吡咯并吡啶类化合物在制备治疗狼疮药物中的应用

1.本发明属于药物领域，具体涉及狼疮治疗技术领域。


背景技术：

2.红斑狼疮(lupus erythematosus,le)是一种典型的自身免疫性疾病，是一种由于细胞和体液免疫功能障碍，产生多种自身抗体，从而累计皮肤、关节、肌肉、肾、心血管、血液、中枢神经等全身多脏器、多系统的疾病。发生狼疮危象时如未得到及时有效干预可能会危及患者生命，狼疮病情的快速诱导缓解时本病处置的关键之一。
3.目前应用于临床的治疗方案就像一把双刃剑，虽然一方面能控制病情发展，另一方面也也伴随诸多药物毒性作用。如长期应用糖皮质激素可以引起消化道损害，继发性cushing综合征感染等；大剂量糖皮质激素的使用会导致丘脑-垂体-肾上腺轴紊乱。而免疫抑制剂常常会导致骨髓抑制，肝肾功能损伤，继发性感染等。靶向单克隆抗体生物制剂的研发很好的解决了非靶点效应的问题，并在临床试验中展现出不错的治疗效果，但是也存在一些安全问题；并且作为生物制剂，价格比较昂贵；此外，红斑狼疮疾病的发生和发展涉及多系统多因素，单个靶点的靶向治疗获得的疗效有限。探索更高效、更少非靶点效应的治疗药物对le的治疗具有重要的现实意义及发展前景。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种吡咯并吡啶类化合物在制备治疗狼疮药物中的应用。
5.本发明第二目的在于，提供包含吡咯并吡啶类化合物的治疗狼疮的活性成分以及药物。
6.吡咯并吡啶类化合物在制备治疗狼疮药物中的应用，所述的吡咯并吡啶类化合物为具有
7.式1结构的化合物；
[0008][0009]
式1中，所述的r为c1～c6的羧酸及其盐、c2～c10的酯、c2～c10的酰胺、磺酸及其盐。
[0010]
本发明研究表明，式1结构的化合物有助于缓解狼疮的症状以及并发症。
[0011]
本发明中，所述的吡咯并吡啶类化合物为具有式1-a结构的化合物：
[0012][0013]
本发明所述的应用，所述的狼疮为系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、皮肤型红斑狼疮中的至少一种；优选为系统性红斑狼疮。本发明研究表明，式1化合物能够有效缓解系统性红斑狼疮的症状以及并发症。
[0014]
作为优选，所述的应用，将所述的吡咯并吡啶类化合物用于制备抑制tfh、th1、抗体分泌细胞中的至少一种分化；和/或抑制自身抗体dsdna抗体、ifn-β和ifn-γ中的至少一种的分泌；和/或促进treg、cd4
+
t细胞、b细胞至少一种分化的治疗狼疮的药物。
[0015]
本发明中，式1化合物能够有效抑制tfh细胞分化、抑制th1细胞分化、抑制抗体分泌b细胞、抑制干扰素分泌、抑制自身抗体产生、促进treg细胞分化、促进cd4
+
t细胞比例、促进b细胞比例功能，如此能够有效缓解狼疮症状以及并发症。
[0016]
本发明所述的应用，将所述的吡咯并吡啶类化合物用于制备狼疮引起的肾损伤的药物。
[0017]
本发明所述的应用，将所述的吡咯并吡啶类化合物用于制备狼疮引起的淋巴和/或脾脏增生的药物。
[0018]
本发明优选的应用，将所述的吡咯并吡啶类化合物和糖皮质激素联合，用于制备治疗狼疮的药物。本发明中，将所述的吡咯并吡啶类化合物和糖皮质激素联用，能够实现组合增效效果，能够获得更优的治疗效果。
[0019]
本发明所述的应用，将所述的吡咯并吡啶类化合物和药学上可接受的辅料联合，制备药学上可接受的任意剂型；优选地，所述的剂型外用制剂、口服制剂或注射制剂。
[0020]
本发明还提供了一种治疗狼疮的药物活性组合物，包含所述的式1化合物和糖皮质激素；
[0021]
优选地，所述的式1化合物和糖皮质激素的剂量比(例如质量比)为1～3：1。
[0022]
本发明还提供了一种治疗狼疮的药物，包含药学有效量的所述的活性组合物。
[0023]
优选的药物，所述的药物中包含药学上可接受的辅料。优选的药物具有药学上可接受的剂型。所述的剂型例如为颗粒剂、片剂、胶囊、喷雾剂、针剂、混悬剂、乳剂等的任一种剂型。
[0024]
本发明的有益效果：
[0025]
1、式1化合物能够降低引流淋巴结中tfh、th1、抗体分泌b细胞的比例；提高引流淋巴结中treg，cd4
+
t细胞，b细胞的比例；抑制ifn-β，ifn-γ，抗dsdna的产生；能够用于狼疮的治疗，缓解狼疮症状以及预防并发症。
[0026]
2、将式1化合物和糖皮质激素联合，能够实现协同，可以获得更优的狼疮治疗效果，
附图说明
[0027]
图1为实施例1中式1-a与多种参比药物相比，能更好的抑制tfh的分化；
[0028]
图2为实施例1中式1-a与多种参比药物相比，能更好的抑制il-21的产生；
[0029]
图3为实施例2中式1-a与多种参比药物相比，能更好的促进treg细胞的分化；
[0030]
图4为实施例3中式1-a抑制cd4+t向tfh细胞的分化；
[0031]
图5为实施例4中式1-a抑制cd4+t向th1细胞的分化；
[0032]
图6为实施例5中式1-a促进cd4+t向treg细胞的分化；
[0033]
图7为实施例6中式1-a改善狼疮的肾脏损害，降低肾脏损害评分；
[0034]
图8为实施例6中式1-a改善脾脏淋巴结增生；
[0035]
图9为实施例6中式1-a降低引流淋巴结中tfh细胞的比例；
[0036]
图10为实施例6中式1-a降低引流淋巴结中th1细胞的比例；
[0037]
图11为实施例6中式1-a降低引流淋巴结中抗体分泌b细胞的比例；
[0038]
图12为实施例6中式1-a提高引流淋巴结中treg细胞的比例；
[0039]
图13为实施例6中式1-a提高引流淋巴结中cd4
+
t细胞的比例；
[0040]
图14为实施例6中式1-a提高引流淋巴结中b细胞的比例；
[0041]
图15为实施例6中式1-a抑制ifn-β的产生；
[0042]
图16为实施例6中式1-a抑制ifn-γ的产生；
[0043]
图17为实施例6中式1-a抑制抗dsdna的产生；
[0044]
图18为实施例7中式1-a与糖皮质激素泼尼龙联用，较泼尼龙单用能更好地抑制引流淋巴结(dln)中cd8
+
tem细胞的分化；
[0045]
图19为实施例7中式1-a与糖皮质激素泼尼龙联用，较泼尼龙单用能更好地抑制引流淋巴结中cd8
+
tcm细胞的分化；
[0046]
图20为实施例7中式1-a与糖皮质激素泼尼龙联用，较泼尼龙单用能更好地维持引流淋巴结中cd8
+
t细胞的初始状态，即cd8
+
t细胞；
[0047]
图21为实施例7中式1-a与糖皮质激素泼尼龙联用，较泼尼龙单用能更好地抑制引流淋巴结中cd4
+
tem细胞的分化；
[0048]
图22为实施例7中式1-a与糖皮质激素泼尼龙联用，较泼尼龙单用能更好地抑制引流淋巴结中cd4
+
tcm细胞的分化；
[0049]
图23为实施例7中式1-a与糖皮质激素泼尼龙联用，较泼尼龙单用能更好地维持引流淋巴结中cd4
+
t细胞的初始状态，即cd4
+
t细胞；
[0050]
图24为实施例7中式1-a与糖皮质激素泼尼龙联用，较泼尼龙单用能更好地抑制脾脏中cd4
+
tcm细胞的分化；
[0051]
图25为实施例7中式1-a与糖皮质激素泼尼龙联用，较泼尼龙单用能更好地抑制引流淋巴结中抗体分泌细胞asc的分化；
[0052]
图26为实施例7中式1-a与糖皮质激素泼尼龙联用，较泼尼龙单用能更好地抑制引流淋巴结中记忆性b细胞的分化；
[0053]
图27为实施例7中式1-a与糖皮质激素泼尼龙联用，较泼尼龙单用能更好地维持引流淋巴结中b细胞的初始状态；
[0054]
图28为实施例7中式1-a与糖皮质激素泼尼龙联用，较泼尼龙单用能更好地促进脾
脏中抗体treg的分化；
具体实施方式
[0055]
实施例1：体外tfh、il-21抑制研究
[0056]
抽取健康志愿者外周血100ml，用ficoll分离pbmc，种于提前一晚包被有抗人cd3的24孔板中，加入抗人cd28。分别加入溶媒(dmso)，式1-a，或几种参比药物(分别为molibresib，i-bet762 carboxylic acid，bet-bay002，protac bet-binding moiety 2，bi-9564，(s)-jq-35)，终浓度为1μm，37℃培养3天，收取培养上清液，用人il-21elisa检测试剂盒检测il-21的浓度；收取细胞利用流式细胞术检测tfh在cd4+t细胞中的比例。与对照组和多种参比药物相比，式1-a能更有效地抑制il-21的分泌；且能更有效得抑制tfh的分化，结果见图1，2。il-21和tfh在促进红斑狼疮的发生发展中起着重要作用，式1-a较多种参比药物有更优的潜在治疗效果。
[0057]
实施例1所用人il-21elisa试剂盒购于武汉华美公司，所用抗人cd3和抗人cd28购于美天旎公司，所用流式抗体购于bd公司。
[0058]
实施例2：体外treg细胞的分化研究
[0059]
抽取健康志愿者外周血100ml，用ficoll分离pbmc，种于提前一晚包被有抗人cd3的24孔板中，加入抗人cd28。分别加入溶媒(dmso)，式1-a，或几种参比药物(分别为alobresib，pfi-1，(rac)-bay1238097，y06036)，终浓度为1μm，37℃培养3天，收取细胞利用流式细胞术检测treg细胞在cd4+t细胞中的比例。与对照组和多种参比药物相比，式1-a能更有效地促进treg的分化，结果见图3。treg细胞起着抑制免疫反应的作用，能够抑制红斑狼疮的发生发展中起着促进作用的诸多细胞的分化，有利于疾病的缓解和治疗，式1-a较多种参比药物有更优的潜在治疗效果。
[0060]
实施例2所用抗人cd3和抗人cd28购于美天旎公司，所用流式抗体购于bd公司。
[0061]
实施例3：式1-a对tfh诱导分化的影响
[0062]
分离分别抽取3位健康志愿者外周血150ml，使用淋巴细胞分离液ficoll分离各志愿者的pbmc后，用美天旎的人cd4+分选磁珠分离其中的cd4+t细胞(按试剂盒说明书操作)，加入含有抗人cd28，il-6，il-12，il-21，tgf-β的10％fbs的rpmi 1640培养基中，于提前包被有抗人cd3的24孔细胞培养板中培养，种板的细胞密度为1
×
106/ml，培养3天后流式检测tfh的比例。与对照组相比(dmso)，实验组(式1-a)的tfh分化比例显著减少(图4)。
[0063]
所用试剂耗材为：
[0064]
人cd4分选磁珠，抗人cd28，抗人cd3，ls柱均购于美天旎；
[0065]
il-6，il-21，il-12，tgf-β均购于北京义翘神州科技股份有限公司；
[0066]
流式抗体均购于bd公司，具体为cd4：fitc，cxcr5：pe，pd-1：pe-cy7。
[0067]
实施例4：式1-a对th1诱导分化的影响
[0068]
分离分别抽取3位健康志愿者外周血150ml，使用淋巴细胞分离液ficoll分离各志愿者的pbmc后，用美天旎的人cd4+分选磁珠分离其中的cd4+t细胞(按试剂盒说明书操作)，，加入含有抗人cd28，il-4，il-2，il-12的10％fbs的rpmi 1640培养基中，于提前包被有抗人cd3的24孔细胞培养板中培养，种板的细胞密度为1
×
106/ml，3天后流式检测th1的比例。与对照组相比(dmso)，实验组(式1-a)的th1的分化比例显著减少(图5)。与健康
对照相比，红斑狼疮患者体内的th1水平明显增高；th1还能通过产生分泌ifn-γ加重疾病的发展。式1-a可通过抑制th1的分化而缓解病情。
[0069]
所用试剂耗材为：
[0070]
人cd4分选磁珠，抗人cd28，抗人cd3，ls柱均购于美天旎；
[0071]
il-4，il-2，il-12均购于北京义翘神州科技股份有限公司；
[0072]
流式抗体均购于bd公司，具体为cd4：fitc，ifn-γ：pe-cy7。
[0073]
实施例5：式1-a对treg诱导分化的影响
[0074]
分离分别抽取3位健康志愿者外周血150ml，使用淋巴细胞分离液ficoll分离各志愿者的pbmc后，用美天旎的人cd4+分选磁珠分离其中的cd4+t细胞(按试剂盒说明书操作)，加入含有抗人cd28，il-2，tgf-β的10％fbs的rpmi 1640培养基中，于提前包被有抗人cd3的24孔细胞培养板中培养，种板的细胞密度为1
×
106/ml，3天后流式检测treg的比例(图6)。与对照组相比(dmso)，实验组(式1-a)的treg的分化比例显著增加。
[0075]
所用试剂耗材为：
[0076]
人cd4分选磁珠，抗人cd28，抗人cd3，ls柱均购于美天旎；
[0077]
il-2，tgf-β均购于北京义翘神州科技股份有限公司；
[0078]
流式抗体均购于bd公司，具体为cd4：fitc，cd25：apc，cd127：percep-cy5.5。
[0079]
实施例6：式1-a对自发狼疮小鼠的治疗作用
[0080]
将12周龄的自发狼疮模型小鼠(mrl/lpr，北京斯贝福)随机分为两组，对照组(6只)和实验组(6只)，用式1-a混悬剂以每天10mg/kg的剂量灌胃，对照组用等剂量的溶媒灌胃。给药6周后，依照动物伦理委员会指导处死小鼠，称量小鼠的体重，脾脏和淋巴结重量；分别研磨过筛小鼠脾脏和淋巴结获得单个细胞，流式分析脾脏淋巴结中tfh
[0081]
(cd4+cxcr5+pd-1+)，treg(cd4+cd25+foxp3+)，th1(cd4+ifn-γ+)，抗体分泌b细胞，cd4
+
t细胞，b细胞的比例；取左侧肾脏固定包埋切片，he染色后显微镜下观察肾小球的损害程度，计算评分；elisa检测血清中ifn-γ，ifn-β，抗dsdna的水平(按各试剂盒的说明说进行操作，结果见图7～图17)。tfh，th1，抗体分泌b细胞，肾小球损害评分，ifn-γ，ifn-β和抗dsdna都能加重疾病或与病情呈正相关，而treg细胞，cd4+t细胞，b细胞与疾病呈负相关或对疾病有缓解作用。
[0082]
所述流式分析用的流式抗体及试剂均购于bd公司，具体为:
[0083]
cd4:percp-cy5.5，ifn-γ:pe-cy7，cxcr5:pe-cy7，pd-1:pe，cd25bb515，foxp3:apc，cd19：apc-cy7，b220：pe-cy7，igd：fitc，cd138：apc，cd4：pe，cd44：apc-cy7，cd62l：pe-cy7；固定破核膜试剂，固定破包膜试剂。
[0084]
elisa试剂盒均购于华美生物。
[0085]
实施例7：式1-a协同糖皮质激素泼尼龙(pred)对自发狼疮小鼠的治疗作用
[0086]
将12周龄的自发狼疮模型小鼠(mrl/lpr，北京斯贝福)随机分为两组，泼尼龙组(6只)和式1-a与泼尼龙协同组(6只)，泼尼龙组用泼尼龙混悬液以每天5mg/kg的剂量灌胃，协同用药组以每天泼尼龙5mg/kg及式1-a 10mg/kg的剂量灌胃。给药6周后，依照动物伦理委员会指导处死小鼠，称量小鼠的体重，脾脏和淋巴结重量；分别研磨过筛小鼠脾脏和淋巴结获得单个细胞，流式分析淋巴结中tem cd8+t(cd44+cd62l-cd8+)，tcm cd8+t(cd44+cd62l+cd8+)，cd8+t(cd44-cd62l+cd8+)，tem cd4+t(cd44+cd62l-cd4+)，tcm cd4+t(cd44+
cd62l+cd4+)，cd4+t(cd44-cd62l+cd4+)，抗体分泌细胞asc(b220-igd-cd138+)，记忆型b细胞(b220+cd138+igd-)，b细胞(b220+cd138-igd+)；及脾脏中tcm cd4+t cd44+cd62l+cd4+)细胞，treg(cd4+cd25+foxp3+)的比例。tem cd8+t细胞，tcm cd8+t细胞，tem cd4+t细胞，tcm cd4+t细胞，抗体分泌细胞，记忆型b细胞能加重疾病或与病情呈正相关，而treg细胞，cd8+t细胞，cd4+t细胞，b细胞与疾病呈负相关或对疾病有缓解作用(结果见图18～图28)。
[0087]
所述流式分析用的流式抗体及试剂均购于bd公司，具体为:
[0088]
cd4:pe，cd8:percp-cy5.5，cd44:apc-cy7，cd62l:pe-cy7；cd19：apc-cy7，b220：pe-cy7，igd：fitc，cd138：apc；cd4：percp-cy5.5，cd25：bb515，foxp3:apc；固定破核膜试剂，固定破包膜试剂。