是，就目前关于海藻对于抗神经炎症作用尚无报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种海藻及其提取物在制备抗神经炎症药物上的应用和抗神经炎症药物。
7.本发明的技术解决方案如下：
8.海藻在制备抗神经炎症药物上的应用。
9.进一步地，以海藻为有效原料，还包括其他药用成分和/或药学上可接受的辅料。
10.本发明还公开了海藻提取物在制备抗神经炎症药物上的应用。
11.本发明还公开了海藻提取物在制备能够调节肠道菌群和/或提高脑血流药物上的应用。
12.作为本发明的优选方案，所述海藻提取物包括小分子物质和多糖物质。
13.作为本发明的优选方案，所述小分子物质包括蛇床子素，7-羟基香豆素，7-甲氧基香豆素，滨蒿内酯，异贝壳杉烯酸，小白菊内酯，小檗碱，川陈皮素，咖啡因。
14.作为本发明的优选方案，所述多糖物质包括褐藻糖胶、褐藻胶和褐藻淀粉。
15.作为本发明的优选方案，所述小分子物质采用醇水提取工艺，具体为：将海藻干燥藻体，剪碎，加入乙醇，加热蒸馏，旋蒸挥发去乙醇，剩余浓缩液冷冻干燥，制得。
16.作为本发明的优选方案，所述多糖物质采用醇沉工艺，具体为：将海藻干燥藻体加入水，加热提取，冷却后真空抽滤，得一次滤液，把过滤后的滤渣再一次加水进行热浸提，使用真空抽滤，得二次滤液，将一次滤液和二次滤液合并，进行旋蒸浓缩，得到浓缩液，往浓缩液中加入乙醇，进行醇沉处理，在0-4℃下静置，静置后去除上清液，将乙醇挥发干，对醇沉物冷冻干燥，制得。
17.本发明还公开了抗神经炎症药物，包括海藻和/或海藻提取物。
18.本发明的有益效果是：本发明提供了一种海藻及其提取物在抗神经炎症药物上的应用及抗神经炎症药物，海藻及其提取物对抗神经炎症中具有确切的疗效；同时，海藻属于天然产物，为药食同源的药品，副作用小，具有使用安全、方便等优势，作为预防、治疗神经炎症具有重大的意义。
附图说明
19.图1为本发明采用实施例1试样的细胞活性实验结果图；
20.图2为本发明采用实施例1试样的酶联免疫吸附试验结果图；
21.图3为本发明采用实施例1试样的免疫荧光图；
22.图4为本发明采用实施例1试样的免疫荧光量化数据结果图；
23.图5为本发明采用实施例1试样的试验流程图；
24.图6为本发明采用实施例1试样的糖水实验基线与造模后糖水试验结果；
25.图7为本发明采用实施例1试样的中旷场实验的轨迹图；
26.图8为本发明采用实施例1试样的中旷场实验的结果；
27.图9为本发明采用实施例1试样的中悬尾实验的结果；
28.图10为本发明采用实施例1试样的高架十字迷宫实验的结果；
29.图11为本发明采用实施例1试样的激光散斑实验的结果；
30.图12为本发明采用实施例1试样的小鼠肠道粪样的dna提取与16srrna测序实验的属分类水平下各组小鼠肠道菌群组成图；
31.图13为本发明采用实施例1试样的鼠肠道粪样的dna提取与16srrna测序实验的各组样品肠道菌群pca分析图；
32.图14为本发明采用实施例2试样的细胞存活率的结果；
33.图15为本发明采用实施例2试样的细胞炎症因子tnf-α、il-6浓度的结果；
34.图16为本发明采用实施例2试样的免疫荧光测定细胞形态和炎症因子浓度的结果；
35.图17为本发明采用实施例2试样的动物实验流程图；
36.图18为本发明采用实施例2试样的旷场实验的结果；
37.图19为本发明采用实施例2试样的悬尾实验的结果；
38.图20为本发明采用实施例2试样的高架十字迷宫实验的结果；
39.图21为本发明采用实施例2试样的小鼠肠道粪样的dna提取与16srrna测序的属分类水平中的物种profiling柱状图；
40.图中，*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001，均与空白组(control)比较；
#
p《0.05，
##
p《0.01，
####
p《0.0001，均与模型组(model)比较；其中p为显著性，p《0.05表示差异具有统计学意义，p《0.01表示差异具有显著统计学意义，p《0.0001表示差异具有极其显著的统计学意义。
具体实施方式
41.以下以具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
42.以下所述pbs为磷酸盐缓冲液。
43.以下所述hzz指的是海蒿子。
44.实施例1
45.称取海蒿子干燥藻体，剪碎，装入提取容器中，加入20倍的质量浓度95％乙醇作为溶剂，加热蒸馏8小时，旋蒸挥去乙醇，剩余浓缩液冷冻干燥24h，研磨后制成冻干粉，经测定，该冻干粉主要成分包括蛇床子素，7-羟基香豆素，7-甲氧基香豆素，滨蒿内酯，异贝壳杉烯酸，小白菊内酯，小檗碱，川陈皮素，咖啡因。
46.试验一：bv2小胶质细胞细胞活性试验
47.使用bv2小胶质细胞株(购自中国科学院上海细胞库)，取对数生长期的bv2细胞均匀接种在96孔板上(6
×
103个/孔)，细胞培养贴壁底部60％进行药物干预，干预24h测试细胞活性，将培养的细胞分为control组、model组、帕罗西汀(sigma；y0000578)par组、不同剂量给药组，control组不给药，其余各组加入最终浓度为1μg/ml的lps(脂多糖sigma l2880)，加入最终浓度为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml的hzz醇水提取物，具体配制时，将实施例1的冻干粉加磷酸盐平衡生理盐水溶解配制，得到上述不同浓度的hzz醇水提取物。
48.通过cck-8检测分析，lps会提高bv2小胶质细胞活性，对细胞有激活活化作用，帕罗西汀能有效抑制lps诱导的活性变化，40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml浓度的hzz醇水提取物有抑制lps诱导细胞激活的作用，具体结果见图1。
49.试验二酶联免疫吸附试验(elisa)
50.造模方法及分组与试验一相同，并按照tnf-α、il-6的elisa试剂盒说明书操作实验。
51.以40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml做为hhz醇水提物的低、中、高剂量给药，检测炎症因子tnf-α、il-6含量，结果见图2，发现lps组中的bv2细胞上清液中tnf-α、il-6含量显著增
加，各剂量给药组与lps组相比较可以发现，hhz醇水提取物能够降低炎症因子的产生，表现出抗神经炎症能力。
52.试验三细胞免疫荧光实验
53.造模方法及分组与试验一相同，实验时弃去旧培养基，加入pbs清洗3次彻底清洗干净细胞碎片等杂质，加入预先溶解配置的4wt％多聚甲醛固定15min，此时细胞已被固定完毕，使用37℃水浴预热过的pbs冲洗3次，加入0.2wt％ttitonx-100通透剂使细胞膜通透，30min后用pbs冲洗3次，加入pbs配置的5wt％正常血清封闭液，孵育1h；再使用tbst清洗3次随后加入使用5wt％山羊血清配置的1:500一抗300ul覆盖爬片，避光置于4℃冰箱中过夜；过夜时间控制在12至14小时(晚上8:30至第二天早上9:00)，次日实验时首先使用pbs清洗3次，加入配置好的二抗覆盖爬片，37℃孵育1h，加入dapi孵育5min，再次使用pbs轻轻吹洗，小心地将细胞爬片抠起，置于共聚焦皿中，加入抗荧光淬灭封片剂封片后，及时使用激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，见图3。
54.使用imagej软件量化分析结果，结果见图4。
55.结果显示hhz醇水提取物在低、中、高三个剂量下，均能使lps诱导的细胞炎症因子tnf-α、il-1β、il-6水平降低，实验中hhz低剂量组对炎症因子il-6浓度的影响没有统计学意义，但是呈现出一定程度的降低，三种给药剂量中，中剂量组(60μg/ml)药效更为显著，表现出抗神经炎症能力。
56.试验四：小鼠抑郁模型建立及海蒿子提取物的给药
57.实验动物采取雄性、7周龄c57小鼠。所有小鼠自由摄食饮水，采用12h的昼夜周期(8：00-20：00为夜，20：00-8：00为白昼。)
58.将实施例1制备的冻干粉溶于水，制备下述给药组不同浓度的剂量，帕罗西汀组采用生理盐水溶解配制的，小鼠随机分为空白组(control)、模型组(model)、帕罗西汀阳性药组(par)、海蒿子高剂量组(hhz-h)、海蒿子中剂量组(hhz-m)、海蒿子低剂量组(hhz-l)，除control组合笼饲养外，其余各组小鼠均单笼饲养。
59.除空白组小鼠外，其余组小鼠均需建立抑郁模型。造模期间，model组与各给药组每天腹腔注射生理盐水溶解的lps 1mg/kg连续5天，建立慢性炎症致抑郁模型，同时所有给药组，按帕罗西汀10mg/kg/day，海蒿子10mg/kg/day(低剂量)，20mg/kg/day(中剂量)和40mg/kg/day(高剂量)，根据小鼠体重持续给药一周，hhz醇水提取物各剂量组灌胃给药，阳性药组使用腹腔注射方式给药。模型建立完成以后给药，具体流程如图5。
60.试验五：糖水偏好实验
61.糖水偏好实验是一种通过小鼠对糖水的喜好系数，评估小鼠小鼠快感是否缺失，判断抑郁程度的有效实验。在整个动物实验过程中，分别在造模前和试验结束后各进行1次糖水实验，造模前的糖水偏好实验让明确各小鼠的糖水偏好系数，帮助筛除系数过高或者过低的小鼠，保证小鼠的快感获得状态一致，减小实验误差。实验结束后第2次的糖水偏好实验，可以使我们了解经过造模后小鼠快感的缺失程度，可以作为行为学数据之一判断药效作用。
62.糖水偏好实验进程中，所有小鼠均需要单独饲养，将两个水瓶置于相同高度，每只小鼠提供两瓶浓度为1wt％的糖水，正常投喂饲料，24h后，每只小鼠分别给予一瓶纯水，一瓶浓度为1wt％的糖水；24h后，所有小鼠禁食禁水持续24h，到达预定时间后计算更换一瓶
糖水一瓶纯水，计算24h内各小鼠糖水与纯水的消耗量，通过公式计算各小鼠的糖水偏好系数＝糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)
×
100％，两次糖水偏好实验步骤相同。
63.糖水实验结果分析
64.实验前对所有小鼠进行了糖水偏好基线测量，剔除偏好系数过高或者过低的小鼠后，各组别小鼠糖水基线无显著差异。lps诱导的慢性炎症致抑郁后model组小鼠糖水偏好系数显著低于control组(p＜0.05)，各给药组小鼠糖水偏好系数也都明显高于model组(p＜0.05)。具体结果见图6。
65.试验六：小鼠旷场实验
66.行为学检测方法:旷场装置为黑色木质敞箱，长42cm、宽42cm、高40cm。底面中央位置用白线画20
×
20cm的方格。将小鼠放于旷场中央方格,记录6min内小鼠在中央方格的停留时间以及小鼠在旷场内的运行轨迹。用smart软件进行录像分析。每只小鼠测试完毕需要用酒精擦洗箱底。
67.旷场结果分析
68.实验结果以平均值
±
标准误差表示，以t检验统计处理。
69.旷场实验为经典的抗焦虑筛选模型，有效的抗抑郁药物会增加小鼠在中央的运动距离。各组小鼠行动轨迹图见图7，旷场实验具体结果见图8。结果显示，与control组相比，model组的中心运动距离、总运动距离都显著下降(p＜0.01)，与model组相比，海蒿子提取物各剂量组各项指标显著上升(p＜0.05)。
70.试验七：小鼠悬尾实验
71.悬尾实验结果分析
72.行为学检测方法：根据european journal of pharmacology,2001,415:197中记载的实验方法构建小鼠悬尾实验模型，将小鼠倒吊于距地面60cm的横杆上6min，小鼠的固定位点为距尾稍1cm处，适应1min后，观察后5min小鼠不动时间，不动状态定义为小鼠停止挣扎，躯体呈放松状态。
73.实验结果以平均值
±
标准误差表示，以t检验统计处理。
74.小鼠悬尾实验为经典的筛选抗抑郁药实验模型，小鼠悬尾一段时间后呈现绝望状态，停止挣扎。有效的抗抑郁药物会使小鼠悬尾过程中不动时间缩短。如图9所示，本实验研究表明口服海蒿子提取物可以显著缩短小鼠悬尾过程中不动时间(p《0.05)。
75.试验八：小鼠高架十字迷宫
76.高架十字迷宫实验结果分析
77.高架十字迷宫(evated plus maze,epm)实验：将小鼠从迷宫中央广场处放入，每次一只小鼠，之后密闭迷宫帷幕。利用高清视频软件观测5min内小鼠在迷宫中的活动情况，记录行为学数据。每次试验结束后，清除迷宫中小鼠排泄物，并用酒精棉对迷宫进行擦拭,以消除气味，之后进行下一次实验。
78.实验结果以平均值
±
标准误差表示，以t检验统计处理。
79.高架十字实验为经典的筛选抗抑郁药实验模型，将小鼠放入十字迷宫的中央处，记录和观察小鼠在十字迷宫中开合臂的停留时间。如图10所示，本实验研究表明口服海蒿子提取物可以显著提高小鼠在高架十字迷宫中在开合臂的停留时间不动时间占比(p《0.05)。
80.经过以上动物实验模型验证，包括小鼠旷场实验(oft)、小鼠悬尾试验(tst)，小鼠高架十字迷宫实验，(epm)证明了海蒿子口服可以增加旷场实验中小鼠在中央的运动距离与总运动距离，缩短小鼠悬尾过程中的不动总时间，并提高了小鼠在高架十字迷宫中开合臂的停留时间占比。综上所述，海蒿子提取物对抑郁症具有确切的疗效，同时，海蒿子属于纯天然产物，副作用小，使用安全、方便,作为预防、治疗抑郁、焦虑症具有重大的意义。
81.实验九：激光散斑血流成像实验
82.激光散斑血流成像实验结果分析
83.采用激光散斑技术对每组给药组小鼠进行脑血流测定。为防止鼠毛干扰检测，首先将小鼠头顶毛发脱除暴露头皮，将小鼠固定于脑立体定位仪上，用酒精消毒后，将小鼠头皮剪开，用生理食盐水将棉签润湿后涂抹润湿颅骨，将沾染的鼠毛碎屑杂质等清洁干净。将扫描探头调整位置于小鼠颅骨正上方，与测量面的垂直面形成15
°
的夹角，并且将扫描窗口与受测面之间的距离维持在10-38cm的区间内，采用系统moorflpi-2measurement v2.0来采集实验数据，使用时间扫描模式，将图像对焦使得血流图呈现清晰并记录保存，最后将测得的血流图数据在moorflpi-2v5.0软件中进行分析。
84.基于激光散斑技术检测各给药组小鼠脑血流变化情况如图11所示。实验发现control组大脑中脑血流情况正常良好，并且血流丰富，而慢性炎症诱导成功的神经炎症抑郁model组的平均脑血流量和血管直径都明显小于control组(p《0.01)。给药组的小鼠脑动脉血管径相对于model而言显著提升，尤为明显的是hhz-l、hhz-m组与7-oh组(p《0.01)，其他组提升小鼠的平均脑血流量效果也有良好作用(p《0.05)。
85.实验十：小鼠肠道粪样的dna提取与16s rrna测序实验
86.小鼠肠道粪样的dna提取与16s rrna与测序实验结果分析
87.实验前准备好要用的实验用具进行高温高压门灭菌，如冻存管、镊子、棉签等，佩戴一次性实验手套用75wt％的酒精喷洒擦拭手部消毒，使用棉签蘸取75％酒精将小鼠肛门四周涂抹消毒，然后用无菌棉棒轻柔地按压小鼠下腹部帮助小鼠自然排便，用高温高压灭菌后的镊子在小鼠肛门处直接夹取自然排出的粪便，立即装入冻存管用封口膜密封并做好标记，平均每个冻存管中采集1-3颗粪便。采集control组、model组、hhz组后立即将冻存管存置于-80℃冰箱保存。
88.将粪便样品的dna提取后进行pcr扩增与产物纯化，使用illumina公司的miseq pe300测序仪测序，本部分工作委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。
89.由图12可知，与control组相比，有几种菌属存在比较显著的变化，即norank_f__muribaculaceae丰富度占比显著降低，而akkermansia、bifdobacterium、lachnospiraceae.nk4a136 group丰富度升高，而hhz组能回升norank_f__muribaculaceae的丰富度，降低akkermansia、bifdobacterium、lachnospiraceae.nk4a136 group占比，同时大幅提升lactobaillus丰富度。由图13可知，hhz组总体上与model组一直保持较大差异，并且与control组通向聚集，向control组回归，实验数据结果表明，hhz对肠道菌群能起到调节作用。
90.经过以上体外、体内实验相结合，证明了hhz醇水提取物有抑制lps诱导细胞激活的作用，降低炎症因子的产生，使lps诱导的细胞炎症因子tnf-α、il-1β、il-6水平降低，表现出抗神经炎症能力。旷场实验中hhz醇水提取物各剂量组的中心运动距离、总运动距离都
显著上升(p＜0.05)，悬尾实验中显著缩短小鼠悬尾过程中不动时间(p《0.05)，显著提高小鼠在高架十字迷宫中在开合臂的停留时间不动时间占比(p《0.05)，表现出抗炎性抑郁的活性。此外，还能有效提升小鼠脑血流量和增加小鼠的脑血管径，对小鼠的肠道菌群起到调节作用，重塑和改善小鼠肠道微生态。
91.实施例2
92.水提醇沉法制备hhz多糖
93.将海蒿子hhz药材(hhz购买自安国市一方药业有限公司，批号：19061309)干燥藻体(5kg)按10倍比例(g/ml)加入去离子水，在100℃下提取2h，冷却后真空抽滤，得一次滤液。把过滤后的滤渣同条件下再一次热水浸提，使用真空抽滤并弃去滤渣，将两次得到的滤液进行合并。使用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩溶液，转移至烧杯中，室温冷却，按10倍的体积比例加入无水乙醇进行醇沉处理，用离心机离心后舍掉上清液，将乙醇挥发干，用冷冻干燥机冻干，得hhz粗多糖样品，经测定，其主要成分包括褐藻糖胶、褐藻胶和褐藻淀粉。
94.试验十一：细胞神经炎症模型建立及细胞存活率实验
95.取数生长期的bv2细胞均匀接种在96孔板上(6
×
103个/孔)，细胞培养贴壁底部60％进行实验，使用移液枪弃去旧培养基，加入pbs清洗2遍，加入完全培养基与lps溶液使最终浓度为1μg/ml。
96.cck8活性实验
97.取数生长期的bv2细胞均匀接种在96孔板上(6
×
103个/孔)，细胞培养贴壁底部60％进行药物干预，干预24h测试细胞活性，将培养的细胞分为空白对照组、模型组、阳性药组、不同剂量给药组，除空白组以外，各组加入最终浓度为1μg/ml的lps，加入最终浓度为40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的hhz多糖，阳性药组加入最终浓度为5μm的帕罗西汀，干预24h后，每孔加入10μl cck-8溶液，至于培养箱孵育1.5h，使用酶标仪在450nm处检测od值，通过细胞活性计算公式(给药组od-空白孔od)/(对照组od-空白孔od)
×
100％计算细胞活性，并观察各组细胞的形态综合分析。分析结果见图14，通过cck-8检测分析，lps会提高bv2小胶质细胞活性，对细胞有激活活化作用，帕罗西汀能有效抑制lps诱导的活性变化，40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml浓度的hhz粗多糖有抑制lps诱导细胞激活的作用。以上各细胞组细胞活性均未显著降低，也提示各给药组并未造成各细胞毒性影响。
98.试验十二：细胞炎症因子tnf-α、il-6浓度
99.细胞炎症因子tnf-α、il-6浓度实验结果分析
100.酶联免疫吸附实验(elisa法)
101.取数生长期的bv2细胞均匀接种在96孔板上(6
×
103个/孔)，细胞培养贴壁底部60％进行药物干预，将培养的细胞分为空白对照组(control)、模型组(model)、阳性药组(par)、不同剂量给药组(dt-l、dt-m、dt-h)，除空白组以外，各组加入最终浓度为1μg/ml的lps，加入最终浓度为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml的hhz多糖，阳性药组加入最终浓度为5μm的帕罗西汀，干预24h后，取细胞上清。具体，hhz粗多糖样品加入磷酸盐平衡生理盐水溶解配制，得到上述不同浓度的hzz多糖。
102.实验前预先取出elisa试剂盒平衡至室温，按照说明书稀释试剂盒中的标准品，在酶标板上设置好包括空白孔在内的各组别位置，加入不同浓度的标准品100μl，其余孔加入样品，贴上封板膜37℃温育30min；稀释好洗涤液，小心的揭开封板膜，每孔加满洗涤液静置
30s后甩去洗涤液，在吸水纸上拍干液体，重复清洗5次；每孔加入50μl酶标试剂，空白孔不加入，贴上封板膜，37℃温育30min；按照上次清洗步骤重复清洗5次后，每孔加入50μl显色剂a，再加入50μl显色剂b，轻轻摇晃后置于检测37℃避光显色10min，此时可以看出颜色变化；最后加入50ul终止液终止反应，完成操作后及时使用酶标仪检测各孔od值。利用空白孔和预留的不同浓度标准品孔数据绘制标准曲线，计算各组数据对应炎症因子含量。试验结果见图15，经elisa法检测各组细胞上清液中tnf-α、il-6含量，显示lps组的细胞上清液中tnf-α、il-6含量显著增加，与lps组相比可见，阳性药帕罗西汀降低了2种炎症因子的浓度，hhz粗多糖各剂量组(20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml)也表现出显著的抗神经炎症活性。
103.总结，hhz粗多糖能抑制lps诱导的bv2小胶质细胞炎性反应，具有抗神经炎症活性。
104.试验十三：免疫荧光测定细胞形态和炎症因子浓度
105.细胞免疫荧光实验
106.取数生长期的bv2细胞均匀接种在已经铺好细胞爬片的12孔板上(2
×
104个/孔)，细胞培养至贴壁底部60％左右进行药物干预，将培养的细胞分为空白对照组(control)、模型组(model)、阳性药组(par)、不同剂量给药组(dt-l、dt-m、dt-h)，除空白组以外，各组加入最终浓度为1μg/ml的lps，加入最终浓度为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml的hhz多糖，阳性药组加入最终浓度为5μm的帕罗西汀。实验时弃去旧培养基，加入pbs清洗3次之后，加入4wt％多聚甲醛固定15min，使用37℃预热的pbs冲洗3次，加入0.2wt％ttitonx-100通透剂使细胞膜通透，30min后用pbs冲洗3次，加入pbs配置的5wt％正常血清封闭液，孵育1h；再使用tbst清洗3次随后加入使用5wt％山羊血清配置的1:500一抗300ul覆盖爬片，避光置于4℃冰箱中过夜；使用pbs清洗3次后，加入配置好的二抗覆盖爬片，37℃孵育1h，加入dapi孵育5min，再次使用pbs轻轻吹洗，小心地将细胞爬片抠起置于共聚焦皿中，加入抗荧光淬灭封片剂封片后，及时使用激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，结果见图16，结果表明，采用激光共聚焦进行细胞免疫荧光检测，结果显示hhz粗多糖在低、中、高三个剂量下，都能降低lps诱导的细胞炎症因子tnf-α、il-6水平。
107.试验十四：小鼠炎性抑郁模型建立及hhz多糖的给药
108.实验动物采取雄性、7周龄c57小鼠。所有小鼠自由摄食饮水，采用12h的昼夜周期(8：00-20：00为夜，20：00-8：00为白昼。)
109.造模开始前，各组小鼠均安排一次糖水偏好实验，并剔除一些糖水偏好系数较低或较高的小鼠。把筛选后的小鼠随机分成空白组(control)、模型组(lps)、阳性对照组(par)、hhz多糖低剂量组(dt-l)、hhz多糖中剂量组(dt-m)、hhz多糖高剂量组(dt-h)。空白组给予充足的粮食和水，灌胃生理盐水，模型组腹腔注射(lps 1mg/kg)，同时用生理盐水灌胃，其余给药组腹腔注射lps并灌胃处理，造模共持续9d。所有小鼠每日测量记录一次体重。造模结束后，所有小鼠开始行为学测试并解剖取材，流程如图17。
110.试验十五：小鼠旷场实验
111.旷场结果分析
112.行为学检测方法：旷场装置为黑色木质敞箱，长42cm、宽42cm、高40cm。底面中央位置用白线画20
×
20cm的方格。将小鼠放于旷场中央方格，记录6min内小鼠在中央方格的停留时间以及小鼠在旷场内的运行轨迹。用smart软件进行录像分析。每只小鼠测试完毕需要
用酒精擦洗箱底。
113.实验结果以平均值
±
标准误差表示，以t检验统计处理。
114.旷场实验为经典的抗抑郁筛选模型，有效的抗抑郁药物会增加小鼠在中央的运动距离。如图18所示，hhz多糖组与模型组对比显著的增加了小鼠在中央的运动距离(p《0.05)。说明hhz多糖可以增加旷场实验中小鼠在中央的运动距离。
115.试验十六：小鼠悬尾实验
116.悬尾实验结果分析
117.行为学检测方法:根据european journal of pharmacology，2001，415:197中记载的实验方法构建小鼠悬尾实验模型，将小鼠倒吊于距地面60cm的横杆上6min，小鼠的固定位点为距尾稍1cm处，适应1min后，观察后5min小鼠不动时间，不动状态定义为小鼠停止挣扎，躯体呈放松状态。
118.实验结果以平均值
±
标准误差表示，以t检验统计处理。
119.小鼠悬尾实验为经典的筛选抗抑郁药实验模型，小鼠悬尾一段时间后呈现绝望状态，停止挣扎。有效的抗抑郁药物会使小鼠悬尾过程中不动时间缩短。如图19所示，本实验研究表明hhz多糖可以显著缩短小鼠悬尾过程中不动时间(p《0.05)。说明hhz多糖可以缩短小鼠悬尾过程中的不动总时间。
120.试验十七：小鼠高架十字迷宫
121.高架十字迷宫实验结果分析
122.高架十字迷宫(evated plus maze，epm)实验：将小鼠从迷宫中央广场处放入，每次一只小鼠，之后密闭迷宫帷幕。利用高清视频软件观测5min内小鼠在迷宫中的活动情况，记录行为学数据。每次试验结束后，清除迷宫中小鼠排泄物，并用酒精棉对迷宫进行擦拭，以消除小鼠的气味，之后进行下一次实验。
123.实验结果以平均值
±
标准误差表示，以t检验统计处理。
124.高架十字实验为经典的筛选抗抑郁药实验模型，将小鼠放入十字迷宫的中央处，记录和观察小鼠在十字迷宫中开合臂的停留时间。如图20所示本实验研究表明hhz多糖可以显著提高小鼠在高架十字迷宫中在开合臂的停留时间不动时间(p《0.05)实验十八：小鼠肠道粪样的dna提取与16s rrna测序实验
125.小鼠肠道粪样的dna提取与16s rrna测序实验结果分析
126.实验前准备好要用的实验用具进行高温高压门灭菌，如冻存管、镊子、棉签等，佩戴一次性实验手套用75wt％的酒精喷洒擦拭手部消毒，使用棉签蘸取75wt％酒精将小鼠肛门四周涂抹消毒，然后用无菌棉棒轻柔地按压小鼠下腹部帮助小鼠自然排便，用高温高压灭菌后的镊子在小鼠肛门处直接夹取自然排出的粪便，立即装入冻存管用封口膜密封并做好标记，平均每个冻存管中采集1-3颗粪便。采集control组、model组、dth组后立即将冻存管存置于-80℃冰箱保存。
127.将粪便样品的dna提取后进行pcr扩增与产物纯化，使用illumina公司的miseq pe300测序仪测序，然后进行物种组成分析，如图21属分类水平群落柱形图结果所示，将model组与control组相比较，model组中的艾克曼菌属(akkermansia)、粪杆菌属(faecalibaculum)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、毛螺菌科nk4a136组(lachnospiraceae_nk4a136_group)的丰富度都有增加，而norank_f_muribaculaceae等丰
富度下降，与control比较，dth组毛螺菌科nk4a136组增加；norank_f_muribaculaceae降低；与model组相比，dth组毛螺菌科nk4a136组增加，粪杆菌属降低。可得出hhz粗多糖可以通过升高或降低某些菌的丰富度来治疗lps诱导的大鼠神经炎性抑郁。
128.经过以上体外、体内实验相结合，证明了hhz多糖有益于增加lps诱导bv2细胞炎症的细胞存活率、对细胞分化程度起到减缓作用，同时可以抑制相关炎症因子的表达。旷场实验中小鼠在中央的运动距离，缩短小鼠悬尾过程中的不动总时间，并提高了小鼠在高架十字迷宫中开合臂的停留时间，表现出抗炎性抑郁的活性。hhz粗多糖还可以改善肠道微生态来治疗lps诱导的大鼠神经炎性抑郁。综上所述，hhz多糖对炎性抑郁具有确切的疗效，同时，hhz多糖属于纯天然提取物，副作用小，使用安全、方便，作为预防、治疗抑郁、焦虑症以及神经炎症具有重大的意义。
129.因此，可以有科学地推断出海藻原料药、海藻提取物及抗神经炎症药物及包含上述三种成分的中药复方及其药学上可接受的活性成分组成的药用组合物等，可以通过口服或者局部给药，其剂型可以是片剂、胶囊、溶液、混悬液、注射液、冻干粉等药学上可以接受的剂型。
130.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。