一种中药组合物在制备抗合胞病毒药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药领域，具体而言是涉及一种中药组合物在制备抗合胞病毒药物中的应用。


背景技术：

2.克感利咽口服液，见中国药典2015年版一部928页(2020年版一部994页)，处方：金银花72g、黄芩72g、荆芥72g、炒栀子72g、连翘72g、玄参72g、僵蚕43g、地黄108g、射干22g、桔梗43g、薄荷43g、蝉蜕43g、防风43g、甘草22g。其制法：以上十四味，金银花、荆芥、防风、薄荷提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；黄芩加65％乙醇加热回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，药渣备用，滤液回收乙醇，加水适量，煮沸，趁热过滤，滤液备用；取黄芩药渣及金银花等提取挥发油后的药渣与其余炒栀子等九味，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至在相对密度1.06～1.11(70℃)的清膏，加入乙醇使含醇量达60％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.16～1.20(70℃)的清膏，加上述金银花等挥发油(加适量聚山梨酯80混匀)，蒸馏后的水溶液，黄芩乙醇提取液及甜菊素0.5g，苯甲酸钠3g，用碳酸钠调节ph值，加水调整总量至1000ml，搅匀，滤过，灌封，灭菌，即得。
3.克感利咽口服液的功能是疏风清热，解毒利咽。主要用于风热外侵，邪热内扰所致发热、微恶风，头痛，咽痛，鼻塞流涕，咳嗽痰黏，口渴，溲黄；感冒见上述证候者。
4.克感利咽制剂的新用途有如下报道：
5.禽流感：200910039349.5(公开号为cn101564475a)公开了克感利咽口服液治疗禽流行性感冒的新用途，其中禽流行性感冒主要是由禽流感病毒如h9n2 aiv病毒引起。
6.手足口病：201310015183.x(公开号为cn103070991a)公开了克感利咽口服液治疗手足口病的新用途，手足口病是由多种肠道病毒如ev71引起。
7.革登热：201810168916.6(公开号为cn110201068a)公开了克感利咽组合物或制剂治疗登革热病的新用途，登革热病是由denv-1病毒引起的。
8.新型冠状病毒：202011356233.7(公开号为cn112316032a)公开了克感利咽中药组合物治疗新型冠状病毒的新用途。新型冠状病毒肺炎(novel coronary pneumonia，ncp，简称为新冠肺炎)是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome corona virus 2，sars-cov-2)感染引起的一种急性呼吸道传染病。
9.合胞病毒，即呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,rsv)，属于副黏病毒科的肺病毒属(pneumovirus)，只有一种血清型。目前rsv的治疗方法主要是抗病毒治疗，例如利巴韦林等。利巴韦林为常见抗病毒药，但是有贫血、乏力、导致胚胎畸形等严重不良反应。


技术实现要素：

10.本技术是在现有技术的基础上，提供一种治疗rsv的更加安全有效的中药组合物。
11.本技术的中药组合物，即克感利咽组合物，由下列重量份配比的原料药制成：金银花36～145份、黄芩36～145份、荆芥36～145份、栀子36～145份、连翘36～145份、玄参36～145份、僵蚕22～85份、地黄55～215份、射干11～45份、桔梗22～85份、薄荷22～85份、蝉蜕22～85份、防风22～85份、甘草11～45份。
12.进一步的，本技术的中药组合物，由下列重量份配比的原料药制成：金银花53.54～86.70份、黄芩53.54～86.70份、荆芥53.54～86.70份、栀子53.54～86.70份、连翘53.54～86.70份、玄参53.54～86.70份、僵蚕33.57～51.55份、地黄86.27～129.81份、射干17.54～26.70份、桔梗33.57～51.55份、薄荷33.57～51.55份、防风33.57～51.55份、蝉蜕33.57～51.55份、甘草17.54～26.70份。
13.更进一步的，本技术的中药组合物，由下列重量份配比的原料药制成：金银花69～75份、黄芩69～75份、荆芥69～75份、栀子69～75份、连翘69～75份、玄参69～75份、僵蚕40～47份、地黄100～115份、射干20～25份、桔梗40～47份、薄荷40～47份、蝉蜕40～47份、防风40～47份、甘草20～24份。
14.最佳的，本技术的中药组合物由下列重量份配比的原料药制成：金银花72份、黄芩72份、荆芥72份、栀子72份、连翘72份、玄参72份、僵蚕43份、地黄108份、射干22份、桔梗43份、薄荷43份、蝉蜕43份、防风43份、甘草22份。
15.本技术的中药组合物，其中，栀子为炒栀子，僵蚕为姜制僵蚕。
16.所述药物是由中药组合物和药学上可接受的辅料组成。
17.所述中药组合物可以是直接粉碎后混合，或提取得到活性提取物。
18.本技术所述中药组合物的提取方法，可采用药典中克感利咽口服液的提取方法，或者背景技术中所提到的专利中的方法进行提取，或者按照如下方法进行提取：
19.按照配比称取中药，金银花、荆芥、防风、薄荷提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；黄芩加65％乙醇加热回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，药渣备用，滤液回收乙醇，加水适量，煮沸，趁热过滤，滤液备用；取黄芩药渣及金银花等提取挥发油后的药渣与其余炒栀子等九味，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至在相对密度1.06～1.11(70℃)的清膏，加入乙醇使含醇量达60％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.16～1.20(70℃)的清膏；加上述金银花等挥发油，蒸馏后的水溶液，黄芩乙醇提取液，混匀，既得。
20.本技术所述药物是以常规的中药制剂方法制备成任何一种常用剂型，如片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、散剂、胶囊剂、软胶囊、丸剂、冲剂、口服液、颗粒剂、滴丸剂、微丸、肌注剂、滴注剂、膏剂、软膏剂、硬膏剂等。
21.最佳制成片剂、滴丸、口服液、颗粒剂、胶囊、软胶囊。
22.根据本领域的普通技术知识和现有技术，本发明所涉及的治疗包括预防和既定疾病或症状的治疗。而且，用于治疗所需的本发明药物活性提取物的量应根据所治疗病症的性质和患者条件而异，或遵医嘱。一般来说，用于成人治疗的剂量通常将在0.02-5000mg/天的范围，优选1-1500mg/天。所需剂量可以是单一的剂量或多次的剂量，按适当的间隔给药，例如每天给予一次、两次、三次、四次或更多。根据本发明的制剂可以含有0.1-99wt％的活性成分。
23.本技术请求保护本技术中药组合物在制备抗合胞病毒的药物中的用途。
24.本技术的中药组合物所述抗合胞病毒的用途，包括治疗合胞病毒引起的咽部症状。
25.本技术的中药组合物所述抗合胞病毒的用途，包括治疗合胞病毒引起的炎症。
附图说明
26.图1克感利咽组合物对细胞毒性检测结果。
27.图2克感利咽对呼吸道合胞病毒rsv药效检测结果。
28.图3克感利咽对呼吸道合胞病毒rsv炎症药效：与病毒对照组比较，***p＜0.001
具体实施方式
29.以下通过实施例进一步阐述本发明药物的制备方法。
30.实施例1：本技术中药组合物的制备方法
31.a.取金银花72g、黄芩72g、荆芥72g、栀子72g、连翘72g、玄参72g、僵蚕43g、地黄108g、射干22g、桔梗43g、薄荷43g、蝉蜕43g、防风43g、甘草22g备用；
32.b.以上十四味，金银花、荆芥、防风、薄荷提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；黄芩加65％乙醇加热回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，药渣备用，滤液回收乙醇，加水适量，煮沸，趁热过滤，滤液备用；取黄芩药渣及金银花等提取挥发油后的药渣与其余炒栀子等九味，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至在相对密度1.06～1.11(70℃)的清膏，加入乙醇使含醇量达60％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.16～1.20(70℃)的清膏，加上述金银花等挥发油(加适量聚山梨酯80混匀)，蒸馏后的水溶液，黄芩乙醇提取液，混匀，既得浸膏；
33.c.口服液制剂：将步骤2制备的浸膏与甜菊素0.5g，苯甲酸钠3g，用碳酸钠调节ph值，加水调整总量至1000ml，搅匀，滤过，灌封，灭菌，即得。
34.实验例1：本技术中药组合物体外对呼吸道合胞病毒(rsv)的抗病毒及抗炎作用
35.一、实验目的
36.在细胞水平评价本技术中药组合物抗呼吸道合胞病毒(rsv)的效果。
37.二、实验材料：
38.1.受试药物：本技术中药组合物(克感利咽浸膏，按照实施例1中的方法进行制备)，由广州王老吉药业股份有限公司提供，批号：191201，药物名称及浓度见表3。阳性对照药普沙托韦presatovir(gs-5806)，购自吉利德公司，货号gc32069-5。
39.2.细胞：hep-2细胞，由广州呼吸健康研究院呼吸疾病国家重点实验室病毒室保存。
40.3.病毒：呼吸道合胞病毒rsv，由广州呼吸健康研究院呼吸疾病国家重点实验室病毒室-80℃保存；使用病毒滴度为100tcid
50
。
41.4.试剂及耗材
42.5.
43.表1：常用试剂及耗材列表
[0044][0045]
6.主要仪器
[0046]
表2：主要仪器列表
[0047][0048]
三、实验方法：
[0049]
(一)细胞毒性试验(mtt法)
[0050]
(1)受试药物：
[0051]
表3：药物名称、实验浓度和分组
[0052][0053]
(2)无菌96孔培养板,每孔加入100μl浓度为2
×
105cells/ml hep-2细胞，37℃5％co2培养24小时；
[0054]
(3)96孔板单层细胞用pbs洗涤1次，每孔加入100μl 2倍梯度稀释的药物。空白对照组和细胞对照组每孔加入等体积培养液，37℃培养72小时；
[0055]
(4)每孔加入浓度为5m
ɡ
/ml的mtt溶液20μl，继续孵育4小时。弃上清，每孔加入100μl dmso，低速振荡5分钟，使结晶物充分溶解；
[0056]
(5)选择490nm波长，在酶联免疫仪上测定吸光值，计算抑制率。存活率＝(值实验组平均od值－空白组平均od)/(细胞对照组平均od值－空白对照组平均od值)
×
100％。reed-meunch法计算药物半数毒性浓度(tc
50
)。
[0057]
(6)实验条件：以上实验操作均在bsl-2实验室内完成。
[0058]
(二)受试药物抗病毒实验
[0059]
(1)受试药物：
[0060]
表4：药物名称、实验浓度和分组
[0061][0062]
(2)无菌96孔培养板，每孔加入100μl浓度为2
×
105cells/ml hep-2细胞，37℃5％co2培养24小时；
[0063]
(3)培养板实验组和病毒对照组加入2％血清培养基稀释的100tcid
50
病毒液100μl/孔，细胞对照组加入等体积2％血清培养基，37、5％co2培养箱吸附2h。
[0064]
(4)2h后，弃去96孔培养板中细胞培养液；受试药物使用2％血清培养基稀释成表4中的各个浓度，每个浓度3个复孔，100μl/孔加入上述药液；
[0065]
(5)细胞对照组和病毒对照组加入等体积2％血清培养基；
[0066]
(6)细胞37℃5％co2孵箱72小时；
[0067]
(7)每孔加入浓度为5m
ɡ
/ml的mtt溶液20μl，继续孵育4小时。弃上清，每孔加入100μl dmso，低速振荡5分钟，使结晶物充分融解；
[0068]
(8)选择490nm波长，在酶联免疫仪上测定吸光值，计算抑制率。抑制率＝(实验组平均od值－病毒对照组平均od值)/(细胞对照组平均od值－病毒对照组平均od值)
×
100％。能够抑制50％及以上病毒引起的细胞病变(cpe)的药物浓度视为有效浓度，采用
reed-muench法或graphpad prism8.0计算半数抑制浓度(ic
50
)。
[0069]
(9)实验条件：以上实验操作均在bsl-2实验室内完成。
[0070]
(三)rt-qpcr检测炎症因子
[0071]
(1)受试药物：
[0072]
表5：药物名称、实验浓度和分组
[0073][0074]
(2)hep-2细胞接种至6孔板中，分为细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和实验组。细胞长至单层后，弃去培养液，用pbs洗一次，病毒对照组、阳性对照组和实验组使用含2％血清培养基稀释并接种100tcid
50
的呼吸道合胞病毒(rsv)，正常组加入含2％血清培养基，37℃吸附2小时。
[0075]
(3)弃去病毒液，实验组加入含不同浓度药物的2％血清培养基2ml，阳性对照组加入含10nm gs-5806的2％血清培养基2ml，正常组和病毒组加入等体积含2％血清培养基。37℃作用48小时后，弃上清，pbs洗细胞一次，加入trizol试剂裂解细胞并转移至1.5ml ep管。
[0076]
(4)rna的提取
[0077]
向细胞中加入氯仿200μl，震荡15s，在室温孵育5min，4℃、10000rpm离心10min；离心后，取上清至新的1.5ml ep管中，加入异丙醇500μl，室温孵育10min，4℃、10000rpm离心10min；离心弃上清后加入75％乙醇1000μl混匀，4℃、10000rpm离心10min；弃上清，室温中放置5min，加入适量无rna酶的ddh2o溶解rna，检测rna浓度并进行逆转录cdna。
[0078]
(5)样本rna的逆转录
[0079]
mrna逆转录成cdna；配置逆转录反应体系如下：
[0080][0081]
逆转录反应条件如下：
[0082][0083]
(6)实时荧光定量pcr检测
[0084]
反应体系如下：
[0085][0086]
pcr反应条件如下：
[0087][0088]
(7)引物的设计和合成
[0089]
利用引物设计软件primer premier 5.0进行引物设计，将设计好的提交给life公司合成，引物序列如下：
[0090][0091]
(8)实验条件：以上实验操作均在bsl-2实验室内完成。
[0092]
(四)抗病毒药效结果判定标准：能够抑制50％及以上病毒引起的细胞病变(cpe)的药物浓度视为有效浓度,，以选择指数判定药效标准，si》1表示有效，选择指数越大，抗病毒效果越好。
[0093]
四、实验结果
[0094]
(一)药物毒性
[0095]
mtt实验结果如表6所示。实验结果表明，在hep-2细胞中，本技术中药组合物半数毒性浓度(tc
50
)为3.71m
ɡ
生药/ml(图1)。
[0096]
表6克感利咽对细胞毒性检测结果
[0097][0098]
由图1可知，最低药物浓度细胞存活率为108.56
±
6.29％。
[0099]
(二)抗病毒药效
[0100]
通过mtt法测试吸光值并记录实验结果，如表7所示。采用reed-muench法或graphpad prism 8.0计算半数抑制浓度(ic
50
)，本技术中药组合物在此次实验的治疗模式中ic
50
为207.1μ
ɡ
生药/ml(图2)，si为17.91。
[0101]
表7克感利咽对呼吸道合胞病毒rsv药效检测结果
[0102][0103]
(三)炎症细胞因子的结果
[0104]
通过rt-qpcr检测细胞因子mrna的表达，采用graphpad prism 8.0分析计算结果如表8及图3所示。
[0105]
表8各实验组对细胞因子mrna的表达的影响
[0106][0107][0108]
五、结论
[0109]
上述实验结果表明克感利咽在体外对呼吸道合胞病毒(rsv)感染hep-2细胞致细胞病变具有抑制作用(选择指数si为17.91)；体外能抑制呼吸道合胞病毒(rsv)诱导炎症因子il-6、il-8和tnf-α的mrna过度表达，具剂量依赖关系。