白鲜皮活性成分促进多巴胺转运体增量表达的新功能的制作方法
【技术领域】
[0001]本申请属于药材活性成分新功能的技术领域，尤其涉及于一种分离于中药材白鲜皮的活性成分可促进海马神经元多巴胺转运体增量表达的新功能。
[0002]
【背景技术】
[0003]多巴胺是位于人和哺乳动物体内中枢神经系统的一种重要的神经递质。多巴胺在下丘脑、海马等脑区有着丰量的表达，它们的作用可以直接影响人的情绪，造成快感的产生。与此同时，多巴胺能神经元也被广泛认为是成瘾现象的主要机体承载者。在多巴胺能神经元的作用过程中，多巴胺转运体(Dopamine transporter, DAT)和多巴胺受体(Dopaminereceptor, DA)主要参与了核心的神经传递过程。有研宄表明，儿童多动症的发生与上述两种基因或者蛋白的异常表达密切相关。而多巴胺转运体DAT被广泛认为是参与多巴胺活动的最重要的转运蛋白。
[0004]'^鲜{Dictamnus dascarpus Turcz.)，别名:藓皮、野花椒根皮、臭根皮、北鲜皮，为芸香科白鲜属多年生草本植物，植物本身有特异香味。白鲜属植物全世界约6种，主要分布于欧亚大陆，我国白鲜属植物主要有白鲜和新疆白鲜。白鲜皮为白鲜的干燥根皮，为我国传统中草药，历代本草及《中国药典》2010版一部收载记录其功能主治有清热燥湿、祛风解毒。用于湿热疮毒，黄水淋漓，湿瘆，风瘆，疥癣疮癞，风湿热痹，黄疸尿赤。白鲜皮中的化学成分较为复杂，目前，从白鲜皮中已分离鉴定出的化学成分主要包括柠檬苦素类、生物碱、黄酮类、内酯类、倍半萜及其苷类等。其中柠檬苦素类和生物碱类物质被认为是生物活性物质。现代药理学研宄表明，白鲜皮提取物具有抗菌、抗肿瘤、抗炎与抗变态反应、抗溃疡、抗冠状动脉粥样硬化、保护肝脏和神经等作用，临床上主要用治疗慢性支气管炎、皮肤脱皮症、风湿性关节炎、外出血、荨麻瘆等。但白鲜皮提取物对中枢神经系统的功能作用目前尚未见报道。
【发明内容】
[0005]白鲜皮为常用中药材，其购自安徽省中医院药房。
[0006]白鲜皮活性成分的分离过程为:
将5-10 kg的白鲜皮依次用95%的乙醇、70%乙醇10倍量回收提取三次，每次一小时，将提取液合并，浓缩得浸膏并加水混悬后，依次用石油醚、二氯甲烷及乙酸乙酯进行萃取，得到二氯甲烷提取成分约50g-100g，即为所述白鲜皮的活性成分。
[0007]所述白鲜皮活性成分的识别过程为:
取上述活性成分经硅胶柱层析分离得到四个分离峰，将第一个分离峰继续进行Sedhadex LH-20柱色谱分析并进行重结晶。将所得峰分别进行质谱和核磁共振分析，其中一个分离峰根据E1-MS推测其分子质量为199，为奇数，可能为生物碱类化合物。IH-NMR(CDC13，600 MHz)波谱给出 δ 7.47 (1Η, t, J = 7.2 Hz, H-6)，7.71 (1H, t, J =7.2Hz, H-7), 8.29 (1H, d, J =8.4 Hz，H_5)，8.04 (1H, d, J = 8.4 Hz, H_8)为偶合的苯环信号，4.48 (3H, s，-OCH3)为一个含氧取代的甲基信号，7.11(1? brs, H-3)，7.66(1H, brs, H-2)两个烯碳质子信号。经检索，光谱数据与文献报道的白鲜碱(dictamnine)一致，故确定该化合物为白鲜碱(dictamnine)。因此本申请所述白鲜皮主要活性成分应为白鲜碱。
[0008]白鲜皮活性成分的生理活性检测:
将出生24h内的SD大鼠处死并取海马组织原代培养。将海马组织放在200目筛网上，用眼科剪剪小块过筛，经过100rpm离心8min后倒掉上清液，加高糖DMEM培养基并加入10%胎牛血清，巴氏管吹打后种6孔板。培养条件为37°C5%水平的二氧化碳。每隔三天更换培养基。在培养至第7天时，向其中三孔的原代培养细胞加入终浓度为10 μM的上述白鲜皮提取物，另外三孔加入同样体积的无菌水作为对照组。继续培养至14天时，回收细胞。使用本领域常规的技术手段提取细胞中总mRNA、反转录为cDNA，并使用Cycle480 (Roche)荧光定量PCR仪(使用SybrGreen染料)对DAT的表达量进行定量分析。所使用的PCR条件为:95°C预变性5min，然后是95°C10s，60°C 10s，72°C 30s扩增共40个循环。所使用的引物为:上游TGCTGCACAGACACCGTGAG;下游AAATGGTCCAGGAGCGTGAA。所获得的定量数值为DAT表达量与内参基因GAPDH的相对比值。
[0009]实验组和对照组所获得的mRNA相对定量结果如图1所示。
[0010]从图1中可以看出，经过白鲜皮活性成分的处理，DAT基因的表达量有了明显的提高，其表达量为对照组的3.3倍。
[0011]本申请首次证明了白鲜皮活性成分对大鼠中枢神经系统多巴胺能神经元的调节作用，该结果意味着该成分可以参与到人和哺乳动物的情感、成瘾及运动控制等神经活动中，并对该活动施加影响，同时为多动症、抑郁症等精神疾病的治疗提供了潜在的解决方案。
【附图说明】
[0012]图1白鲜皮提取物处理所引起的大鼠海马神经元DAT基因的表达变化。
[0013]Control指对照组；substances’ addit1n指白鲜皮提取物处理组；纵坐标为相对mRNA水平。
[0014]
【具体实施方式】
[0015]实施例1
白鲜皮活性成分的分离过程为:
将5 kg的白鲜皮依次用95%的乙醇、70%乙醇10倍量回收提取三次，每次一小时，将提取液合并，浓缩得浸膏并加水混悬后，依次用石油醚、二氯甲烷及乙酸乙酯进行萃取，得到二氯甲烷提取成分约50g，即为所述白鲜皮的活性成分。
[0016]实施例2
将1kg的白鲜皮依次用95%的乙醇、70%乙醇10倍量回收提取三次，每次一小时，将提取液合并，浓缩得浸膏并加水混悬后，依次用石油醚、二氯甲烷及乙酸乙酯进行萃取，得到二氯甲烷提取成分约100g，即为所述白鲜皮的活性成分。
[0017]实施例3
将8 kg的白鲜皮依次用95%的乙醇、70%乙醇10倍量回收提取三次，每次一小时，将提取液合并，浓缩得浸膏并加水混悬后，依次用石油醚、二氯甲烷及乙酸乙酯进行萃取，得到二氯甲烷提取成分约80g，即为所述白鲜皮的活性成分。
[0018]实施例4
所述白鲜皮活性成分的识别过程为:
取上述活性成分经硅胶柱层析分离得到四个分离峰，将第一个分离峰继续进行Sedhadex LH-20柱色谱分析并进行重结晶。将所得峰分别进行质谱和核磁共振分析，其中一个分离峰根据E1-MS推测其分子质量为199，为奇数，可能为生物碱类化合物。IH-NMR(CDC13，600 MHz)波谱给出 δ 7.47 (1Η, t, J = 7.2 Hz, H-6)，7.71 (1H, t, J =7.2Hz, H-7), 8.29 (1H, d, J =8.4 Hz,H-5), 8.04 (1Η, d, J = 8.4 Hz, H-8)为偶合的苯环信号，4.48 (3H, s，-0CH3)为一个含氧取代的甲基信号，7.11(1? brs, H-3)，7.66(1H, brs, H-2)两个烯碳质子信号。经检索，光谱数据与文献报道的白鲜碱(dictamnine)一致，故确定该化合物为白鲜碱(dictamnine)。因此所述白鲜皮主要活性成分应为白鲜喊。
[0019]实施例5
白鲜皮活性成分的生理活性检测:
出生24h内的SD大鼠处死并取海马组织原代培养。将海马组织放在200目筛网上，用眼科剪剪小块过筛，经过100rpm离心8min后倒掉上清液，加高糖DMEM培养基并加入10%胎牛血清，巴氏管吹打后种6孔板。培养条件为37°C5%水平的二氧化碳。每隔三天更换培养基。在培养至第7天时，向其中三孔的原代培养细胞加入终浓度为10 μM的上述白鲜皮提取物，另外三孔加入同样体积的无菌水作为对照组。继续培养至14天时，回收细胞。使用本领域常规的技术手段提取细胞中总mRNA、反转录为cDNA，并使用Cycle480 (Roche)荧光定量PCR仪(使用SybrGreen染料)对DAT的表达量进行定量分析。所使用的PCR条件为:95°C预变性5min，然后是95°C10s，60°C 10s，72°C 30s扩增共40个循环。所使用的引物为:上游TGCTGCACAGACACCGTGAG;下游AAATGGTCCAGGAGCGTGAA。所获得的定量数值为DAT表达量与内参基因GAPDH的相对比值。经过白鲜皮活性成分的处理，DAT基因的表达量有了明显的提高，其表达量为对照组的3.3倍。
【主权项】
1.一种分离于白鲜皮的活性成分，其特征在于，其分离方法为:10 kg的白鲜皮依次用95%的乙醇、70%乙醇10倍量回收提取三次，每次一小时，将提取液合并，浓缩得浸膏并加水混悬后，依次用石油醚、二氯甲烷及乙酸乙酯进行萃取，得到二氯甲烷提取成分约10gjP为所述白鲜皮的活性成分。
2.一种如权利要求1所述活性成分的新功能，其特征在于，该成分的加入可促使大鼠海马原代培养神经元的多巴胺转运体基因伽对曾量表达，与对照组相比，伽伽mRNA水平增加为原来的3.3倍。
【专利摘要】白鲜皮是一种重要的中药材。本申请介绍白鲜皮活性成分的一种新功能，通过其对大鼠原代培养神经元的作用实验，我们发现白鲜皮活性成分的加入能够促进多巴胺转运体基因DAT的过量表达，由于多巴胺能神经元对情绪、上瘾、运动控制等行为有重要的影响，上述结果表明白鲜皮活性成分的使用可促进人体快感、运动控制等功能的变化。
【IPC分类】A61K36-75, A61P25-00
【公开号】CN104739999
【申请号】CN201510180223
【发明人】不公告发明人
【申请人】徐毅
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月16日