B细胞淋巴瘤的治疗的制作方法
【专利说明】B细胞淋巴瘤的治疗
[0001] 背景 本发明涉及通过操纵eIF-5Al表达治疗B细胞淋巴瘤的方法。先前已经讨论了包 含靶向针对eIF-5Al基因来抑制对象中该基因的内源表达的siRNA，和编码能够在对象 中表达的突变的eIF-5Al的多核苷酸的组合物用于治疗多发性骨髓瘤的用途（参见US 20100076062 和 20100004314)。
[0002] 发明概沐 本发明涉及通过组合表达质粒施用siRNA治疗B细胞淋巴瘤，所述siRNA阻断内源型 eIF_5Al表达，所述表达质粒提供在对象中不能被轻丁赖氨酸化（hypusinated)的eIF_5Al 的表达。
[0003] 本发明进一步提供通过组合硼替佐米或来那度胺共施用siRNA和表达质粒治疗 多发性骨髓瘤，所述siRNA阻断内源型eIF-5Al表达，所述表达质粒提供不能被羟丁赖氨酸 化的eIF-5Al的表达。
[0004] 附图简沐 图1 :具有DLBCL肿瘤的小鼠中的SNSOl-T剂量反应曲线。
[0005] 图2 :具有DLBCL肿瘤的小鼠中的SNSOl-T剂量反应曲线。
[0006] 图3 :具有DLBCL肿瘤的小鼠中的具有截短的eIF5A的SNSOl-T的剂量反应曲线。
[0007] 图4 :施用SNSOl-T后小鼠体重。
[0008] 图5 :具有套细胞淋巴瘤肿瘤的小鼠中的SNSOl-T剂量反应曲线。
[0009] 图6 :组合来那度胺的套细胞淋巴瘤肿瘤的SNSOl-T治疗。
[0010] 图 7 :SNS01-T eIF-5A 表达质粒（SEQ ID NO: 13)的图谱。
[0011] 发明详沐 本发明提供用于治疗B细胞淋巴瘤，例如，如弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL)、慢性淋巴 细胞性白血病（CLL)、套细胞淋巴瘤和滤泡型淋巴瘤的方法。在一些实施方案中，本发明包 括选择患有B细胞淋巴瘤的患者用于本文所述的治疗方法。
[0012] 本发明提供了治疗B细胞淋巴瘤的方法，其包括施用包含下列的组合物：靶向针 对eIF-5Al的3'端的eIF-5Al siRNA的复合物，包含编码突变eIF5Al的多核苷酸的表达 载体，其中所述突变eIF5Al不能被轻丁赖氨酸化，其中所述siRNA和表达载体被络合到聚 乙烯亚胺以形成复合物。
[0013] 本发明提供了包含靶向针对靶基因的siRNA，和编码能够在对象中表达的靶蛋白 的多核苷酸的组合物用于治疗B细胞淋巴瘤的用途，所述siRNA抑制对象中靶基因的内源 表达，在某些实施方案中，所述多核苷酸在RNAi抗性质粒中（不会被siRNA抑制）。
[0014] 在某些实施方案中，所述siRNA靶向SEQ ID NO: 1中所示的eIF-5Al序列，并且 编码突变eIF-5Al的多核苷酸是eIF-5AlK5(?。表达载体包含编码突变eIF5-Al的多核苷酸 和可操作地连接的启动子以提供对象中的多核苷酸的表达。所述启动子优选是组织特异性 的或普遍存在的。例如，如果所述组合物用于治疗B细胞淋巴瘤，则所述启动子对于癌症驻 留其中的组织是组织特异性的。因此，该启动子可以对于其中B细胞正常被发现的组织，如 骨髓和淋巴组织(如淋巴结和脾脏）是特异性的，或者可以对于其中B细胞正常不驻留但其 中已形成B细胞肿瘤的组织，例如肺或位于隔膜中其它组织部位是特异性的。例如，对于治 疗B细胞淋巴瘤，优选使用B细胞特异性启动子，例如B29。在某些实施方案中，所述表达载 体包含PCpG质粒。
[0015] 本发明还提供了治疗B细胞淋巴瘤的方法，所述方法使用编码截短形式的 eIF-5Al的分离的多核苷酸以及截短的eIF-5Al多肽。所述截短的eIF-5Al多核苷酸在 诱导细胞凋亡和杀死癌细胞中是有用的。截短的多核苷酸可以在表达载体内使用，其然后 施用给哺乳动物。所述截短的eIF-5A形式在哺乳动物内表达并杀死癌细胞。相对于全长 eIF-5Al蛋白，其为约17kDa，所述截短的eIF-5Al蛋白为约16kDa。
[0016] 在某些实施方案中，所述截短的eIF-5Al多核苷酸包含SEQ ID NO: 9所述的序列 或由其组成，并且氨基酸序列包含SEQ ID NO: 10或由其组成。在某些实施方案中，所述截 短的eIF-5Al多核苷酸包含在质粒或表达载体内。质粒和表达载体在下文更详细地描述。 在某些实施方案中，所述表达载体是腺病毒表达载体或是PHM6。在某些实施方案中，当所述 组合物或药物用于治疗多发性骨髓瘤时，所述表达载体包含组织特异性启动子，例如B细 胞特异性启动子（即，B29)。所述表达载体可以包含pCpG质粒。如下文更详细地讨论，所述 表达载体可以络合到聚乙烯亚胺。
[0017] 在某些实施方案中，所述eIF_5Al siRNA和包含突变eIF_5Al siRNA多核苷酸的 表达载体独立地络合到聚乙烯亚胺，例如体外JET-PEI。在其它实施方案中，所述eIF-5Al siRNA和包含突变eIF-5Al多核苷酸的表达载体一起络合到聚乙烯亚胺。
[0018] 本发明进一步提供在需要其的对象中治疗B细胞淋巴瘤的方法，其包括施用包含 靶向针对eIF-5Al基因3'端的eIF-5Al siRNA和表达载体的组合物，所述表达载体包含编 码突变eIF-5Al的多核苷酸，其中所述突变eIF-5Al不能被羟丁赖氨酸化。所述B细胞淋 巴瘤可以是任何弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL)、慢性淋巴细胞性白血病（CLL)、套细胞淋 巴瘤和滤泡型淋巴瘤。
[0019] 包含本文所述siRNA和质粒的组合物可以经由任何适当的方式施用，包括，例如 胃肠外、透皮，鼻内和经口。用于递送的适当的剂型包括但不限于静脉内或肌内施用。在一 些实施方案中，所述剂型包含脂质体，而在其它情况下其包含纳米颗粒。在一些实施方案 中，所述纳米颗粒是聚乙稀亚胺（PEI)纳米颗粒。
[0020] 编码突变的eIF_5Al的多核苷酸优选突变为使得其不能被羟丁赖氨酸化并从而 将不可用于驱动细胞进入存活模式。例如，在一个实施方案中，所述编码eIF-5A的多核苷 酸突变为使得位置50的赖氨酸（K)(其正常被DHS羟丁赖氨酸化）变为丙氨酸（A)或精氨 酸(其不能被羟丁赖氨酸化)。此突变体分别表示为K50A或K50R。
[0021] 在另一个实施方案中，eIF-5Al中位置67的赖氨酸变为精氨酸（R)。此突变体表示 为（K67R)。在另一个实施方案中，位置67的赖氨酸（K)变为丙氨酸（A)并表示为（K67A)。 在另一个实施方案中，考虑了位置47的赖氨酸（K)变为精氨酸的突变体（K47R)。
[0022] 在其它实施方案中，使用eIF_5Al的双突变。一个双突变是其中在位置50的赖氨 酸（K)变为精氨酸（R)并且在位置67的赖氨酸（K)变为精氨酸（R)。此双突变称为K50R/ K67R。此双突变类似地不能被羟丁赖氨酸化，但是氨基酸的变化不改变eIF-5Al的三维结 构，与单突变（K50A)差不多。该双突变从而提供与野生型的3-D形状和折叠非常类似的蛋 白，但因此比单突变更稳定。由于更稳定，其在体内存在更长时间以提供更长的治疗益处。 因此，机体将具有对于正常细胞功能所需但不能被羟丁赖氨酸化的eIF-5A，从而细胞不被 锁入细胞生存模式并逃脱细胞凋亡。
[0023] 由于机体需要elF-tAa用于正常细胞生存和健康的细胞增殖，优选用SiRNA在对 象中不完全关闭表达，例如当SiRNA全身递送时。通过使用不完全消除表达（即，减少表达 但不完全关闭表达）的siRNA或可选地利用给药和/或治疗方案以平衡表达水平均可以实 现eIF-5A表达的控制，以允许健康细胞正常生长和发挥功能并且迫使癌细胞发生细胞凋 亡。
[0024] 可选地，可以利用siRNA的局部递送。如果siRNA局部递送到癌细胞或肿瘤，则表 达优选被敲除。通过敲除表达，周围没有可以被羟丁赖氨酸化的eIF_5Al并且从而没有羟 丁赖氨酸化的eIF-ΑΙ来将细胞锁入生存模式。由于siRNA局部递送到癌症或肿瘤，不需要 具有可用于正常细胞生长的eIF-5A。
[0025] 在某些实施方案中，所述siRNA基本上由SEQ ID NO: 5和6中显示的siRNA构建 体组成。例如，所述siRNA包含靶向针对eIF-5Al的核酸还包含突出，例如U或T核酸，或 者还包含标签，例如his标签(经常称为HA标签，其经常用于体外研宄)。在5'或3'端连 接(或甚至在核酸的连续串内）的分子或额外的核酸可以被包括或落入本发明的范围，只要 所述siRNA构建体能够减少靶基因的表达。优选siRNA靶向eIF-5Al基因的区域，以便不 影响外源多核苷酸的表达。例如所述eIF-5Al siRNA靶向3'UTR或3'端。在SEQ ID NO: 5和6中显示的siRNA是示例性的eIF-5Al siRNA。
[0026] 在一些实施方案中，突变编码eIF_5Al的多核苷酸以编码eIF5Al变体。突变的 eIF-5Al设计以使得变体eIF-5Al不能被翻译后修饰（即，不能被羟丁赖氨酸化)。示例性突 变在上文讨论。
[0027] 本发明的方法还涵盖编码eIF-5A2同种型（GenBank登录号NM 020390)的多核苷 酸的施用。当表达时，eIF-5A2同种型诱导癌细胞中的细胞凋亡(参见US 20070154457)。本 发明从而提供用于治疗B细胞淋巴瘤的方法，例如，如弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL)、慢性 淋巴细胞性白血病（CLL)、套细胞淋巴瘤和滤泡型淋巴瘤，通过施用造成癌细胞中eIF-5A2 同种型表达的多核苷酸，由此诱导细胞凋亡。所述eIF-5A2多核苷酸可以在质粒、载体，例 如腺病毒载体或任何适当的表达载体中递送。
[0028] 在另一方面，本发明提供了治疗对象(例如人）中B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤的 方法，通过施用治疗有效量的靶向针对内源eIF-5Al基因的siRNA以敲除或敲低对象中内 源eIF-5Al基因的表达，和向诊断有多发性骨髓瘤的对象组合硼替佐米（VELCADE)递送如 本文所述的编码eIF-5Al蛋白或其部分的多核苷酸。在某些实施方案中，所述硼替佐米的 治疗有效量范围从0.5 mg/m2至3 mg/m2。在某些实施方案中，硼替佐米的治疗有效量是 约1.3 mg/m2。在某些实施方案中，靶向针对内源eIF-5Al基因以敲除或敲低对象中内源 eIF-5Al基因的表达的siRNA的量，和编码eIF-5Al蛋白或其部分的多核苷酸的递送的量的 治疗有效量如本文所述。在某些实施方案中，靶向针对内源eIF-5Al基因以敲除或敲低对 象中内源eIF-5Al基因的表达的siRNA的量，和编码eIF-5Al蛋白或其部分的多核苷酸的 递送每周施用两次或三次，并且硼替佐米每周施用两次。在一些实施方案中，本发明涵盖选 择患有多发性骨髓瘤并早已接受硼替佐米治疗的患者用于本文所述的治疗方法。
[0029] 在另一方面，本发明提供了治疗对象(例如人）中多发性骨髓瘤的方法，通过施用 治疗有效量的靶向针对内源eIF-5Al基因的siRNA以敲除或敲低对象中内源eIF-5Al基因 的表达，和向诊断有多发性骨髓瘤的对象组