专利名称：改善中枢输出的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗或阻止哺乳动物中枢神经系统(CNS)细胞损害-以及周围神经系统保护的方法和治疗组合物，更具体地说涉及提高中枢神经系统内特定的天然存在或者导入的2-或3-肽的浓度以便治疗影响或易于影响CNS(或PNS)细胞的损害或者疾病的方法。发明背景在哺乳动物器官中中枢神经系统是独特的，其中分化的神经元实际上是不能再生的。持久地丧失功能可能是大脑严重损害的结果。特别可悲的是对儿童而言由于难产供氧不足而损害了大脑。因此需要一种用于保护中枢神经系统细胞(也包括神经胶质细胞)免遭损伤后死亡的方法。
在窒息，外伤，中毒，感染，退化，代谢，局部缺血或者供氧不足对人或其它哺乳动物的中枢神经系统(CNS)损害之后，导致几种不同细胞类型产生不同程度的损伤。例如通常认为影响脑室周的少突神经胶质细胞的一种损伤，脑室周角膜白斑软化是供氧不足局部缺血损伤了发育中的前期脑的结果(Bejar et al.，Am.J.Obstet.Gynecol.，159357-363(1988)；Sinha et al.，Arch.Dis.Child.，651017-1020(1990)；Young et al.，Ann.Neurol.，12445-448(1982))。由外伤，窒息，局部缺血，中毒或感染对CNS的损伤经常是并且可以引起感觉，运动或者认识上的缺陷。在CNS中非中枢细胞的胶质细胞是正常CNS功能所必需的。梗塞是一些供氧不足局部缺血诱导的损伤的主要组成成分并且胶质细胞的丧失是梗塞的基本部件。出现了各种各样的“延迟损伤过程”，其中在损伤之后有时明显出现“自我毁灭”神经作用；控制这种作用的尝试似乎能够减轻这种延迟损伤过程的后果。
CNS疾病也可以引起特定细胞群体的丧失。例如多种坏死与髓磷脂和少突神经胶质细胞的丧失有关，类似地，帕金森病与dopaminergic神经元的丧失有关。由CNS受伤或疾病引起神经元和/或其它类型的细胞显著的丧失的一些情形包括与胎儿窘迫例如分离之后，索闭合有关的围产期窒息或者与子宫内生长迟缓有关的围产期窒息；与适当的复苏或呼吸失败有关围产期窒息；与即将死亡的溺水，病床上邻近死亡，一氧化碳的吸入，氨或其它气体中毒，心博骤停，虚脱，昏迷，脑膜炎，贫血和状况癫痫病有关的严重CNS损伤；与冠状分流术有关的大脑局部缺血；与中风，低血压和高血压有关的大脑缺氧症或者局部缺血；大脑外伤。
有许多其它的情况发生了CNS受伤或者疾病引起CNS细胞受破害。在这些情况下治疗受伤是合乎需要的。阻止或降低CNS损害量也是合乎需要的，这种损伤是由于在例如心脏分流术的情况下诱导大脑窒息引起的。
以前我们已经证明(新西兰专利申请№ 239211-“IGF-1 to improveneural outcome，IGF-1对中枢输出的改善作用”，该文内容作为本文的参考)称作为胰岛素类生长因子1(IGF-1)的生长因子具有所谓的不参与作用与防治大脑细胞在窒息后死亡或局部缺血产生的脑损伤(Gluckman et alBiochem Biophys Res Commun 182593--599 1992)。由于胰岛素还具有神经保护作用(Voll et al Neurology 41423-428(1991))并且胰岛素和IGF-1都能够与IGF-1受体结合，通常可推测这种IGF-1行为的脑挽救方式是通过IGF-1受体介导的(Guan et al J.Cereb.Blood Flow Metab.13609-616(1993))。
已知在神经组织中进行蛋白质裂解可以将IGF-1修饰为des 1-3NIGF-1，就是说IGF-1失去了该分子氨基末端的三个氨基酸，于是裂解之后也产生了一个三个氨基酸的肽gly-pro-glu，它是N末端三肽。该三肽也称为GPE。由于des 1-3N IGF-1也能够与IGF-1受体结合，而GPE不能，因此认为GPE对IGF-1的神经元挽救作用没有显著意义。
我们以前的研究已经证明在由于局部缺血-供氧不足而导致大脑受伤之后大脑增加其产生的IGF-1，并且另外大脑还增加两种特定结合蛋白质，IGF结合蛋白质-2(IGFBP-2)和IGF结合蛋白质-3(IGFBP-3)的合成(Gluckman et al Biochem Biophys Res Commun 182593--599 1992)和Klemp et alBrain Res 1855-61(1992)。假设降IGF-1吸收到受伤区域以达到挽救神经元必需的浓度。由于这个原因，预期IGF-1能比不能与该蛋白较好结合des1-3N IGF-1更有效地到达远离受伤处的给定位点。的确对于这种情况，在相等于IGF-1显示神经元挽救作用的剂量，des 1-3N IGF-1作为神经元挽救因子没有显著活性。因此现有技术中暗示在IGF-1受体上IGF-1具有神经元挽救的活性。
到目前为止，在现有技术中没有给出裂解三肽GPE本身从而阻止或治疗由体内CNS损伤产生的CNS受伤或疾病的方法。
发明目的本发明的一个目的是提供治疗或防治CNS损伤的方法和/或药物(治疗组合物)，所说方法和/或药物至少在某种程度上以简单有效的方式满足了需求或者至少给公众提供了有用的选择。发明概述因此从广泛意义上来说，本发明包括治疗哺乳动物(或者病人)的神经损伤的方法，包括下列步骤提高哺乳动物的CNS中三肽GPE(三个氨基酸的肽gly-pro-glu)的浓度和/或GPE类似物的浓度。特别是，有效地增加哺乳动物的CNS中三肽GPE的浓度。
优选的GPE类似物是选自于下列组的肽gly-pro-glu(GPE)，gly-pro和pro-glu。
一方面本发明涉及对中枢神经系统(CNS)的损伤的治疗，为了尽可能地包括GPE作用位点认为该CNS包括细胞体(包括神经元和支座细胞例如胶质细胞或神经鞘细胞等等)定位的神经系统部分。因此周围神经的治疗以及大脑，脊柱索等等的治疗是本发明的一部分。
更具体地说，本发明包含用于治疗至少海马内的神经元损伤的方法。
(本文中使用的术语“治疗”是指通过减少CNS受伤后神经元损失和胶质细胞和其它细胞的损失而至少试图实现使CNS受伤严重程度降低。它包括使CNS受伤后这种损伤降低到最小程度。)(本文中使用的术语“受伤”包括窒息，局部缺血，中风，中毒，感染，外伤，出血以及外科手术对CNS的损伤。)有效地，将GPE和/或其类似物直接施用给病人。另一种方法，给病人施用一种可以增加病人的CNS中GPE或天然存在的GPE类似物的活性浓度。例如，增加有效的IGP-1可以导致GPE浓度增加。
有效地，在受伤之前和/或CNS受伤后直到100小时以及更优选地在CNS受伤后0.5-8小时期间施用该药物。
另一种可选方法是如果认为选定的步骤可能导致对CNS的损伤，则在选定的步骤之前施用该药物，从而可以在该步骤之间提高GPE的含量。
第一种形式，优选地，在CNS受伤到受伤后8小时的时间期间通过外侧脑室注射或者通过外科手术插入导管分流到病人的大脑的外侧脑室而施用选自于下列组的GPE和/或其类似物gly-pro-glu，gly-pro和pro-glu。
另一种优选的形式，在CNS受伤到受伤后8小时的时间期间通过注射到病人的大脑的实质而施用选自于下列组的GPE和/或其类似物gly-pro-glu，gly-pro和pro-glu。
本发明的另一种优选的形式，在CNS受伤到受伤后8小时的时间期间通过传递到病人的大脑的外侧脑室而从外周施用选自于下列组的GPE和/或其类似物gly-pro-glu，gly-pro和pro-glu。采用外周途径，我们计划用静脉，口腔，直肠，鼻，皮下，吸入，腹膜或肌内途径。优选地，借助于外侧脑室注射或者利用外科插入分流而施用GPE本身。
优选地，根据受伤种类或者CNS受伤后逝去的时间施用给药。
优选地，用药的剂量范围是每100gm体重使用0.1μg-10mg的GPE(或者提高其浓度的所说的类似物或化合物)。
更优选地，用药的剂量范围是每100gm体重使用1mg的GPE。
可选择的方案，以约10μg/kg的剂量比例将人工CSF输注到外侧脑室或者其它适合于评价CSF的输注位点。
可以将GPE(或者提高其浓度的所说的类似物或化合物)单独使用或者与能够改善CNS细胞例如胶质细胞和神经元丧失的其它药物或生长因子一起使用。
“阻止”是指在CNS受伤后遭受的CNS损伤的严重程度降低并且因此包括抑制CNS损伤症状。
还有一个方面，本发明提供了GPF和/或其类似物在制备用于治疗CNS损伤的药物中的应用。
另一种可选方法，本发明包括将给病人施用后可以增加病人的CNS中GPE和/或天然存在的GPE类似物的活性浓度的一种化合物在制备用于治疗CNS损伤的药物中的应用。
本发明还包括一种适用于治疗在CNS受伤后遭受的CNS损伤的一种药物，包括在药物学上可接受的载体或者稀释剂中提供的人剂量形式的GPE和/或其类似物。
在一个相关的方面，含有GPE的药物可以与合适的药物学上可接受的赋形剂一起提供。
在另一个相关的方面，含有GPE的药物可以以哺乳动物剂量形式提供。
在另一个相关的方面，用于治疗CNS损伤的药物还可以含有人剂量形式的一种化合物或组合物，在给遭受CNS损伤之后的病人施用后可以增加病人的CNS中GPE和/或其天然存在的GPE类似物的活性浓度。
另一种可选方法，刺激GPE水平的药物可以以哺乳动物剂量形式提供。
本发明进一步提供了用于治疗患有神经系统慢性退化形式的病人的方法，包括在延长期限内施用GPE和/或其类似物。
优选地，以一种形式和通过一种在穿过粘膜时发生吸收的途径将GPE和/或其类似物(必要时与合适的药物学上可接受的载体等等一起使用)施用给这样的病人。
可选择的方案，可以提供具有电荷的分子的GPE和/或其类似物并且通过电泳操作帮助其吸收。
可选择的方案，本发明进一步提供了作为预防应用的一种物质(GPE或者提高其浓度的所说的类似物或化合物)，以使在所指事件(例如特定的操作例如开心脏手术)期间使CNS损伤降低到最小。
尽管上面从广义上定义了本发明，本领域内技术人员将会认识到不仅限于此并且包括所描述的实施例。
附图简述参照下面的实施例和附图可以更好地理解本发明，其中
图1在供氧不足2小时之后仅用50μg的IGF-1赋形剂或者NMDA拮抗剂MK801(1mg)或者IGF-1加MK801处理之后皮层梗死情况。与以前研究情况相似，对于IGF-1处理组皮层梗死发生降低，而MK801效果较小。
图2显示对于胎儿羊局部缺血2小时之后用1μg IGF-1处理的效果的实例。水平轴底下的名称是对于大脑各个部分的标准缩写。该剂量具有神经保护作用但是与MK801不同，不会抑制癫痫发作。
图3显示在供氧不足2小时之后用3μgGPE或者赋形剂处理后皮层梗死和海马损伤情况。[用3μgGPE处理后海马损伤降低。*p＜0.05]图4显示相同试验的结果；其中左边两栏显示在处理之后保留的存活皮层组织区域(栏是从体视学角度考虑的)，作为将大脑的右侧和左侧(受伤)情况的比例，而标记了CA-1的两栏显示在受伤之后保留的活神经元的比例(右侧和左侧的比较)。
图5显示在外周(腹膜)使用GPE之后GPE对海马(CA1-2区域)神经元输出的剂量应答效果。垂直轴显示R/L的比例；大脑的未结扎和结扎侧之间的比例。
图6是显示GPE结合到海马受伤侧的显微照片。
发明技术详述我们已经知道提高在神经组织中进行蛋白质裂解可以将胰岛素类生长因子(IGF-1)修饰为des 1-3N IGF-1，就是说IGF-1失去了该分子氨基末端的三个氨基酸，并且产生了由三个氨基酸组成的N末端三肽gly-pro-glu(GPE)。由于des 1-3N.IGF-1也能够与IGF-1受体结合，而GPE不能，因此认为GPE对IGF-1的神经元挽救作用没有显著意义。令人惊奇的是，GPE是有效的。
我们以前的研究已经证明在由于局部缺血-供氧不足而导致大脑受伤之后大脑增加其产生的IGF-1并且另外大脑还增加两种特定结合蛋白质，IGF结合蛋白质-2(IGFBP-2)和IGF结合蛋白质-3(IGFBP-3)的合成(Gluckman et al Biochem Biophys Res Commun 182593--599 1992)和Klemp et alBrain Res 1855-61(1992)。假设IGF-1吸收到受伤区域以达到挽救神经元必需的浓度。由于这个原因，预期IGF-1能比不能与该蛋白较好结合des 1-3N IGF-1更有效地到达远离受伤处的给定位点。的确对于这种情况，在相等于IGF-1显示神经元挽救作用的剂量，des 1-3N IGF-1作为神经元挽救因子没有显著活性。因此现有技术中暗示在IGF-1受体上IGF-1具有神经元挽救的活性。
到目前为止，在现有技术中没有给出裂解三肽GPE本身从而阻止或治疗由体内CNS损伤产生的CNS受伤或疾病的方法。
令人惊奇的是，我们发现GPE本身是构成了神经元挽救现象的基础。(参见实施例3)。这给我们暗示用IGF-1治疗神经受伤或患病的病人是一个正确的(less soundly)基础课题，因为容易制备一种三肽，并且它是一种更易流动和较小免疫攻击性的化合物，因此预期它是更有效的。
Sara(专利EP 0366638 A2)建议GPE可以作为一种神经调节剂以改变神经元细胞的活性。因为它含有一种谷氨酸和一种甘氨酸，她建议GPE似乎在NMDA类受体上具有作为部分激动剂或拮抗剂的作用。通常的NMDA受体拮抗剂是MK801。因此我们在给定的受伤之后对IGF-1和MK801的作用进行比较并且也寻找任何辅助效果。
本说明书实验1是一个非限制性实施例，显示在受供氧不足-局部缺血损伤的大鼠患者中使用NMDA受体拮抗剂不能模仿或者增加IGF-1的作用。该研究显示IGF-1不能借助于调节神经活性而起作用。与IGF-1相反，GPE和MK801都具有从下丘脑组织释放促性腺激素的相同作用(Bourgignon et al Growth Regulation(在印刷中))，暗示IGF-1具有作为GPE激素原的作用，对于GPE调节NMDA介导的神经活性即激素释放起作用，因此现有技术中没有理由认为GPE是一种神经元挽救因子。因此现有技术中没有暗示IGF-1具有作为激素原以形成依次可阻止神经元死亡的GPE。同样现有技术中暗示IGF-1通过IGF-1受体起作用。
实验2在胎儿羊上完成的非限制性实施例，显示在胎儿羊的局部缺血模型中诱导神经元挽救作用的IGF-1不能抑制皮层脑电描记活性而MK801可以(Tan et al Ann Neurol 32677-682(1992))。
实验3是一个非限制性实施例，显示尽管现有技术中暗示IGF-1具有借助于IGF-1受体作为神经挽救因子的作用但是不能调节神经元活性，GPE具有作为神经元挽救因子的效力如IGF-1一样。在供氧不足-局部缺血损害之后不久但是在DNA降解出现之前将GPE给到特定区域，预先试验在对照动物中该区域显示神经元死亡。海马神经元损伤和皮层梗死的降低程度反映出由于窒息产生的神经元和胶质细胞损伤较小。由GPE引起的对细胞死亡的防止作用的机理还不知道，但是显然不是通过调节神经元活性起作用的。
实验4在21天龄大鼠上完成的非限制性实施例，显示当在包括供氧不足的损伤之后2小时，腹膜给药后GPE对神经元输出的显著有效作用。
Sara已经证明GPE可调节神经元活性，并且由于例如NMDA的因子在治疗神经元损伤方面具有作用，暗示不能提供其在用于治疗神经疾病方面具有用途的证据。但是现有技术中没有我们的权利要求的内容，即通过阻止神经元和胶质细胞死亡GPE可用于阻碍神经元疾病。我们发明针对的临床应用类型总的来说不同于Sara的方法。
我们最近的研究趋向于支持下列发现在海马本身；CA1-2区域GPE的效果挥发最好。因此我们有关GPE等等的资料首先可能是与主要涉及海马的疾病最相关，以及第二方面一旦更好地理解了操作法则涉及其它神经元群体。优选实施例的描述本发明涉及操作神经元损伤的方法。一方面，本发明涉及在CNS受伤发生之后治疗CNS损伤的方法。例如，患者已经患有围产期窒息或与中风相关的窒息或大脑局部缺血或者本文早期描述的其它非限制性的CNS受伤的例子。对于这些情况，降低或去除CNS损伤是令人满意的。
例如在临床上根据神经认识功能缺陷持久的程度，和/或趋向于癫痫发作紊乱的程度测量CNS损伤。(在我们的试验中我们已经使用了组织学技术)。
有人建议为了治疗CNS损伤特别应该提高患者的CNS和大脑中GPE和/或其类似物的浓度。因此，可以直接给患者施用GPE和/或其类似物。我们特别谈到术语“GPE”是指gly-pro-glu或gly-pro或pro-glu。GPE的类似物是指与GPE具有类似生物学活性的化合物。这些化合物可以由人或其它动物产生。GPE和类似物可以从天然来源纯化或由合成技术生产。合成的GPE可通过商业途径购买。
另一种可选方法，可以使用给病人施用后可以增加病人的CNS中GPE和/或天然存在的GPE类似物的活性浓度的化合物。“活性浓度”是指在患者的CNS中能够对治疗CNS损伤起作用的GPE和/或其类似物的生物学浓度。例如，提高IGF-1的活性浓度可以增加GPE的形成。
可以在中央或全身施用GPE，其类似物以及提高其活性浓度的化合物。令人满意的是，直接给患者的CNS施用组合物。因此，采用包括外侧脑室钻洞，或者前囟门，腰椎或淋巴间隙穿刺等等技术直接将组合物施用到大脑或脑脊液。
如果需要，可将化合物结合施用。另外可将它们与其它药剂或生长因子例如转化生长因子β(TGF-β)一起施用。
前面的研究显示，在神经损伤之后，IGF-1的表达随特定的时间过程进行并且在特定的身体区域出现。因此，应该根据CNS损伤的程度和损伤后逝去的时间施用组合物以便产生最令人满意的效果。可直接将该组合物施用到出现CNS损伤最严重的身体区域。
例如可以在损伤之后约0.5-100小时施用该组合物并且仅一次处理是必需的。另一种可选方法，给患者重复治疗。
在直接施用到中央系统时合适的剂量范围是例如每100gm体重约0.1-1000μg的GPE(和/或者提高其浓度的类似物或化合物)。
在受伤之前(以及之后)-例如选定的手术之前进行所说的治疗。有关选定的手术例子包括神经系统手术，其中大脑的脑叶退缩导致脑瘤腺体，或者心脏手术，例如瓣替代，其中在75％的情况下小栓子不可避免地导致脑功能可检测的修复。
本发明还涉及用于治疗CNS受伤的药物。该药物可以含有GPE或者其类似物或在CNS中提高GPE浓度的化合物例如IGF-1。按照需要，该化合物可与本领域内熟知的那些药物学上可接受的载体或稀释剂中提供。可采用肽合成技术制备GPE或者其类似物或提高其浓度的化合物。另一种可选方法，从天然来源分离该化合物。
具有较小或没有免疫作用的化合物可长期施用，只要证明其它副作用是不重要的。我们建议例如可以给患有慢性CNS障碍例如帕金森症，多种坏死，早老年痴呆症，等等的患者长期施用可以在大脑中引起较高GPE浓度的药物化合物(GPE本身)的口服剂量。在这种情况下，由于具有通过从颊粘膜直接吸收置于舌头底下糖锭的特性，GPE应该可以进入循环。我们已经证明通过腹膜途径给药(年幼大鼠)GPE是有效的，所以至少不仅限于注射到CSF。对于这种疾病难于确立GPE的治疗效果，除非进行临床试验。
下面的试验数据支持本发明。在下面的研究中发现1)使用NMDA受体拮抗剂不能模仿或增加IGF-1的神经元挽救作用。
2)与NMDA受体拮抗剂不同，用IGF-1进行的神经元挽救治疗不能抑制癫痫发作。因此，用IGF-1进行的神经元挽救治疗主要不是通过NMDA受体介导的。
3)在CNS中称作为GPE的IGF-1的N末端三肽含量的变化可以改变由于CNS受伤产生的CNS损伤。
通过下面的实施例对本发明进行进一步描述。这些实施例仅是为了描述而不是为了以任何方式限制发明。整个说明书中描述的所有专利和参考文献引入作为参考。所描述的研究由Animal Ethical Committee of the University ofAuckland赞助。实验1
本研究的目的是对在CNS受伤之后以IGF-1和NMDA受体拮抗剂MK801给药后产生的效果进行比较以便查清IGF-1的作用位点。该试验包括在CNS受伤后2小时用赋形剂，IGF-1，MK801或IGF-1加MK801治疗大鼠。这些大鼠具有以标准方式诱导的一个脑半球供氧不足-局部缺血损伤。结扎一个颈动脉半球将动物接受预定时间的供氧不足处理2小时。所选定的供氧不足的程度，长度，室温和湿度使损伤程度标准化。五天之后杀死这些动物，利用特异于坏死神经元的染料(酸性-品红)进行组织学分析。在这些试验中通常细胞死亡仅限制于动脉结扎一侧并且主要是在海马，枢椎脑回和被结扎半球的外皮层。
在3％氟烷/O2麻醉下制备成年Wistar大鼠(68 280-320g)。结扎右侧颈动脉。将一个引导插管置于离前囟前8.2mm和离右侧中线1.4mm的硬脑脊膜中。使大鼠从麻醉状态中恢复1小时，然后在供氧不足前1小时置于湿度为85±5％和温度为34±0.5℃的培养箱中。将氧浓度降低至和保持于6±0.5％ O2，使大鼠处于10分钟的供氧不足状态。供氧不足结束之后将大鼠在培养箱中保持2小时，然后用IGF-1(n＝17)，MK801(n＝17)，MK801+IGF-1(n＝17)或仅用赋形剂处理。通过脑室内(IVC)输注供给50mg的IGF-1或单独的赋形剂(溶于0.15M PBS(pH7.3)中的0.1％BSA)。同时利用1mg MK801/0.5ml或者单独的盐水皮下注射处理大鼠。注射到脑室内的50μg的IGF-1或单独的赋形剂是在1.5％-2％氟烷麻醉剂存在下以1μl/分钟的速率注射到右外侧脑室中的。在各个处理组同时输注大鼠。在实验期间自由地让大鼠吃食，并且在供氧不足之后120小时用过量的戊基巴比妥钠(sodium pentobarbitol)使大鼠无痛苦致死。简单地说，用FAM(甲醛，乙酸，甲醇1∶1∶8)原位灌注大脑，然后用石蜡埋植。用Thionin和酸性品红染色切片。由对实验组一无所知的评价者借助于光学显微镜确定皮层梗死的存在，定义为胶质细胞和神经元的死亡而产生的组织死亡或者实质总坏死区域。
结果显示于图1中，显示了大脑的R(结扎的颈动脉)和L侧，其中A栏是赋形剂，B栏是50μg IGF-1，C栏是1mg MK801，和D栏是50μg IGF-1+1mg MK801。(p(*)＝0.031)与我们自己前面的研究相类似，与对照(65％)(Guan et al J Cereb BloodFlow metab 13609-616(1993))相比IGF-1处理之后皮层梗死发生降低(33％)；而在MK801处理之后发生率为50％。IGF-1与MK801结合后为41％。因此在遭受了供氧不足-局部缺血损伤的大鼠，使用NMDA受体拮抗剂不能模仿或增加IGF-1的作用。实验2本研究的目的是对在胎儿羊中在大脑局部缺血损伤之后以IGF-1处理(图2)和在前面出版的研究工作用NMDA受体拮抗剂MK801给药后对局部缺血后癫痫和神经元损伤的产生的效果进行比较。(Tan et al Ann Neurol32677-682(1992))。
方法相同于早期的研究(Tan et al Ann Neurol 32677-682(1992))。简单地说，用仪器逐渐记录晚妊娠胎儿羊的EEG，颈背活性，血压，然后回到子宫。在整个实验过程中记录皮层的EEG活性，颈背活性和血压并且胎儿羊接受30分钟局部缺血处理。2小时之后通过将1μg IGF-1(n＝6)或赋形剂(人工CSF)(n＝6)输注到外侧脑室而进行处理。五天之后按前面描述固定大脑并且评价神经元损伤(Tan et al Ann Neurol 32677-682(1992))。
图2显示对于大脑的许多区域神经元损伤的分级(以水平轴上的缩写表示)，以未处理侧的百分数表示。在所有情况下赋形剂是左手栏并且1μgIGF-1的效果是右手栏。
结果显示与NMDA拮抗剂处理的羊不同，当电荷活性明显地被抑制时(Tan et al Ann Neurol 32677-682(1992))，IGF-1挽救了神经元(图2)但并不抑制胎儿羊的局部缺血后的癫痫活性。该研究还暗示IGF-1的神经保护作用主要不是通过NMDA受体出现的或者改变大脑的电荷作用。实验3本项研究的目的是将在局部缺血-供氧不足大脑损伤2小时之后用GPE处理的效果与赋形剂处理的效果进行比较。
选定的3μg GPE的剂量的效果相等于前面已经证明具神经保护作用的50μg IGF-1(Guan et al J Cereb Blood Flow metab 13609-616(1993))显示作用。在成年300±10g雄Wistar大鼠中诱导单侧供氧不足-局部缺血损伤。在轻度氟烷麻醉条件下将大鼠单侧颈动脉结扎。恢复1小时之后在受伤之前1小时将它们置于34℃，85±5％湿度的培养箱中。将它们吸入窒息(FiO26.0％)10分钟，并且在窒息之后1小时保持于培养箱中。吸入受伤终止2小时后用3μg GPE(n＝15)或仅用磷酸缓冲盐水(n＝15)注射到单个立体定位(stereotaxically)控制的外侧脑室。然后将动物保持120小时，麻醉并且原位固定大脑进行组织学评价。
利用thionin/酸性品红染色技术区别存活的和死亡的神经元(C.Williams，A.Gunn，C.Mallard，P.Gluckman Ped Res，(1990).A.Brown，J.Brierley，J.Neurol Sci，1659-84(1971))。利用评分技术结果显示于图2中。已经证明在未结扎一侧存在神经元损伤，在结扎的海马中与赋形剂处理的对照(p＜0.05，由Fisher’s精确实验确定)相比GPE治疗降低了海马损伤的出现。与我们前面用IGF-1进行的研究相似，与对照/赋形剂处理的大鼠(53％)(Guan et al JCereb Blood Flow metab 13609-616(1993))相比，GPE处理之后皮层梗死降低为27％。
图3显示-在供氧不足之后2小时用赋形剂(A和C栏)或3μg GPE(B和D栏)处理之后皮层梗死(A和B栏)和海马损伤(C和D栏)。[在用3μg GPE处理之后海马损伤降低。星号表示概率p＜0.05。]图4显示对相同实验的晚期的更关键的评价。对于该图，A和B栏显示用对照赋形剂或3μg GPE处理之后大脑皮层的左侧和右侧之间面积损失的比例(利用体视学(stereology)的已知原理可从该面积推断出体积)。利用计算机辅助图象分析技术可测出体积。C和D栏涉及海马和表示在实验之后保留的活神经元的比例；再比较右侧和左侧数。星号表示0.04的概率。在染色之后在显微镜的帮助下计算神经元数。GPE给药之后损伤细胞数目显著地降低。由此，与在成年大鼠中窒息损伤之后单次注射GPE与组织学评价的输出显著提高有关。
按照前面Dragunow等人(1988，Brain Research 462，252-257)用于在大鼠脑内测出GPE结合位点的组织学实验使用定量受体放射自显影以在大脑的冠状切片中定位[3H]-GPE的结合。在低温恒温器上切出新鲜冷冻大脑切片并且在-80℃储存直到使用。然后将切片解冻并且在室温下用50mM Tris HCl(pH7.4)预培养10分钟(每个切片250μl)。然后将切片干燥并且在室温下以5×105数/分钟的速率1小时内向每个切片中加入补充于Tris HCl缓冲液(50mM pH7.4)中的250μl的[3H]-GPE。然后在冰冻Tris HCl中将切片洗涤两次，每次1分钟，随后在冰冻蒸馏水中清洗1分钟。然后在4℃将切片干燥过夜并且暴露于[3H]敏感胶片2星期，然后显影以制备放射自显影照片。
结果显示于图6中，它显示左边海马已经结合到放射性物质上，而右边相应侧几乎没有反应。由于预先存在损伤该侧失去神经元。该放射自显影照片显示GPE的特定的结合位点并且趋向于支持我们的观点即在该重要的核心GPE有特定的作用。实验概述在CNS损伤开始的时间到损伤之后约8小时期间(包括神经损伤后2小时的时间点)单剂量给药GPE(在这些实验中，溶于0.15磷酸缓冲盐水)已经显示在降低或消除神经损伤之后遭受的CNS损伤的严重程度方面有治疗作用。GPE特别适合于降低神经元损失，梗死，和与CNS受伤相关的胶质细胞和其它细胞损失。因此可以看到至少在本发明优选的形式提供了一种用于治疗CNS损伤的方法和/或药物，它能够实质上阻止或治疗CNS损伤。CNS损伤与窒息，供氧不足，中毒，感染，梗死，局部缺血或外伤相关。应意识到的是，本发明主要是应用于人的。但是，本发明的用途不仅限于此，治疗其它非人动物特别是哺乳动物也在本发明的范围内。
因此本发明认识到将含有GPE和/或类似作用的其它化合物的药物在CNS损伤或之后施用到患者产生的作用，结果是通过阻止另外必然的结果，在受伤之后出现的自我诱导损伤而将CNS损伤降低到最小，即不涉及对已经出现的损伤的修复而涉及在受伤时或损伤之后但最终的长期损伤出现之前进行治疗从而降低这种损伤的出现。实施例1对由于围产期窒息生产的婴儿或新生哺乳动物大脑损伤的减轻作用以我们在大鼠和胎儿羊模型上制定的剂量比例，作出一种合适的方法模型，来减轻大脑损伤，其是在胎儿开始遭难12小时内直到120小时后用溶于普通盐水中的GPE或其类似物，以0.1μg/kg-10mg/kg范围的优选剂量比例，和更优选的约为1mg/kg的剂量静脉注射到婴儿的循环中。在处理开始时可以使用更高的载样剂量。另一种可选方法，开始时在约5mg/kg的较高的静脉剂量比例借助于母体的循环施用GPE，而胎盘的功能极强。另一种可选的方法，按照需要使用静脉输注的方法以在人工CSF中10μg/kg的比例输注到外侧脑室。实施例2对由中风引起的人或哺乳动物大脑损伤的减轻作用以我们在大鼠和胎儿羊模型上制定的剂量比例，作出一种合适的方法模型，来减轻大脑损伤，其是在胎儿开始出现神经病症12小时内直到120小时后用溶于普通盐水中的GPE或其类似物，以0.1μg/kg-10mg/kg范围的优选剂量比例和更优选的约为1mg/kg的剂量静脉注射到婴儿的循环中。在处理开始时可以使用更高的载样剂量。另一种可选方法，通过近颈动脉注射施用相同剂量。另一种可选的方法，按照需要使用静脉注射的方法以在人工CSF中10μg/kg的比例输注到外侧脑室。实施例3对由脑内出血引起的人或哺乳动物大脑损伤的减轻作用以我们在大鼠和胎儿羊模型上制定的剂量比例，作出一种合适的方法模型，来减轻大脑损伤，其是在出开始血12小时内直到120小时后用溶于普通盐水中的GPE或其类似物，以0.1μg/kg-10mg/kg范围的优选剂量比例，和更优选的约为1mg/kg的剂量静脉注射到婴儿的循环中。在处理开始时可以使用更高的载样剂量。另一种可选的方法，按照需要使用静脉注射的方法以在人工SCF中10μg/kg-的比例输注到外侧脑室。实施例4对由头部外伤引起的人或哺乳动物大脑损伤的减轻作用以我们在大鼠和胎儿羊模型上制定的剂量比例，作出一种合适的方法模型，来减轻大脑损伤，其是在受伤12小时内直到120小时后用溶于普通盐水中的GPE或其类似物，以0.1μg/kg-10mg/kg范围的优选剂量比例和更优选的约为1mg/kg的剂量静脉注射到婴儿的循环中。在处理开始时可以使用更高的载样剂量。另一种可选的方法，按照需要使用静脉注射的方法以在人工CSF中10μg/kg的比例输注到外侧脑室。实施例5GPE外周给药是有效的本项研究的目的是将在局部缺血-供氧不足大脑损伤2小时之后用GPE处理的效果与赋形剂处理的效果进行比较。选择2-200μg的剂量范围来估测一个大于集中所需的系统剂量的范围。
在21天龄，45±5g Wistar大鼠诱导单侧局部缺血-供氧不足损伤。在轻度氟烷麻醉条件下将大鼠单侧颈动脉结扎。恢复1小时之后在受伤之前1小时将它们置于34℃，85±5％湿度的培养箱中。将它们吸入窒息(FiO28.0％)1分钟，然后回到室温(22℃)并且常氧。受伤终止后2小时每只大鼠用0.25ml的2，20或200μg GPE(n＝15)腹膜注射。然后将动物保持120小时，麻醉并且原位固定大脑进行组织学评价。
利用thionin/酸性品红染色技术区别存活的和死亡的神经元(Guan et al JCereb Blood Flow Metab 13609-616(1993))。结果显示于图5，其中在右侧CA1-2区域到左侧活神经元的百分数的比例为点的高度。A栏是赋形剂，B栏是2μg GPE，C栏是20μg GPE，D栏是200μg GPE。在该图中，利用在Arcsin转化之后比较许多组的单途径ANOVA的方法计算P值(0.031)。
GPE治疗(20μg)降低了海马的CA1-2区的神经元的损伤(p＜0.05)。因此在大鼠中窒息损伤之后单次外周注射GPE与组织学评价的输出的显著提高有关。
选择步骤我们选择腹膜注射途径至少部分是由于在如此小的动物中实施其它途径较困难。而有可能腹膜途径使GPE能更好地进入循环并且因此穿过脑血屏障，虽然其它途径例如静脉，肌内，或皮下途径也是有效的，但是有效剂量鼠可能更大。
上面的实验显示GPE比前面受惠的IGF-1治疗的优点包括与IGF-1不同，它可以穿过脑血屏障并且可以从外周位点进入CNS。药物学除了图5基于的剂量应答实验以外，我们还没有研究GPE的药物学特性。我们期望它在血液中有类似于其它肽的半衰期；我们预期肝和肾十分快速地吸收循环中的GPE，并且我们期望它有相当大的治疗率。由于预期可以快速地吸收，优选地以稳定输注形式静脉给药。优点由本发明提供的，尤其与IGF-1等等相比具有的优点包括(1)活性成分易于在体外或采用其它途径例如重组技术合成。
(2)该小分子易于在体内扩散以及隔室(例如血脑屏障，和粘膜)之间扩散，有助于给药方法的选择并且有助于到达损伤出现位点。
我们已经证明对于非CSF例子腹膜给药是有效的。
(3)该小分子不能攻击免疫系统。所以它可以在较长时期内给药并且可以预防性地给药。
(4)品种之间的差异可能是重要的。
虽然上文中已经从广义上定义了本发明，本领域内技术人员将会认识到本发明不久限于此，并且包括说明书中提供的实施方案。最后，将会认识到进行各种改变和修饰都在本发明要求的范围内。
权利要求
1.一种用于治疗神经元损伤的药物组合物，包括有效量的选自于三肽或一种二肽组成的组中的肽。
2.根据权利要求1所说的药物组合物，其中所说肽选自于包括(a)三肽gly-pro-glu(GPE)，(b)二肽gly-pro，和(c)二肽pro-glu。
3.根据权利要求1所说的药物组合物，进一步包括有效量的一种化合物，它可以在受体动物的神经系统内提高选定肽的浓度。
4.用于治疗胶质细胞神经损伤或者治疗哺乳动物神经元的三肽或二肽在制备药物组合物中的应用，所说药物组合物适于施用于给哺乳动物的神经系统。
5.治疗神经损伤包括哺乳动物的胶质细胞损伤以及神经元损伤的方法，包括施用含有有效量的选自于下列组的肽的组合物(a)三肽gly-pro-glu(GPE)，(b)二肽gly-pro，和(c)二肽pro-glu。
6.根据权利要求5所说的方法，其中，在受到急性损伤之前12小时到之后100小时的期间内施用该肽组合物。
7.根据权利要求6所说的方法，其中在受到急性损伤之后0.5-8小时的期间内施用该肽组合物，以便至少部分在不利于神经细胞存活的条件下在神经系统内存在提高的细胞保护水平的GPE。
8.根据权利要求5所说的方法，与被认为可导致CNS损伤的选定步骤一起使用，其中在选定步骤之前预防性地施用有效量的肽组合物，以便在该步骤期间使神经系统内GPE的水平提高。
9.根据权利要求5所说的方法，其中施用的肽组合物的剂量范围是每Kg体重的受体哺乳动物使用约1μg-100mg的肽。
10.一种适合于哺乳动物神经系统给药的药物组合物，所说的组合物能够使哺乳动物身体产生合成和释放高水平的选自于下列组的三肽或二肽(a)三肽gly-pro-glu(GPE)，(b)二肽gly-pro，和(c)二肽pro-glu。
全文摘要
在受伤之前或通常在之后施用三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸(GPE)以减少中枢神经系统的损伤。在海马内但不排除其它位置GPE特别适用于神经挽救。GPE的优点包括a)它穿过血脑屏障，所以通过外围注射给药是有效的；b)它不易于攻击免疫系统；c)它价廉；d)它的治疗比例高。也可将GPE输注到CSF中。在分娩或选定的脑或心脏手术之前使用该肽。对于慢性神经紊乱可通过皮下途径使用。根据对细胞损伤或死亡和局部皱缩的组织学评价的测量效果，在GPE保护下在外伤包括供氧不足/局部缺血试验损伤之后哺乳动物的CNS(包括哺乳动物胎儿)显示损伤降低。
文档编号A61K38/06GK1142770SQ94195037
公开日1997年2月12日 申请日期1994年12月20日 优先权日1993年12月23日
发明者彼得·戴维·格卢克曼, 克里斯托弗·爱德华·威廉斯 申请人:奥克兰服务有限公司