一种具有抗炎、舒缓、修护功效的绿豆发酵液、混合发酵液及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及化妆品技术领域，尤其是一种具有抗炎、舒缓、修护功效的绿豆发酵液、混合发酵液及其制备方法与应用。


背景技术：

2.生物发酵是将微生物与发酵的原料混合，经过特殊的发酵条件，微生物体内特定的酶可以将原料中的某些物质进行分解，从而使得发酵物中含有大量的小分子物质。广大的原料公司和化妆品公司将发酵物作为功能性原料加入至护肤品，比如sk-ii的护肤精华露中加入半乳糖酵母样菌发酵滤液、馥蕾诗红茶紧致面膜中加入红茶酵素等等。
3.目前，市场上很多人以植物为原料进行发酵，制备得到具有功效的组合物。然而，上述组合物能实现的效果仍较差。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有抗炎、舒缓、修护功效的绿豆发酵液、混合发酵液及其制备方法与应用。
5.为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种具有抗炎、舒缓、修护功效的绿豆发酵液的制备方法，包括以下步骤：
6.(1)将发芽绿豆加入至液体培养基中，得到发芽绿豆发酵培养基；
7.(2)将乳酸菌种子液接入至发芽绿豆发酵培养基中发酵，灭活处理、纯化处理后得到绿豆发酵液。
8.本发明通过大量试验得知，选用乳酸菌对发芽绿豆进行发酵，得到的绿豆发酵液中活性物质含量较高，绿豆发酵液的抗炎、舒缓、修护功效最好。
9.优选地，所述步骤(1)中，发芽绿豆的制备方法为：将绿豆和水混合均匀，发芽，得到所述发芽绿豆；其中，绿豆和水的质量比为绿豆：水＝1:(1.5-5)，发芽的温度为28-60℃，发芽的相对湿度为65％-95％，发芽的时间为24-72h；进一步优选地，绿豆和水的质量比为绿豆：水＝1:3，发芽的温度为40℃，发芽的相对湿度为90％，发芽的时间为48h。
10.发明人经过大量实验探究后发现，在绿豆发芽的过程中，绿豆和水的质量比、发芽温度和湿度均会影响绿豆的发芽效果，影响发芽绿豆中大量复杂的生理生化变化，最终影响发酵液中活性物质的含量及功效。
11.优选地，所述步骤(1)中，发芽绿豆占所述发芽绿豆发酵培养基的总质量百分比为0.5％-30％；进一步优选地，发芽绿豆占所述发芽绿豆发酵培养基的总质量百分比为0.5％-15％；更优选地，发芽绿豆占所述发芽绿豆发酵培养基的总质量百分比为0.5％-10％；液体培养基为麦芽汁液体培养基、马铃薯培养基、高氏一号培养基、孟加拉红培养基、lb肉汤培养基中的至少一种。
12.优选地，所述步骤(2)中，乳酸菌种子液的接种量为所述发芽绿豆发酵培养基的质
量百分比的1％-5％；乳酸菌种子液为植物乳杆菌种子液、鼠李糖乳杆菌种子液、干酪乳杆菌种子液、约氏乳杆菌种子液、戊糖乳杆菌种子液中的至少一种；进一步优选地，乳酸菌种子液为植物乳杆菌种子液。
13.优选地，所述步骤(2)中，乳酸菌种子液的制备方法，包括如下步骤：将乳酸菌种配制成乳酸菌悬液，将所述乳酸菌悬液接种于固体培养基活化培养，得到活化的乳酸菌，将活化的乳酸菌接种至种子培养基中进行扩大培养，得到所述乳酸菌种子液。
14.优选地，所述步骤(2)中，在发酵罐中发酵，发酵罐内搅拌桨的转速为50-350r/min，发酵培养的温度为27-40℃，发酵的时间为24-96h；灭活处理的温度为90-125℃，灭活处理的时间为1-40min，纯化处理包括对所述绿豆发酵液进行过滤去渣或过微滤膜；进一步优选地，发酵培养的温度为37℃，发酵的时间为48h；所述过微滤膜的步骤包括将所述发酵液依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱以除去所述绿豆发酵液的杂质。
15.发明人发现，纯化处理可以去除发酵液中的杂质，提高活性物质在绿豆发酵液中的浓度，降低绿豆发酵液对皮肤的刺激性。
16.此外，本发明提供了采用上述制备方法制备得到的具有抗炎、舒缓、修护功效的绿豆发酵液。
17.进一步地，本发明提供了所述具有抗炎、舒缓、修护功效的绿豆发酵液在化妆品中的应用。
18.另外，本发明提供了一种具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液的制备方法，包括以下步骤：
19.(a)将发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英加入至液体培养基中，得到混合发酵培养基；
20.(b)将乳酸菌种子液接入至所述混合发酵培养基中发酵，灭活纯化后得到混合发酵液。
21.绿豆，又名青小豆、植豆，生育期短，适应性广，是一种可作为粮、肥、药、菜及饮料加工等多种用途的作物，被誉为粮食中的“绿色珍珠”。我国栽培绿豆已有2000多年的历史，主产区主要集中在黄河、淮河流域及东北地区。《本草纲目》中记载“绿豆，消肿治痘之功虽同于赤豆，而压热解毒之力过之。且益气、厚肠胃、通经脉，无久服枯人之忌。外科治痈疽，有内托护心散，极言其效。”并可“解金石、砒霜、草木一切诸毒”。金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属多种植物的干燥花蕾和带初开的花，故又名忍冬。在我国资源分布广阔，属于卫生部颁布的药食同源资源，是传统的清热解毒药材。金银花中的化学成分主要含有机酸、挥发油和黄酮类物质，并含20％总蛋白质和多种维生素和矿物质元素。积雪草又称雷公根，铜钱草，马蹄草，为伞形科积雪草属植物，分布于中国多省区。喜生于阴湿的草地或水沟边；海拔200-1900米。全草入药，具有清热利湿、解毒消肿、活血利尿之功效，临床用于治疗湿热黄疸、痈疮肿毒、跌打损伤、外伤出血等。蒲公英别名黄花地丁、婆婆丁、华花郎，属多年生草本植物，在我国各地均有分布，是一种常用清热解毒中药，除了有效成分绿原酸之外，其中的黄酮也引起了人们的关注。黄酮是一种生物活性物质，具有杀虫抑菌、扩张血管、利胆护肝、祛痰止咳、抗癌等多种功效。
22.本发明将绿豆、金银花、积雪草、蒲公英共同发酵，得到的混合发酵液富含活性物质，具有抗炎、舒缓、修护的功效。与此同时，本发明提供的微生物发酵方法采用的菌种是人
体可食用菌种，得到的混合发酵液对人体无害，卫生安全，环保无污染。
23.在本发明中，具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液是基于中药“君臣佐使”组方原理将四个原料进行配伍运用，以达到最佳使用功效。化妆品中的君药指对症状起主要治疗作用的药物；臣药指促进透皮吸收的药物，使药达所病；佐药指配合君臣药治疗兼证的药物；使药指具有营养与代谢基本作用的药物。以绿豆为君药，绿豆具有较好的清热解毒、消炎舒缓的功效；以蒲公英为臣药，蒲公英具有增加皮肤通透性、消炎护肤、平衡油脂分泌的作用；以金银花为佐药，金银花具有抗炎、抗敏的生物活性，可修复受损的肌肤；以积雪草为使药，积雪草可祛除老化的角质层，促进皮肤新陈代谢，增加皮肤弹性，并补充营养素。
24.本发明采用微生物发酵的工艺，以乳酸菌共生发酵发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英，获得具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液。本发明制备具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液的过程是一个环境友善的绿色安全过程。混合发酵液的制备过程中不使用有机溶剂，卫生安全，环保无污染反应条件温和、操作简单、成本较低，适合应该用于工业生产。
25.优选地，所述步骤(a)中，发芽绿豆的制备方法为：将绿豆和水混合均匀，发芽，得到发芽绿豆；其中，绿豆和水的质量比为绿豆：水＝1:(1.5-5)，发芽的温度为28-60℃，发芽的相对湿度为65％-95％，发芽的时间为24-72h；进一步优选地，绿豆和水的质量比为绿豆：水＝1:3，发芽的温度为40℃，发芽的相对湿度为90％，发芽的时间为48h。
26.优选地，所述步骤(a)中，液体培养基为麦芽汁液体培养基、马铃薯培养基、高氏一号培养基、孟加拉红培养基中的至少一种。
27.优选地，所述步骤(a)中，发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英的混合物占所述混合发酵培养基的总质量百分比为0.5％-30％；优选地，发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英的混合物占所述混合发酵培养基的总质量百分比为0.5％-15％。
28.优选地，所述步骤(a)中，发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英的质量比为发芽绿豆:金银花:积雪草:蒲公英＝(70-75):(7-9)：(8-10)：(1.2-2.3)；优选地，发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英的质量比为发芽绿豆:金银花:积雪草:蒲公英＝(71-74):(8-8.5)：(9-9.5)：(1.5-1.9)；更优选地，发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英的质量比为发芽绿豆:金银花:积雪草:蒲公英＝72.88:8.3:9.24:1.8。
29.所述步骤(b)中，乳酸菌种子液的接种量为所述混合发酵培养基的质量百分比的1％-5％；乳酸菌种子液为植物乳杆菌种子液、鼠李糖乳杆菌种子液、干酪乳杆菌种子液、约氏乳杆菌种子液、戊糖乳杆菌种子液中的至少一种；进一步优选地，乳酸菌种子液为植物乳杆菌种子液。
30.优选地，所述步骤(b)中，乳酸菌种子液的制备方法，包括如下步骤：乳酸菌种配制成乳酸菌悬液，将所述乳酸菌悬液接种于固体培养基活化培养，得到活化的乳酸菌，将活化的乳酸菌接种至种子培养基中进行扩大培养，得到所述乳酸菌种子液。
31.优选地，所述步骤(b)中，在发酵罐中发酵，发酵罐内搅拌桨的转速为50-350r/min，发酵培养的温度为28-42℃，发酵的时间为24-96h，发酵培养的ph为5.0-7.5；灭活处理的温度为90-125℃，灭活处理的时间为1-40min，纯化处理包括对所述绿豆发酵液进行过滤去渣或过微滤膜；进一步优选地，发酵培养的温度为37℃，发酵的时间为50h；所述过微滤膜的步骤包括将所述混合发酵液依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱以除去所
述混合发酵液的杂质。
32.发明人经过大量实验探究后发现，在上述温度和ph范围内，乳酸菌的繁殖速度较快，得到的发酵液活性物质较多。
33.此外，本发明提供了采用上述制备方法制备得到的具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液。
34.进一步地，本发明提供了所述具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液在化妆品中的应用。优选地，本发明提供了所述具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液在柔肤水类、乳液类、膏霜类、啫喱类、粉类、喷雾类、精华类、洗护类化妆品中的应用。进一步优选地，所述具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液在化妆品中的的添加量为1-30％。
35.相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明提供的制备方法得到的混合发酵液中富含绿豆、金银花、积雪草、蒲公英的活性物质。植物提取物中活性物质的提取效率明显高于水提法和超声辅助提取法的提取效率，有利于植物提取物中活性物质的充分提取与应用。(2)将多种植物与益生菌或食品发酵常用菌种共生发酵，避免了单独将每一种植物进行发酵，大大简化了制备工艺，缩短制程时间，降低生产成本，适合规模化生产。(3)本发明提供的具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液的制备过程不使用任何有机溶剂，卫生安全，环保无污染，适合应该用于工业生产。(4)本发明提供的由多种植物共同发酵得到的混合发酵液具有抗炎、舒缓、修护功效，适合应用于无刺激安全化妆品护理产品。
具体实施方式
36.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
37.实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；本发明实施例及对比例所用乳酸菌均购于广东省微生物菌种保藏中心。
38.实施例1-21及对比例1-3
39.一种具有抗炎、舒缓、修护功效的绿豆发酵液的制备方法，包括以下步骤：
40.(1)将发芽绿豆加入至液体培养基中，制备发芽绿豆发酵培养基；
41.(2)将乳酸菌种子液接入至所述发芽绿豆发酵培养基中发酵，灭活处理、纯化处理后得到绿豆发酵液。
42.步骤b11；发芽绿豆的制备方法为：在托盘平铺一湿润毛巾作为铺底，将绿豆平铺在毛巾上，在托盘中加入水将绿豆浸润，再在绿豆表面覆盖以湿润的毛巾进行发芽，得到发芽绿豆。
43.其中，在本发明中，绿豆平铺的厚度为1-2cm，绿豆和水的质量比为绿豆：水＝1:(1.5-5)，发芽的温度为28-60℃，发芽的相对湿度为65％-95％，发芽的时间为24-72h；进一步优选地，绿豆和水的质量比为绿豆：水＝1:3，发芽的温度为40℃，发芽的相对湿度为90％，发芽的时间为48h。
44.步骤b12；本发明中，发芽绿豆加入至液体培养基中的具体方法为：使用粉碎机将发芽绿豆打碎并加入至液体培养基中，混合均匀。将混合发芽绿豆的液体培养基通过高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌的温度为110-130℃，高压蒸汽灭菌的时间为20-60min，降温至室
温，得到发芽绿豆发酵培养基。
45.发芽绿豆占所述发芽绿豆发酵培养基的总质量百分比为0.5％-30％；进一步优选地，发芽绿豆占所述发芽绿豆发酵培养基的总质量百分比为0.5％-15％；更优选地，发芽绿豆占所述发芽绿豆发酵培养基的总质量百分比为0.5％-10％；液体培养基为麦芽汁液体培养基、马铃薯培养基、高氏一号培养基、孟加拉红培养基、lb肉汤培养基中的至少一种。
46.液体培养基可以通过以下步骤制备得到：
47.麦芽汁液体培养基的配置方法为(以制备1l的麦芽汁液体培养基为例)：将10g至30g麦芽提取物，10g至30g葡萄糖，10g至30g蛋白胨溶解于纯化水中，并定容至1l，110℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。
48.高氏一号培养基的配置方法为(以制备1l的高氏一号培养基为例)：可溶性淀粉10g至30g、kno
3 1g至5g、k2hpo
4 0.1g至1g、mgso4·
7h2o 0.5g至2g、nacl 0.5g至1g、feso
4 0.01g至0.5g，蒸馏水加至1l，110℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。
49.马铃薯培养基的配置方法为(以制备1l的马铃薯培养基为例)：马铃薯150g至200g、蛋白胨3g至5g、无水葡萄糖10g至30g、酵母膏1g至3g、kh2po40.5g至1g、mgso4·
7h2o 0.5g至3.0g，蒸馏水加至1l，110℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。
50.孟加拉红培养基的配置方法为(以制备1l的孟加拉红培养基为例)：蛋白胨5g至10g、葡萄糖10g至20g、kh2po
4 1g至3g、mgso4·
7h2o 0.5g至3g、氯霉素0.1g至0.5g、1/3000孟加拉红溶液100ml至200ml，蒸馏水加至1l，120℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。
51.步骤b21；移取乳酸菌种子液至发酵罐的液态发酵培养基中，通过搅拌桨搅动发酵罐内的液态发酵培养基进行发酵培养，得到绿豆发酵液。
52.乳酸菌种子液的接种量为所述发芽绿豆发酵培养基的质量百分比的1％-5％；所述乳酸菌为植物乳杆菌(gdmcc 1.140)、鼠李糖乳杆菌(gdmcc1.320)、干酪乳杆菌(cgmcc1.159)、约氏乳杆菌(gdmcc 1.730)、戊糖乳杆菌(gdmcc 1.524)菌种中的至少一种；进一步优选地，乳酸菌为植物乳杆菌(gdmcc 1.140)。
53.在发酵罐中发酵，发酵罐内搅拌桨的转速为50-350r/min，发酵培养的温度为27-40℃，发酵的时间为24-96h；进一步优选地，发酵培养的温度为37℃，发酵的时间为48h。
54.步骤b22；对绿豆发酵液进行灭活处理和纯化处理。
55.灭活处理的温度为90-125℃，灭活处理的时间为1-40min，纯化处理包括对所述绿豆发酵液进行过滤去渣或过微滤膜；进一步优选地，所述过微滤膜的步骤包括将所述发酵液依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱以除去所述绿豆发酵液的杂质。
56.其中，乳酸菌种子液的制备方法，包括如下步骤：步骤b211：将乳酸菌种配制成乳酸菌悬液。
57.其中，步骤b211中，溶剂为无菌水。乳酸菌的质量百分比为0.01％至2％；
58.步骤b212：将乳酸菌悬液接种于固体培养基活化培养，得到活化的乳酸菌。
59.其中，步骤b212中，活化培养的温度为27-40℃，活化培养的时间为24-96h。乳酸菌悬液的移取量为10-50μl，固体培养基选自马铃薯葡萄糖琼脂培养基和/或drbc琼脂固体培养基。
60.马铃薯葡萄糖琼脂培养基、drbc琼脂固体培养基可以采用以下步骤制备得到，本发明中以制备1l的马铃薯葡萄糖琼脂培养基和1l的drbc琼脂固体培养基为例，在实际制备
固体培养基时，可以依据实际的需求调整上述原料的添加量，本发明中原料的添加量并不以此为限：
61.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(以制备1l的马铃薯葡萄糖琼脂培养基为例)的制备步骤为：将新鲜马铃薯洗净去皮，称取200g至300g马铃薯切块，加水煮烂(煮沸20min至40min)，利用100目至500目滤布过滤残渣。在滤液中添加琼脂20g至40g，葡萄糖20g至40g，再补足水分至1l，120℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。
62.drbc琼脂固体培养基(以制备1l的drbc琼脂固体培养基为例)的制备步骤为：取3号月示胨5g至10g、葡萄糖10g至30g、kh2po
4 1g至3g、氯硝胺0.002g至0.01g、mgso4·
7h2o 0.5g至3.0g、虎红0.0g至0.1g、琼脂15g至30g混合均匀，再补足水分至1l，120℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。
63.步骤b213：将活化的乳酸菌接种至种子培养基中进行扩培，得到乳酸菌种子液。
64.其中，步骤b213中，通过接种环将活化的乳酸菌接种至种子培养基中进行培养，在30-45℃的条件下培养24-96h，得到乳酸菌种子液。在乳酸菌种子液中，乳酸菌的浓度为1x107cfu/ml至1x109cfu/ml。
65.种子培养基可以选自麦芽汁液体培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基、孟加拉红培养基中的至少一种。麦芽汁液体培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基、孟加拉红培养基的制备如前所述，此处不再累述。
66.实施例1
67.一种具有抗炎、舒缓、修护功效的绿豆发酵液，采用如下方法制备得到：
68.1)配置固体培养基、种子培养基和液体培养基。
69.本实施例中选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基作为固体，选用麦芽汁液体培养基作为种子培养基和液体培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基和麦芽汁液体培养基的制备步骤如前所述，此处不再累述。
70.2)菌株活化与扩培。
71.将植物乳杆菌(gdmcc 1.140)溶于无菌水制成菌悬液，移取10μl植物乳杆菌悬液在马铃薯葡萄糖琼脂培养基表面划线，活化培养，培养温度35℃，培养时间48h，获得活化后的植物乳杆菌。将活化后的植物乳杆菌通过接种环接种至含有麦芽汁液体培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为35℃，发酵摇瓶的转速为150r/min。培养48h后，得到植物乳杆菌种子液。在种子液中，植物乳杆菌的浓度在8
×
10
7-1.5
×
108cfu/ml之间。
72.3)培养发芽绿豆。
73.将绿豆放入平铺有湿润毛巾的托盘中(托盘尺寸500mm
×
300mm
×
150mm)，在托盘中加入质量为绿豆质量3倍的水，将绿豆浸润，再在绿豆表面覆盖以湿润的毛巾，将托盘置于40℃，相对湿度为90％的培养箱内，进行48小时静置发芽，得到发芽绿豆。
74.4)制备发芽绿豆发酵培养基。
75.称取步骤3)制备的发芽豆芽5kg，用粉碎机打碎，过80目筛网。将发芽绿豆粉末注入麦芽汁液体培养基至总质量百分比为97kg。将发酵罐密闭，升温至121℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得发芽绿豆发酵培养基。
76.5)液态发酵培养。
77.将3kg植物乳杆菌种子液加入至发芽绿豆发酵培养基中，在37℃，搅拌桨的转速为
200r/min下发酵48h，得到绿豆发酵液。
78.6)对绿豆发酵液进行灭活处理。
79.利用巴氏灭菌法对绿豆发酵液中的微生物进行灭活处理，灭活处理温度为90℃，灭活处理的时间为10min。
80.7)对绿豆发酵液进行纯化处理。
81.待绿豆发酵液完成降温后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质。
82.实施例2-13一种具有抗炎、舒缓、修护功效的绿豆发酵液的制备方法与实施例1相同，仅步骤3)培养发芽绿豆有所区别，具体实施例2-13中步骤3)培养发芽绿豆制备方法中的参数如下表1所示；
83.实施例14-21一种具有抗炎、舒缓、修护功效的绿豆发酵液的制备方法与实施例1相同，仅4)制备发芽绿豆发酵培养基和步骤5)液态发酵培养有所区别，具体实施例14-21中4)制备发芽绿豆发酵培养基和步骤5)液态发酵培养制备方法中的参数如下表1所示；
84.表1
85.[0086][0087]
对比例1
[0088]
采用水提法对发芽绿豆进行提取。
[0089]
1)培养发芽绿豆。
[0090]
对比例1培养发芽绿豆的步骤与实施例1培养发芽绿豆的步骤相同，此处不再累述。
[0091]
2)制备绿豆提取液。
[0092]
称取步骤1)制备的发芽绿豆5kg，用粉碎机打碎，过80目筛网，加入水至总质量为
100kg。在35℃、搅拌桨的转速为200r/min下提取48h，得到绿豆提取液。
[0093]
3)对绿豆提取液进行过滤处理。
[0094]
对步骤2)中的绿豆提取液用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质。
[0095]
对比例2
[0096]
采用超声法对发芽绿豆进行提取。
[0097]
1)培养发芽绿豆。
[0098]
对比例2培养发芽绿豆的步骤与实施例1培养发芽绿豆的步骤相同，此处不再累述。
[0099]
2)制备绿豆提取液
[0100]
称取步骤1)制备的发芽绿豆5kg，用粉碎机打碎，过80目筛网，加入水至总质量为100kg。在37℃、超声波频率为60khz、超声波功率为600w的条件下用超声提取3h，得到绿豆提取液。
[0101]
3)对绿豆提取液进行过滤处理。
[0102]
对步骤2)中的绿豆提取液用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质。
[0103]
对比例3
[0104]
1)配置固体培养基、种子培养基和液体培养基。
[0105]
该步骤与实施例1中的步骤相同，此处不再累述。
[0106]
2)菌株活化与扩培。
[0107]
该步骤与实施例1中的步骤相同，此处不再累述。
[0108]
3)制备绿豆发酵培养基。
[0109]
将5kg绿豆用粉碎机打碎，过80目筛网。将绿豆粉末注入麦芽汁液体培养基至总质量百分比为97kg。将发酵罐密闭，升温至121℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得发芽绿豆发酵培养基。
[0110]
5)液态发酵培养。
[0111]
将3kg植物乳杆菌种子液加入至绿豆发酵培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液ph为6.5，在35℃，搅拌桨的转速为200r/min下发酵48h，得到绿豆发酵液。
[0112]
6)对绿豆发酵液进行灭活处理。
[0113]
该步骤与实施例1中的步骤相同，此处不再累述。
[0114]
7)对绿豆发酵液进行过滤处理。
[0115]
该步骤与实施例1中的步骤相同，此处不再累述。
[0116]
性能测试-1抗炎测试-抑制透明质酸酶活性测试
[0117]
透明质酸酶是i型过敏反应的参与者，透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，研究报道各种肥大细胞释放组胺的药物能调节透明质酸酶活性，一些抗敏药物有强抑制透明质酸酶活性，因此抑制透明质酸酶活性作为研究抗过敏作用的指标。
[0118]
测试步骤：
[0119]
(1)试剂配置
[0120]
醋酸缓冲液(ph＝5.6)：量取1155μl冰乙酸稀释至100ml混匀后取其中4.8ml为a溶液；称取结晶乙酸钠加水溶解定容至100ml，混匀后取其中45.2ml为b溶液；混合a和b，以水定容至100ml混匀。精密测定其ph值，用溶液a或b调至5.6。
[0121]
透明质酸酶溶液：称取一定重量的透明质酸酶，用醋酸缓冲液配制工作浓度为1250u/ml的透明质酸酶溶液。
[0122]
0.5mg/ml透明质酸钠溶液：用醋酸缓冲液配制质量浓度为0.5mg/ml的透明质酸钠溶液。
[0123]
埃尔利希试剂：称取0.8g对二甲氨基苯甲醛溶于15ml浓盐酸和15ml无水乙醇中，可保存两个月。(避光保存)
[0124]
乙酰丙酮溶液：用碳酸钠溶液配置体积浓度为7％的乙酰丙酮溶液(使用前配制)。
[0125]
(2)试剂加样和测试
[0126]
依照表2中步骤依次加入上述配置的试剂。
[0127]
表2
[0128][0129]
将各支试管反应溶液混匀后，移入3cm比色皿中，在547nm检测各组吸光度，记录数据。其中，c-试样管中加入的样品液分别是绿豆发酵液1-21和对比提取液1-3。
[0130]
(3)数据处理
[0131]
透明质酸酶抑制率计算公式为：
[0132][0133]
式中：t为试样液吸光度值；t0为试样空白溶液吸光度值(醋酸缓冲液代替酶液)；c
为对照溶液吸光度值(醋酸缓冲液代替样品溶液)；c0为空白对照溶液吸光度值(醋酸缓冲液代替样品溶液及酶液)。
[0134]
测定结果：如表3所示；
[0135]
性能测试-2γ-氨基丁酸的含量测定。
[0136]
测试标准：参照《qbt4587-2013γ-氨基丁酸》进行测定；
[0137]
测试步骤：(1)制备衍试剂：称取0.1g邻苯二甲醛(c8h6o2)，用1ml乙腈溶解，加130μl巯基乙醇，用0.4mol/l硼酸缓冲液定容至10ml。(2)制备高效液相色谱的流动相：流动相a(称取8.0g结晶乙酸钠，用水溶解定容至1000ml；然后加入220μl三乙胺，搅拌并滴加5％醋酸调ph至7.18～7.22；最后加入5ml四氢呋喃，混合后过滤，备用)；流动相b(称取8.0g结晶乙酸钠；用水溶解定容至1000ml；然后滴加2％醋酸调ph至7.18～7.22；再按乙酸钠溶液：乙腈：甲醇＝1：2：2(体积比)混合后过滤，备用。)(3)γ-氨基丁酸标准溶液配制：精密称取γ-氨基丁酸标准品5mg，用去离子水溶解后，置于10ml容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀后作为对照品溶液。用0.22μm滤膜过滤待用。(4)标准曲线：分别准确吸取标准溶液(500ppm)40μl、80μl、100μl、200μl、240μl，用衍生试剂进行处理，高效液相色谱进行测定，以峰面积-浓度作图，绘制标准曲线。(5)样品中γ-氨基丁酸的测定：将实施例1-21和对比例1-3的绿豆发酵液或绿豆提取液用去离子水稀释至标准曲线浓度范围内，用衍生试剂进行处理，用高效液相色谱进行测定，以外标法计算出相应γ-氨基丁酸的浓度。(6)高效液相色谱的测试条件：流动相a(60％)、流动相b(40％)，比例为1:1；柱温为40℃；流速为1.0ml/min；进样量为20μl；检测器：检测波长338nm。
[0138]
测定结果：如表3所示。
[0139]
表3
[0140]
[0141][0142]
由上可知，提取的方法、选用的发酵材料、绿豆发芽过程中水的加入量、发芽温度、相对湿度、发芽时间、发酵选用的菌种以及发酵过程中选用的液体培养基均会影响绿豆发酵液或绿豆提取液中γ-氨基丁酸的含量及最终产品的抗炎效果。
[0143]
由实施例1、对比例1-3对比可知，对比例3的绿豆提取液中γ-氨基丁酸的含量、对透明质酸酶活性的抑制效果高于对比例1-3，说明了提取的方法和发酵的原料影响到最终产品的功效，使用发芽绿豆发酵得到的产品具有更高的活性物质含量及更好的对透明质酸酶活性的抑制效果。
[0144]
由实施例1-4对比可知，实施例1中绿豆发酵液的γ-氨基丁酸含量高于实施例2-4，且实施例1中绿豆发酵液对透明质酸酶的抑制效果优于实施例2-4，说明水的加入量影响了绿豆的发芽过程，最终影响了绿豆发酵液中活性物质的含量及绿豆发酵液的功效。在本发明的绿豆发芽过程中，最宜将绿豆与水的加入量的质量之比设置在1:3，在该范围内，绿豆发酵液中的活性物质含量最高，且在该范围内，绿豆发酵液中的抗炎效果最好。
[0145]
由实施例1、实施例5-7对比可知，实施例1中绿豆发酵液的γ-氨基丁酸含量高于实施例5-7，且实施例1中绿豆发酵液对透明质酸酶的抑制效果优于实施例5-7，说明温度影响了绿豆的发芽过程，最终影响了绿豆发酵液中活性物质的含量及绿豆发酵液的功效。在本发明中，绿豆发芽的最适宜温度为40℃，在该范围内，绿豆发酵液中的活性物质含量最高，且在该范围内，绿豆发酵液中的抗炎效果最好。
[0146]
由实施例1、实施例8-10对比可知，实施例1中绿豆发酵液的γ-氨基丁酸含量高于实施例8-10，且实施例1中绿豆发酵液对透明质酸酶的抑制效果优于实施例8-10，说明相对湿度影响了绿豆的发芽过程，最终影响了绿豆发酵液中活性物质的含量及绿豆发酵液的功效。在本发明中，绿豆发芽的最适宜的相对湿度为90％，在该范围内，绿豆发酵液中的活性物质含量最高，且在该范围内，绿豆发酵液中的抗炎效果最好。
[0147]
由实施例1、实施例11-13对比可知，实施例1中绿豆发酵液的γ-氨基丁酸含量高于实施例11-13，且实施例1中绿豆发酵液对透明质酸酶的抑制效果优于实施例11-13，说明绿豆发芽时间影响了绿豆的发芽过程，最终影响了绿豆发酵液中活性物质的含量及绿豆发酵液的功效。在本发明中，绿豆发芽的最适宜时间为48h，在该范围内，绿豆发酵液中的活性
物质含量最高，且在该范围内，绿豆发酵液中的抗炎效果最好。
[0148]
由实施例1、实施例14-17对比可知，实施例1中绿豆发酵液的γ-氨基丁酸含量高于实施例14-17，且实施例1中绿豆发酵液对透明质酸酶的抑制效果优于实施例14-17，说明发酵的菌种会对整个发酵过程产生很大的影响，最终影响了绿豆发酵液中活性物质的含量及绿豆发酵液的功效。在本发明中，使用植物乳杆菌的发酵效果最好，其次是戊糖乳杆菌。约氏乳杆菌和鼠李糖杆菌对发芽绿豆的发酵效果相当，而干酪乳杆菌的发酵效果最差。发酵效果好，绿豆发酵液中的活性物质含量高，且在该范围内，绿豆发酵液中的抗炎效果好。
[0149]
由实施例1、实施例18-21对比可知，实施例1中绿豆发酵液1的γ-氨基丁酸含量高于实施例18-21中绿豆发酵液18-21的γ-氨基丁酸含量，且实施例1中绿豆发酵液1的对透明质酸酶的抑制效果优于实施例18-21，说明发酵选用的培养基会影响发酵的过程，最终影响了绿豆发酵液中活性物质的含量。在本发明中，使用麦芽汁液体培养基的发酵效果最好，其次是马铃薯培养基和lb肉汤培养基，而使用孟加拉红培养基的发酵效果最差。实施例1中绿豆发酵液1对透明质酸酶的抑制效果优于实施例18-21，说明发酵选用的培养基会影响发酵的过程，最终影响了绿豆发酵液的抗炎功效。在本发明中，使用麦芽汁液体培养基的发酵效果最好，而使用孟加拉红培养基的发酵效果最差。
[0150]
本发明提供一种绿豆发酵液的制备方法，本发明在绿豆发酵之前，对绿豆进行了发芽处理，最终制备得到的绿豆发酵液的活性物质较多，γ-氨基丁酸的含量远高于未经发芽处理的绿豆发酵液以及采用水提法和醇提法的绿豆提取液。此外，本发明制备的绿豆发酵液具有良好的抗炎功效，适合作为化妆品的功效原料。
[0151]
实施例22-34及对比例4-10
[0152]
一种具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液的制备方法，具体包括以下步骤：
[0153]
(a)将发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英加入至液体培养基中，得到混合发酵培养基；
[0154]
(b)将乳酸菌种子液接入至所述混合发酵培养基中发酵，灭活纯化后得到混合发酵液。
[0155]
步骤ba1：培养发芽绿豆。培养发芽绿豆的步骤与步骤b11相同，此处不再累述。
[0156]
步骤ba2:将发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英加入至液体培养基中，得到混合发酵培养基。
[0157]
具体的，使用粉碎机分别将发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英打碎并过网筛，将发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英粉末加入至液体培养基中，混合均匀。将混合发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英粉末的液体培养基通过高压蒸汽灭菌，降温至室温，得到混合发酵培养基。其中，
[0158]
发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英占所述混合发酵培养基的总质量百分比为0.5％至30％；优选为0.5％至15％。
[0159]
发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英的质量比为70-75:7-9：8-10：1.2-2.3。优选的，发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英的质量比71-74:8-8.5：9-9.5：1.5-1.9，最优选为72.88:8.3:9.24:1.8；
[0160]
液体培养基可以选自麦芽汁液体培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基、孟加拉红培养基或lb肉汤培养基中的至少一种。
[0161]
步骤bb1：将乳酸菌种子液接入至液态发酵培养基中发酵，得到混合发酵液。
[0162]
具体的，移取乳酸菌种子液至发酵罐的液态发酵培养基中，通过搅拌桨搅动发酵罐内的液态发酵培养基进行发酵培养，得到混合发酵液。
[0163]
本发明通过大量试验得知，选用乳酸菌共生发酵发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英，得到的混合发酵液中活性物质含量较高，混合发酵液的抗氧化性能和抗炎、舒缓、修护功效最好。在本发明中，乳酸菌种可以选自植物乳杆菌(gdmcc 1.140)、鼠李糖乳杆菌(gdmcc 1.320)、干酪乳杆菌(cgmcc1.159)、约氏乳杆菌(gdmcc1.730)、戊糖乳杆菌(gdmcc 1.524)菌种中的至少一种。
[0164]
乳酸菌种子液的接种量为液态发酵培养基的质量百分比的1％至5％。
[0165]
发酵培养的温度为30至45℃，发酵罐内的发酵培养的ph为5.0-7.5，搅拌桨的转速为50-350r/min，发酵时间为24-96h。在上述温度和ph范围内，乳酸菌能发生大量的生理生化反应，使得混合发酵液活性物质较多。
[0166]
具体的，可以通过柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液和/或磷酸缓冲溶液调节液态发酵培养基的ph。其中，ph的调节范围为5.0-7.5。
[0167]
步骤bb2：对混合发酵液进行灭活处理和过滤处理，得到具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液。
[0168]
灭活处理和过滤处理的步骤与步骤b22相同，此处不再累述，灭活处理和过滤处理后得到具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液。
[0169]
在将乳酸菌种子液接入至液态发酵培养基中发酵之前，还可以包括：
[0170]
步骤bb11：制备乳酸菌种子液。
[0171]
步骤b b11制备乳酸菌种子液的步骤与步骤b211、步骤b212、步骤b213相同，此处不再累述。
[0172]
实施例22
[0173]
1)配置固体培养基、种子培养基和液体培养基。
[0174]
本实施例中选用的固体培养基、种子培养基和液体培养基与实施例1相同，此处不再累述。
[0175]
2)菌株活化与扩培。
[0176]
本实施例中菌株活化与扩培的步骤与实施例1相同，此处不再累述。
[0177]
3)对绿豆进行发芽处理。
[0178]
本实施例绿豆发芽处理的步骤与实施例1相同，此处不再累述。
[0179]
4)制备混合发酵培养基。
[0180]
使用粉碎机将分别将5kg步骤3)制备的发芽绿豆、0.569kg金银花、0.634kg积雪草和0.123kg蒲公英打碎并过网筛，将发芽绿豆、金银花、积雪草、蒲公英粉末注入麦芽汁液体培养基至总质量百分比为97kg。将发酵罐密闭，升温至121℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得混合发酵培养基，本实施例中，发芽绿豆、金银花、积雪草和蒲公英的质量比为72.88:8.3:9.24:1.8。
[0181]
5)液态发酵培养。
[0182]
将3kg植物乳杆菌种子液加入至发芽绿豆发酵培养基中，在37℃，搅拌桨的转速为200r/min下发酵50h，得到混合发酵液。
[0183]
6)对发酵液进行灭活处理。
[0184]
本实施例中对发酵液进行灭活处理的步骤与实施例1相同，此处不再累述。
[0185]
7)对混合发酵液进行过滤处理。
[0186]
本实施例中对发酵液进行过滤处理的步骤与实施例1相同，此处不再累述，最终制备得到具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液。
[0187]
实施例23-29一种具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液的制备方法与实施例22相同，仅步骤5)液态发酵培养中菌种和发酵时间不同，具体实施例23-29中混合发酵液的制备方法中的参数如下表4所示；
[0188]
实施例30-34一种具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液的制备方法与实施例22相同，仅步骤4)制备混合发酵培养基中混合发酵液的比例不同，具体实施例23-29中混合发酵培养基的制备方法中的参数如下表4所示；
[0189]
表4
[0190][0191][0192]
对比例4
[0193]
采用水提法对绿豆、金银花、积雪草、蒲公英进行提取，具体制备步骤如下：
[0194]
1)培养发芽绿豆。
[0195]
对比例4培养发芽绿豆的步骤与实施例1培养发芽绿豆的步骤相同，此处不再累
述。
[0196]
2)制备复合提取物。
[0197]
将3kg步骤1)制备的发芽绿豆用粉碎机打碎，过80目筛网；使用粉碎机将发芽绿豆，0.569kg的金银花、0.634kg积雪草和0.123kg蒲公英粉碎处理，过筛网；将粉碎后的发芽绿豆、金银花、积雪草和蒲公英混合，加入水至总质量为100kg，在70℃温度、匀速200r/min搅拌条件下提取48h，得到复合提取物。
[0198]
3)对复合提取物进行过滤处理。
[0199]
对步骤2)中的复合提取物用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到复合提取物1。
[0200]
对比例5
[0201]
采用超声法对绿豆、金银花、积雪草、蒲公英进行提取，具体制备步骤如下：
[0202]
1)培养发芽绿豆。
[0203]
对比例5培养发芽绿豆的步骤与实施例1培养发芽绿豆的步骤相同，此处不再累述。
[0204]
2)制备复合提取物。
[0205]
将5kg步骤1)制备的发芽绿豆用粉碎机打碎，过80目筛网；使用粉碎机将发芽绿豆，0.569kg的金银花、0.634kg积雪草和0.123kg蒲公英粉碎处理，过筛网；将粉碎后的发芽绿豆、金银花、积雪草和蒲公英混合，加入水至总质量为100kg，在37℃、超声波频率为60khz、超声波功率为600w的条件下用超声提取3h，得到绿豆提取液。
[0206]
3)对复合提取物进行过滤处理。
[0207]
对步骤2)中的复合提取物用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到复合提取物2。
[0208]
对比例6
[0209]
重复实施例22，不同的是的绿豆不进行发芽处理，直接称取5kg的绿豆粉碎，其他制备过程与实施例22相同，得到复合提取物3。
[0210]
对比例7(对比例7-10探究缺少其中一种植物原料对功效的影响)。
[0211]
重复实施例22，不同的是将5kg发芽绿豆、0.569kg金银花、0.634kg积雪草和0.123kg蒲公英改为2.235kg金银花、2.301kg积雪草和1.79kg蒲公英，不对绿豆进行发芽和粉碎，其他制备过程与实施例22相同。
[0212]
即，对比例7的制备的混合发酵液中不加入发芽绿豆，相应增加金银花、积雪草和蒲公英原料的质量，以使的发酵原料的质量不变。
[0213]
对比例8
[0214]
重复实施例22，不同的是5kg发芽绿豆、0.569kg金银花、0.634kg积雪草和0.123kg蒲公英改为5.189kg绿豆进行发芽和粉碎、0.824kg积雪草和0.313kg蒲公英，其他制备过程与实施例22相同。
[0215]
即，对比例8的制备的混合发酵液中不加入金银花，增加发芽绿豆、积雪草和蒲公英原料的质量，以使的发酵原料的质量不变。
[0216]
对比例9
[0217]
重复实施例22，不同的是5kg发芽绿豆、0.569kg金银花、0.634kg积雪草和0.123kg
蒲公英改为5.213kg绿豆进行发芽和粉碎、0.78kg金银花和0.334kg蒲公英，其他制备过程与实施例22相同。
[0218]
即，对比例9的制备的混合发酵液中不加入积雪草，增加发芽绿豆、金银花和蒲公英原料的质量，以使的发酵原料的质量不变。
[0219]
对比例10
[0220]
重复实施例22，不同的是5kg发芽绿豆、0.569kg金银花、0.634kg积雪草和0.123kg蒲公英改为5.041kg绿豆进行发芽和粉碎、0.61kg金银花和0.675kg积雪草，其他制备过程与实施例22相同。
[0221]
即，对比例10的制备的混合发酵液中不加入蒲公英，增加发芽绿豆、金银花和积雪草原料的质量，以使的发酵原料的质量不变。
[0222]
性能测试-3γ-氨基丁酸的含量测定。
[0223]
测试标准：参照《qbt4587-2013γ-氨基丁酸》进行测定；具体过程与性能测试-1中相同，此处不再累述。
[0224]
测定结果：如表5所示；
[0225]
性能测试-4抗炎测试-抑制透明质酸酶活性测试。
[0226]
抑制透明质酸酶活性测试的原理和测试步骤具体过程与性能测试-2中相同，此处不再累述。
[0227]
测定结果：如表5所示；
[0228]
性能测试-5积雪草总苷的含量测定。
[0229]
测试步骤：(1)积雪草苷溶液和羟基积雪草苷溶液：取积雪草苷对照品、羟基积雪草苷对照品，精密称定，加甲醇制成0.2mg/ml的积雪草苷溶液和0.2mg/ml羟基积雪草苷溶液。
[0230]
(2)样品溶液的处理：将实施例22-29和对比例1-3制备的混合发酵液用一定比例的甲醇稀释至积雪草苷的浓度为0.15-0.3mg/ml的范围内，羟基积雪草苷溶液的浓度为0.15-0.3mg/ml的范围内。
[0231]
(3)液相色谱测定：精密吸取对照品溶液与样品溶液注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，计算峰面积。
[0232]
(4)高效液相色谱的测试条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈和2mmol/l倍他环糊精溶液，比例为24:76；流速为1.0ml/min；进样量为10～20μl；检测波为205nm。
[0233]
(5)根据峰面积和对应的稀释比例计算实施例22-29和对比例4-6制备的混合发酵液和复合提取物中积雪草总苷的含量。
[0234]
测定结果：如表5所示；
[0235]
性能测试-6损伤修护性能测试。
[0236]
测试步骤：
[0237]
(1)样品处理：把实施例22-34和对比例4-10制备的混合发酵液制备成含量10％的水溶液作为本次测试的检测样品。
[0238]
(2)检测方法：本次测试通过胶带反复粘贴建立物理损伤模型，并在胶带损伤后以及使用产品修复4天后检测该处皮肤的经皮水分流失、皮肤血红素含量，并用visia-cr拍摄
皮肤图像。在胶带损伤后以及使用样品4天后对各检测区域进行皮肤经皮水分流失、皮肤血红素含量测试，数据记为d1(损伤值)、d5(修复4天值)。
[0239]
(3)产品使用方法：样品及空白对照区按测试区域随机分布表分布于志愿者前臂内侧区域，空白对照测试区域不使用任何样品。样品区域使用一次性医用棉签蘸取样品，在测试区域来回均匀涂抹5次，使用干净的棉签重复涂抹操作1次。
[0240]
(4)使用的仪器和测试步骤：三探头式皮肤水分流失测试探头(tewameter tm330t，ck，英国)。通过皮肤水分流失测试探头对检测区域进行皮肤经皮水分流失的检测，每个检测区域各测1次，每次检测30秒，取后20秒的平均值为测量值。
[0241]
(5)使用的仪器和测试步骤：皮肤色素测试探头(mexameter mx18，ck，英国)。通过皮肤色素测试探头对检测区域进行皮肤血红素含量的检测，每个检测区域各测3次。取3次测试的平均值为测量值。
[0242]
(6)“测试结果”中相关的定义及相关计算公式：
[0243]
损伤值：指经过胶带粘贴损伤后但未使用任何样品时的值。
[0244]
平均值：
[0245]
其中：xn表示个体参数检测值，n表示有效数据数量。
[0246]
差值：
[0247]
其中，表示使用后第n个时间点检测时的参数平均值，表示使用前检测的参数平均值。
[0248]
变化率：
[0249]
表示相对于初始值的均值变化程度。
[0250]
测定结果：如表5所示；
[0251]
性能测试-7抗炎测试-tnfα含量测定。
[0252]
细胞毒性测试
[0253]
化妆品原料在进行使用时，需要筛选出化妆品原料对于不同模型细胞的安全工作浓度范围，在本次抗炎测试中，选择细胞活性≥90％的浓度作为巨噬细胞的最高安全浓度，抗炎测试浓度选择范围不应超过此最高安全浓度。
[0254]
(1)试验材料——细胞系：小鼠巨噬细胞raw 264.7。培养液：含10％胎牛血清的高糖dmem培养基。培养条件：37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养。溶液及对照：对照组为培养液，样品组(ta)为用培养液稀释至测试浓度。噻唑蓝(mtt)溶液：5mg/ml。
[0255]
(2)试验步骤——细胞培养：试验前24h制备细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔100μl，每孔细胞数为3
×
104个，培养24h。
[0256]
暴露：弃去孔中原培养液，每孔加入100μl不同浓度的测试样品，以及阴性对照或阳性对照。培养箱孵育24h。相差倒置显微镜下观察细胞形态和特性。
[0257]
(3)mtt测试：每孔加入100μl 0.1mg/ml mtt溶液，培养箱孵育4h。去除孔中液体，每孔加入150μl dmso，置于振荡器振荡15min后，在酶标仪570nm波长处测定吸收值。
[0258]
数据分析
[0259]
各组数据以均值
±
标准差表示，以对照组细胞活性为100％，计算各组相对细胞活性(viability)，在本次抗炎测试中，选择细胞活性≥90％的浓度作为巨噬细胞的最高安全浓度，抗炎测试浓度选择范围不应超过此最高安全浓度。
[0260]
tnfα含量的测定。
[0261]
(1)试验步骤
[0262]
细胞培养：将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔细胞数为3
×
104个，培养24h。
[0263]
暴露：弃去孔中原培养液，样品组各孔加不同浓度的样品溶液及阳性对照，实施例22-34和对比例4-10制备的混合发酵液和复合提取物的给药浓度依次为1％、3％、5％，阳性对照组地塞米松的浓度为10μm，阴性对照组与建模组补加完全培养基，预处理2h，建模组和样品组加10ng/ml的脂多糖，培养24h。
[0264]
elisa测试：吸取培养基，离心取上清，测试上清液中tnfα的含量。
[0265]
测试结果：如表6所示；
[0266]
表5
[0267][0268][0269]
表6
[0270][0271][0272]
(1)由实施例22、对比例4-6对比可知，实施例22的混合发酵液对发酵液γ-氨基丁酸的含量、积雪草总苷含量优于对比例4-6的样品，说明了提取的方法和发酵的原料影响到混合发酵液的活性物质含量及功效，使用发芽绿豆发酵得到的混合发酵液具有更好的抗炎效果。实施例22的混合发酵液γ-氨基丁酸的含量、积雪草总苷含量要优于实施例1，说明加入金银花、积雪草和蒲公英与发芽绿豆共生发酵，有利于产生更多的活性物质，得到更好的抗炎效果。
[0273]
由实施例22-26对比可知，实施例22的混合发酵液γ-氨基丁酸含量、积雪草总苷
含量高于实施例23-26，说明发酵选用的菌种会影响整个发酵过程，最终影响了混合发酵液的活性物质的含量，影响了混合发酵液的抗炎功效。在发芽绿豆、金银花、积雪草和蒲公英共生发酵的过程中，使用植物乳杆菌的发酵效果最好。由实施例22、实施例27-29对比可知，实施例22中的混合发酵液γ-氨基丁酸含量、积雪草总苷含量高于实施例27-29，说明发酵时间会影响绿豆发酵液中活性物质的含量，影响了混合发酵液的抗炎功效。当发酵时间为45-50h时，随着发酵时间的延长，混合发酵液中产生的活性物质越多，γ-氨基丁酸含量、积雪草总苷的含量也越高，抗炎功效越好；当发酵时间超过50h后，混合发酵液中的γ-氨基丁酸、积雪草总苷的含量不再增加，反而出现轻微的下降。因此，在发芽绿豆、金银花、积雪草和蒲公英共生发酵时，发酵的时间最好控制在50h左右，γ-氨基丁酸含量、积雪草总苷的含量最高，抗炎功效最佳。
[0274]
(2)使用实施例22-34和对比例4-10制备混合发酵液(10％的水溶液)4天后皮肤经皮水分流失值、皮肤血红素含量、对透明质酸酶活性的抑制效果、抗炎效果的结果如上表5和表6所示。在使用实施例22-34和对比例4-10制备的混合发酵液(10％的水溶液)4天后，皮肤经皮水分流失降低。在使用实施例22-34和对比例4-10制备的混合发酵液(10％的水溶液)4天后，实施例22、对比例6-10对应的皮肤血红素下降的值要大于空白对照，说明实施例22、对比例6-10的混合发酵液可以促进皮肤损伤后红斑的减轻，达到舒缓炎症的效果。
[0275]
由实施例22、对比例4-6可知，实施例22的的样品的抑制皮肤经皮水分流失的效果、损伤修复效果、对透明质酸酶活性的抑制效果、抗炎效果优于对比例4-6，说明了提取的方法和发酵的原料影响到混合发酵液的功效，使用发酵方法得到的混合发酵液以及使用发芽绿豆发酵得到的混合发酵液具有更好的抗炎效果。比较实施例22、对比例7-10可知，当发酵原料的总重量相同时，使用发芽绿豆、金银花、积雪草和蒲公英共生发酵的混合发酵液皮肤经皮水分流失值降低得最多，皮肤血红素下降的值最多，对透明质酸酶的抑制效果最佳、抗炎效果最好，这说明在发酵过程中，发芽绿豆、金银花、积雪草和蒲公英存在着协同作用，最终制备得到的样品抑制皮肤经皮水分流失的效果最好，损伤修复效果最佳，抗炎效果最佳。
[0276]
由实施例22-26对比可知，选用不同的菌种进行发酵时，最终混合发酵液使用在皮肤后的经皮水分流失值、皮肤血红素下降值、透明质酸酶的抑制效果、抗炎效果不同，说明发酵的菌种影响了混合发酵液的活性物质的含量，最终影响混合发酵液抑制皮肤经皮水分流失、损伤修复、对透明质酸酶的抑制、抗炎的效果。使用植物乳杆菌的效果最好，而使用约氏乳杆菌的效果最差。由实施例22、实施例27-29对比可知，发酵的时间不同时，混合发酵液使用在皮肤后的经皮水分流失值、使用后皮肤血红素下降的值，对透明质酸酶的抑制效果、抗炎功效不同，说明发酵时间影响了混合发酵液的活性物质的含量，最终影响混合发酵液抑制皮肤经皮水分流失、损伤修复、对透明质酸酶的抑制、抗炎功效的效果。最佳的发酵时间为50h。由实施例22、实施例30-34对比可知，实施例30-32的混合发酵液效果要优于实施例33-34。说明发芽绿豆、金银花、积雪草和蒲公英选用的比例影响了混合发酵液的活性物质的含量，最终影响混合发酵液抑制皮肤经皮水分流失、损伤修复、对透明质酸酶的抑制、抗炎的效果。在本发明中，绿豆、金银花、积雪草、和蒲公英的比例应当控制在70-75:7-9：8-10：1.2-2.3，更优选地，控制在71-74:8-8.5：9-9.5：1.5-1.9。在该范围内，样品抑制皮肤经皮水分流失、损伤修复、对透明质酸酶的抑制、抗炎的效果较优。
[0277]
从表6中的结果可以看出，上述实施例22-34和对比例4-10制备的混合发酵液，在5％浓度范围内，细胞无明显细胞毒性。抗炎测试(tnfα含量测定)浓度选择1％、3％、5％。在测试结果中，以空白组中的tnfα含量限定为0％，以lps组中tnfα含量限定为100％，其余样品测试得到的tnfα的含量按照对应的值进行换算，得到了tnfα的相对含量值。在浓度为1％、3％、5％的范围内，实施例22-34及对比例4-10的混合发酵液表现出抑制炎症因子tnfα生成的能力。
[0278]
本发明提供一种具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液。具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液用乳酸菌共生发芽绿豆，金银花，积雪草和蒲公英，得到的混合发酵液富含γ-氨基丁酸和积雪草苷等活性成分，混合发酵液具有良好的抗炎、舒缓、修护的功效，本发明制备的具有抗炎、舒缓、修护功效的混合发酵液适合应用于化妆品和护肤品中。
[0279]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。