依拉环素类化合物的应用、药物及其制备方法

1.本发明涉及制药技术领域，特别涉及一种依拉环素类化合物的应用、药物及其制备方法。


背景技术：

2.癌症是造成人类死亡的主要原因之一，恶性皮肤肿瘤是癌症中恶性程度较高的肿瘤，常见的恶性皮肤肿瘤有bowen病、paget病、基底细胞癌、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤等。
3.恶性黑素瘤是由皮肤和其他器官黑素细胞产生的肿瘤，临床症状包括出血、瘙痒、压痛、溃疡等。皮肤恶性黑素瘤的皮损表现与解剖部位及肿瘤的生长方式相关，即与组织学类型相关，组织学类型又因年龄、型别、种族的不同而有很大差异。不同类型的黑素瘤具有不同的病因和遗传学背景，目前黑素瘤的临床组织学分型采用clark分型，包括四型：恶性雀斑痣样黑素瘤(lmm)；浅表扩散性黑素瘤；肢端雀斑样黑素瘤/黏膜黑素瘤；结节性黑素瘤(nm)。
4.虽然应对皮肤恶性黑色素瘤的治疗方案在迅速发展，但是传统药物的毒副作用和耐药性引起的术后复发给治疗带来巨大挑战。因此，有必要提供一种新的可以防治包含皮肤恶性黑色素瘤在内的抗皮肤肿瘤药物。


技术实现要素：

5.基于此，本发明提供了一种依拉环素类化合物的应用、药物及其制备方法。
6.本发明解决上述技术问题的技术方案如下。
7.本发明的一个方面，提供了一种依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用，所述依拉环素类化合物选自依拉环素、依拉环素盐或依拉环素的衍生物中的至少一种。
8.在其中一些实施例中，依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用中，所述皮肤肿瘤包括黑色素瘤。
9.在其中一些实施例中，依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用中，所述皮肤肿瘤药物为制备抑制黑色素瘤细胞增殖药物。
10.在其中一些实施例中，依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用中，所述黑色素瘤细胞为sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞或b16f10细胞。
11.在其中一些实施例中，依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用中，所述皮肤肿瘤药物为抑制黑色素瘤体积增长药物。
12.在其中一些实施例中，依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用中，所述依拉环素盐为依拉环素二盐酸盐。
13.本发明的另一方面还提供了一种防治皮肤肿瘤的药物，包括依拉环素类化合物和药学上可接受的辅料；所述依拉环素类化合物选自依拉环素、依拉环素盐或依拉环素的衍生物中的至少一种。
14.在其中一些实施例中，防治皮肤肿瘤的药物中，所述药学上可接受的辅料选自缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂中的至少一种。
15.在其中一些实施例中，防治皮肤肿瘤的药物中，所述防治皮肤肿瘤的药物为注射剂，所述辅料包括磷酸缓冲盐溶液。
16.相应地，本发明还提供了防治皮肤肿瘤的药物的制备方法，将上述的依拉环素类化合物以及辅料混合。
17.本发明的技术人员通过研究发现，治疗腹腔内感染的四环素类抗生素依拉环素类化合物，具有防治皮肤肿瘤的功效，能有效抑制恶性黑色素瘤sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞和b16f10细胞的增殖，有效抑制恶性黑色素瘤sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞和b16f10细胞的克隆形成能力，以及有效抑制小鼠肿瘤的生长，且对小鼠无明显毒副作用。该应用给治疗腹腔内感染的四环素类抗生素依拉环素类化合物提供了新用途，同时为防治皮肤肿瘤提供了一种新的药物。
18.研究发现，依拉环素类化合物应用于防治皮肤肿瘤的药效明显，应用前景广泛，具有较大的推广应用价值。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为erv组、control组对黑色素瘤sk-mel-5细胞的增殖情况图；
21.图2为erv组、control组对黑色素瘤sk-mel-28细胞的增殖情况图；
22.图3为erv组、control组对黑色素瘤b16f10细胞的增殖情况图；
23.图4为erv组、control组对黑色素瘤sk-mel-5细胞的克隆形成能力影响图；
24.图5为erv组、control组影响黑色素瘤sk-mel-5细胞的相对克隆形成数图；
25.图6为erv组、control组对黑色素瘤sk-mel-28细胞的克隆形成能力影响图；
26.图7为erv组、control组影响黑色素瘤sk-mel-28细胞的相对克隆形成数图；
27.图8为erv组、control组对黑色素瘤b16f10细胞的克隆形成能力影响图；
28.图9为erv组、control组影响黑色素瘤b16f10细胞的相对克隆形成数图；
29.图10为erv组与control组的肿瘤体积实际对比图；
30.图11为erv组与control组的肿瘤体积分析对比图；
31.图12为erv组与control组的小鼠体重对比图；
32.图13为erv组、meropenem组和control组对黑色素瘤sk-mel-5细胞的增殖情况图；
33.图14为erv组、meropenem组和control组对黑色素瘤sk-mel-28细胞的增殖情况图；
34.图15为erv组、meropenem组和control组对黑色素瘤b16f10细胞的增殖情况图。
具体实施方式
35.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
36.因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
37.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
38.术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
39.本发明实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实施例说明书中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
40.除了在操作实施例中所示以外或另外表明之外，所有在说明书和权利要求中表示成分的量、物化性质等所使用的数字理解为在所有情况下通过术语“约”来调整。例如，因此，除非有相反的说明，否则上述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均是近似值，本领域的技术人员能够利用本文所公开的教导内容寻求获得的所需特性，适当改变这些近似值。用端点表示的数值范围的使用包括该范围内的所有数字以及该范围内的任何范围，例如，1至5包括1、1.1、1.3、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5等等。
41.本发明一实施方式提供了一种依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用，依拉环素类化合物选自依拉环素、依拉环素盐或依拉环素的衍生物中的至少一种。
42.依拉环素属于四环素类抗生素，用于治疗复杂腹腔内感染。依拉环素是一种全合成的广谱抗生素，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌菌株均表现出有效的活性，其中包括许多已获得四环素特异性耐药机制的菌株。
43.依拉环素(eravacyclin)，cas号为1207283-85-9，分子式为c
27h31
fn4o8，分子量为558.56，结构式如下：
[0044][0045]
本发明的技术人员通过研究发现，治疗腹腔内感染的四环素类抗生素依拉环素类化合物，具有防治皮肤肿瘤的功效，能有效抑制恶性黑色素瘤sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞和b16f10细胞的增殖，有效抑制恶性黑色素瘤sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞和b16f10细胞的克隆形成能力，以及有效抑制小鼠肿瘤的生长，且对小鼠无明显毒副作用。该应用给治疗腹腔内感染的四环素类抗生素依拉环素类化合物提供了新用途，同时为防治皮肤肿瘤提供了一种新的药物。
[0046]
研究发现，四环素类抗生素依拉环素类化合物应用于防治皮肤肿瘤的药效明显，应用前景广泛，具有较大的推广应用价值；且由于四环素类抗生素依拉环素类化合物是一类现有药物，其毒理药理相对比较清晰，也降低了研发成本。
[0047]
在其中一些示例中，依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用中，皮肤肿瘤包括黑色素瘤。
[0048]
在其中一些示例中，依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用中，皮肤肿瘤药物为抑制黑色素瘤细胞增殖药物。
[0049]
在其中一些示例中，依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用中，黑色素瘤细胞为sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞或b16f10细胞。
[0050]
在其中一些示例中，依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用中，皮肤肿瘤药物为抑制黑色素瘤体积增长药物。
[0051]
在其中一些示例中，依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用中，依拉环素盐为依拉环素二盐酸盐。
[0052]
依拉环素二盐酸盐(eravacycline dihydrochloride)，cas号为1334714-66-7，分子式为c
27h33
cl2fn4o8，分子量为631.48，结构式如下：
[0053][0054]
在其中一些示例中，依拉环素类化合物在制备防治皮肤肿瘤药物中的应用中，防治皮肤肿瘤药物为注射剂。本发明一实施方式提供了一种防治皮肤肿瘤的药物，包括依拉环素类化合物和药学上可接受的辅料；依拉环素类化合物选自依拉环素、依拉环素盐或依拉环素的衍生物中的至少一种。
[0055]
可以理解，药学上可接受的辅料可以选自缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂中的一种，也可以选自选自缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂中的两种或两种以上；且不限于上述所列举的。
[0056]
可以理解，防治皮肤肿瘤的药物的剂型包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、油膏剂、乳膏剂或混悬剂。
[0057]
在其中一些示例中，防治皮肤肿瘤的药物中，防治皮肤肿瘤药物为注射剂，辅料包括磷酸缓冲盐溶液。
[0058]
磷酸缓冲盐溶液(pbs)，主要成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl。
[0059]
在其中一些示例中，防治皮肤肿瘤的药物中，防治皮肤肿瘤的药物的给药形式为涂抹、口服或注射。
[0060]
进一步地，注射包括但不限于静脉注射。
[0061]
本发明一实施方式提供了一种防治皮肤肿瘤的药物的制备方法，包括将上述的依拉环素类化合物以及辅料混合。
[0062]
具体实施例
[0063]
以下按照本发明的依拉环素类化合物的应用、药物及其制备方法举例，可理解，本发明的依拉环素类化合物的应用、药物及其制备方法并不局限于下述实施例。
[0064]
准备试剂：dmem培养基(购自biological industries公司)；1640培养基500ml(购自biological industries公司)；胎牛血清(购自biological industries公司)；胰酶消化液(购自beyotime公司)；pbs粉末(购自servicebio公司)；双抗(购自biological industries公司)；依拉环素二盐酸盐(10mm，溶于dmso，购自mce公司)；美罗培南(购自mce公司)；cck8试剂(购自bimake公司)；
[0065]
仪器：超净工作台、细胞培养箱、离心机、细胞计数仪、负压吸引器、酶标仪；
[0066]
耗材：细胞培养皿、96孔板、15ml离心管及细胞计数板。
[0067]
细胞株：黑色素瘤细胞系sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞和b16f10细胞，来源于中南大学湘雅医院皮肤科实验室；采用含10％fbs的dmem培养基，37℃恒温、5％co2条件下培养、备用。
[0068]
实施例1
[0069]
检测依拉环素对sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞和b16f10细胞的增殖抑制作用
[0070]
试验过程：黑色素瘤sk-mel-5、sk-mel-28细胞以2
×
103个/每孔接种于96孔板进行培养(10％fbs/dmem，37℃，5％co2)；黑素瘤b16f10细胞以1.5
×
103个/每孔接种于96孔板进行培养(10％fbs/1640，37℃，5％co2)；三种细胞分别设有5个试验组和1个对照组，一共18组，每组设6个复孔。14h～16h后，对于黑色素瘤sk-mel-5细胞和sk-mel-28细胞的5个试验组分别加入浓度为500nm、1μm、2μm、5μm、10μm的依拉环素二盐酸盐培养基，对于黑素瘤b16f10细胞的5个试验组分别加入浓度为1μm、2μm、5μm、10μm、20μm的依拉环素二盐酸盐培养基，对照组均加入不含依拉环素二盐酸盐的培养基；分别于24h、48h、72h加入cck8并于培养箱孵育2h，然后酶标仪检测在450nm波长下各孔的相对吸光度(relative absorbance)，相对吸光度可以反应活细胞数量。
[0071]
其中，5个试验组和1个对照组对黑色素瘤sk-mel-5细胞的增殖情况如图1所示；其中，control代表对照组。从图1可知，依拉环素二盐酸盐对黑色素瘤sk-mel-5细胞活性的抑制作用，与对照组相比，差异有统计学意义(p《0.05)，且在500nm～10μm浓度范围内，浓度越高，对黑色素瘤sk-mel-5细胞活性的抑制作用越强；在0～72h内呈时效关系，48h时ic50为1.497μm。
[0072]
5个试验组和1个对照组对黑色素瘤sk-mel-28细胞的增殖情况如图2所示；其中，control代表对照组。从图2可知，依拉环素二盐酸盐对黑色素瘤sk-mel-28细胞活性的抑制作用，与对照组相比，差异有统计学意义(p《0.05)，且在500nm～10μm浓度范围内，浓度越高，对黑色素瘤sk-mel-5细胞活性的抑制作用越强；以及在0～72h内呈时效关系，48h时ic50为4.268μm。
[0073]
5个试验组和1个对照组对黑色素瘤b16f10细胞的增殖情况如图3所示；其中，control代表对照组。从图3可知，依拉环素二盐酸盐对黑色素瘤b16f10细胞活性的抑制作用，与对照组相比，差异有统计学意义(p《0.05)，且在1μm～20μm浓度范围内，浓度越高，对黑色素瘤b16f10细胞活性的抑制作用越强；以及在0～72h内呈时效关系，48h时ic50为6.471μm。
[0074]
实施例2
[0075]
检测依拉环素抑制sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞和b16f10细胞的克隆形成能力
[0076]
试验过程：黑色素瘤sk-mel-5、sk-mel-28细胞以2
×
103个/每孔接种于6孔板进行培养(10％fbs/dmem，37℃，5％co2)；黑素瘤b16f10细胞以1
×
103个/每孔接种于6孔板进行培养(10％fbs/1640，37℃，5％co2)；三种细胞分别设有3个试验组和1个对照组，一共12组，每组设3个复孔。14h～16h后，对于黑色素瘤sk-mel-5细胞的3个试验组分别加入浓度为1μm、2μm、5μm的依拉环素二盐酸盐培养基，对于黑素瘤sk-mel-28细胞和b16f10细胞的3个试验组分别加入浓度为2μm、5μm、10μm的依拉环素二盐酸盐培养基，对照组均加入不含依拉环素二盐酸盐的培养基；培养48h后，弃去每孔培养基，pbs洗2遍，加入新鲜培养基培养数天，形成肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去培养液，pbs洗2次，4％多聚甲醛固定15min，弃固定液，pbs洗涤2次，加入结晶紫染液染20min，pbs冲洗，自然干燥，拍照，计算肉眼可见的克隆数，计算得到的相对克隆数，即克隆形成率。
[0077]
其中，依拉环素对黑色素瘤sk-mel-5细胞的克隆形成能力的影响情况如图4所示，经计算得到的相对克隆形成数(relative colony numbers)如图5所示；从图4和图5可以看出，依拉环素能够抑制黑素瘤sk-mel-5细胞的克隆形成能力；与对照组相比，差异有统计学意义(p《0.05)；且在1μm～5μm浓度范围内，浓度越高，对黑色素瘤sk-mel-5细胞克隆形成能力的抑制作用越强。
[0078]
依拉环素对黑色素瘤sk-mel-28细胞的克隆形成能力的影响情况如图6所示，经计算得到的相对克隆形成数(relative colony numbers)如图7所示；从图6和图7可以看出，依拉环素能够抑制黑素瘤sk-mel-28细胞的克隆形成能力；与对照组相比，差异有统计学意义(p《0.05)；且在2μm～10μm浓度范围内，浓度越高，对黑色素瘤sk-mel-5细胞克隆形成能力的抑制作用越强。
[0079]
依拉环素对黑色素瘤b16f10细胞的克隆形成能力的影响情况如图8所示，经计算得到的相对克隆形成数(relative colony numbers)如图9所示；从图8和图9可以看出，依拉环素能够抑制黑素瘤b16f10细胞的克隆形成能力；与对照组相比，差异有统计学意义(p《0.05)；且在2μm～10μm浓度范围内，浓度越高，对黑色素瘤sk-mel-5细胞克隆形成能力的抑制作用越强。
[0080]
实施例3
[0081]
检测依拉环素对b16f10荷瘤c57bl/6小鼠体内的肿瘤生长的影响
[0082]
试验过程：准备c57bl/6小鼠，背部剃毛后用小鼠黑素瘤细胞b16f10进行皮下成瘤，一旦可触及肿瘤，将小鼠随机分成2组，每组5只小鼠，分别为试验组(erv组)和对照组(control组)。将依拉环素二盐酸盐用磷酸缓冲盐溶液(pbs)溶解，erv组按照每1kg小鼠给与10mg依拉环素二盐酸盐的剂量腹腔注射给予治疗，每天一次；control组给与erv组等量的磷酸缓冲盐溶液(pbs)治疗；隔天测量小鼠体重及肿瘤体积。
[0083]
其中，erv组和control组的肿瘤体积的实际对比图如图10所示；测量每组肿瘤的体积大小，制成曲线，如图11所示，横坐标days after treatment为治疗的天数，纵坐标tumor volume为肿瘤体积；称量各小组的小鼠的体重，erv组和control组的小鼠体重对比图如图12所示，横坐标days after treatment为治疗的天数，纵坐标body weight为小鼠体重；重复实验数据表示为平均值(n＝5)
±
sd；*p＜0.05。从图10和图11可以看出，erv组的小鼠肿瘤体积减少明显，表明依拉环素可有效抑制小鼠体内肿瘤的生长；从图12可以看出，依拉环素对小鼠的体重也基本不影响。
[0084]
对比例
[0085]
检测美罗培南对sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞和b16f10细胞的增殖抑制作用
[0086]
美罗培南(meropenem)，是一种有非常广泛抗菌性及可供注射的抗生素，用于治疗多种不同的感染，包括脑膜炎及肺炎。它是一种β内酰胺类抗生素，属于碳青霉烯。
[0087]
试验过程：黑色素瘤sk-mel-5、sk-mel-28细胞以2
×
103个/每孔接种于96孔板进行培养(10％fbs/dmem，37℃，5％co2)；黑素瘤b16f10细胞以1.5
×
103个/每孔接种于96孔板进行培养(10％fbs/1640，37℃，5％co2)；三种细胞分别设有试验组(erv组)、对比组(meropenem组)和对照组(control组)，每组设6个复孔。14h～16h后，试验组加入浓度为1μm的依拉环素二盐酸盐培养基，对比组加入浓度为1μm的美罗培南培养基，对照组均加入不含依拉环素二盐酸盐以及美罗培南的培养基；分别于24h、48h、72h加入cck8并于培养箱孵育2h，然后酶标仪检测在450nm波长下各孔的相对吸光度(relative absorbance)，相对吸光度可以反应活细胞数量。
[0088]
其中，试验组、对比组和对照组对黑色素瘤sk-mel-5细胞的增殖情况如图13所示，对黑色素瘤sk-mel-28细胞的增殖情况如图14所示，对黑色素瘤b16f10细胞的增殖情况如图15所示。从图13～15可知，依拉环素对黑色素瘤sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞和b16f10细胞活性具有较强的抑制作用，在0～72h内呈时效关系，且与对照组相比，差异有统计学意义(p《0.05)，而美罗培南对黑色素瘤sk-mel-5细胞、sk-mel-28细胞和b16f10细胞活性几乎均无抑制作用。
[0089]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0090]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可
以用于解释权利要求的内容。