卵泡发育和卵细胞成熟的刺激的制作方法
【专利说明】卵泡发育和卵细胞成熟的刺激
[0001 ] 联邦政府资助的研究和开发
[0002]本发明是在政府支持下根据美国国立卫生研究院授予的许可HD068158进行。政府享有本发明中的某些权利。
【背景技术】
[0003]哺乳动物生殖细胞的生长和成熟被包括由垂体前叶分泌的促性腺激素和局部旁分泌因子的激素复杂地控制。在成人卵巢内的大多数卵细胞(或卵母细胞)维持处于第一减数分裂前期的延长阶段，由周围卵泡体细胞被膜。周期性地，一组原始卵泡进入卵泡生长阶段。在此期间，卵细胞经历大体积增加，且卵泡颗粒细胞的数目增加。成熟卵细胞合成允许卵泡细胞增殖的旁分泌因子，且卵泡细胞分泌增强血管形成并允许卵细胞生长的生长和分化因子。在进行到某一阶段之后，卵细胞和它们的卵泡死亡，除非将它们暴露于防止体细胞凋亡的促性腺激素。
[0004]哺乳动物卵巢由作为基础功能单元的卵泡组成。卵泡的总数在年轻时确定，且该池的消耗导致生殖衰老(reproductive senescence)。每个卵泡发育，从而排卵或经历变性。单独的卵泡由最里面的卵细胞、周围的颗粒细胞和外层的卵泡膜细胞组成。每个卵泡的命运由内分泌因子以及旁分泌因子控制。在获取窦腔之前，卵泡发育经过原始阶段、初级阶段和次级阶段。在窦阶段，少数卵泡在青春期之后出现的周期促性腺激素刺激下达到排卵前阶段，并成为生殖年龄妇女的卵巢雌激素的周期分泌的主要来源。响应在每个生殖周期期间的排卵前促性腺激素激增，优势格拉夫卵泡(Graafian follicle)排卵以释放成熟的卵细胞以便受精，而剩下的卵泡膜和颗粒细胞经历转化以变成黄体。
[0005]—旦进入生长池，卵泡则在最低程度的损失下继续发展到初级阶段、次级阶段和早期窦阶段。尽管FSH治疗主要通过抑制早期窦卵泡的细胞凋亡而广泛用以在不孕患者中产生排卵前卵泡，但一些患者是对FSH治疗的低应答者，因为她们的卵巢含有很少的早期窦卵泡，如通过在月经周期的第三天她们升高的血清FSH和较低AMH水平所反映。
[0006]在整个生殖期中，原始卵泡经历初始募集以进入初级卵泡的生长池。在人类卵巢中，据估计初级卵泡达到次级卵泡阶段需要大于120天，而据估计从次级卵泡阶段生长到早期窦阶段需要71天。一旦开始进入生长池，卵泡就会发展达到窦阶段，并且直至早期窦阶段，都见到最低程度的卵泡损失。在周期募集期间，循环FSH的增加允许一群窦卵泡逃脱细胞凋亡性死亡。在该群体之中，主导卵泡通过分泌高水平的雌激素和抑制素以抑制垂体FSH释放而占优势地形成。结果是负向选择剩余的群体，导致其最后死亡。附随地，局部生长因子和脉管系统的增加允许正向选择优势卵泡，因此确保其最终生长和最后排卵及黄体形成。在周期募集之后，窦卵泡仅用2周就变成优势格拉夫卵泡。人类卵泡从原始阶段到排卵前阶段的总体发育需要超过6个月。
[0007]卵泡从最小的原始和初级卵泡发育到最大的排卵前卵泡需要不同的阶段依赖性刺激和存活因子。卵泡从初级阶段有效成熟到次级阶段、窦阶段和排卵前阶段的方法具有重大意义，包括用于体外和体内卵泡成熟的方法。本发明解决了该问题。
【发明内容】
[0008]提供通过以下促进哺乳动物卵泡生长到排卵前阶段的组合物和方法:使哺乳动物卵泡与有效剂量的破坏Hippo途径中信号传导的试剂或在被破坏的Hippo信号传导的下游起作用的试剂中的至少一种接触足以使所述卵泡生长到排卵前阶段的时间。所述接触可在不存在卵巢的实体破坏，即卵巢完整的情况下进行。在一些实施方案中，所述卵泡在离体培养物中接触所述试剂。在其它实施方案中，所述卵泡在体内与所述试剂接触。在所述接触在体内进行的情况下，所述试剂可局部地施用至所述卵巢，例如施用至遭受卵巢功能早衰的妇女、遭受多囊性卵巢综合征的妇女、中年不孕妇女等。所述有效剂量为允许卵泡经历充分生长以达到排卵前阶段的剂量。
[0009]破坏所述Hippo途径中信号传导的试剂包括聚合或稳定聚合肌动蛋白的试剂。这类试剂包括已知的药物，包括而不限于环肽jasplakinolide (JASP);和鞘氨醇1-磷酸(S1P，或1-磷酸鞘氨醇)受体调节剂，例如S1P、FTY720、溶血磷脂酸(LPA)等。在被破坏的Hippo信号传导的下游起作用的试剂包括CCN生长因子蛋白，例如CCN 2、3、5或6。
[0010]本发明的方法可与使所述卵泡与活化卵泡生长的另外试剂接触的步骤进一步组合，所述步骤包括而不限于使所述卵泡与磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3激酶)活化剂中的至少一种接触，其提供相加效果。
[0011]在本发明的一些实施方案中，所述暴露在体外，例如在器官或组织培养物中进行，其中将至少一个卵泡暴露于有效剂量的破坏所述Hippo途径中信号传导的试剂或在被破坏的Hippo信号传导的下游起作用的试剂中的至少一种。处理过的卵泡可用于体外目的，例如用于体外受精，产生胚胎干细胞等，或可移植以提供体内用途。目标移植模式包括而不限于将一个或多个包括在未被实体破坏的卵巢中存在的卵泡的卵泡移植到肾囊、靠近输卵管的皮下部位、卵巢部位，例如，在保留一个卵巢，而另一卵巢已被移出用于离体处理的情况下，所述一个或多个处理过的卵泡可移植到所述剩余卵巢的部位。
[0012]在一些实施方案中，体外处理后面是卵巢移植，从而活化卵泡以产生排卵前卵细胞，其后面可为体外或体内受精。
[0013]目标个体包括濒危物种、经济上重要的动物、遭受卵巢功能早衰的妇女、遭受多囊性卵巢综合征的妇女、中年不孕妇女、来源于人类胚胎干细胞和原始生殖细胞的卵泡等。在其它实施方案中，所述暴露在体内局部地，例如通过卵巢内注射，或全身地施用至个体来进行。
[0014]在个体暴露于有效剂量的破坏所述Hippo途径中信号传导的试剂或在被破坏的Hippo信号传导的下游起作用的试剂中的至少一种之后，可将所述个体用在有效开始卵泡生长的浓度下的卵泡刺激激素(FSH)或FSH类似物处理，所述卵泡刺激激素(FSH)或FSH类似物包括重组FSH，在体内宿主动物中天然存在的FSH、FSH类似物如FSH-CTP、聚乙二醇化FSH等。
[0015]在已经刺激所述卵泡以达到所述排卵前阶段阶段的情况下，可将所述个体用排卵剂量的促黄体产生激素(LH)或其激动剂处理，所述激动剂特别地包括绒毛膜促性腺激素，例如马绒毛膜促性腺激素(eCG)、人类绒毛膜促性腺激素(HCG)等。另外，可将所述卵泡体内或体外暴露于c-kit配体、神经营养蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白(BMP)-4、BMP7、白血病抑制因子、基础FGF、角质细胞生长因子等中的一种或多种。
[0016]根据本发明用有效剂量的破坏所述Hippo途径中信号传导的试剂或在被破坏的Hippo信号传导的下游起作用的试剂中的至少一种有效刺激的时间通常为至少约I小时且不超过约5天，并且可为至少约12小时且不超过约4天，例如2、3、4或5天。
【附图说明】
[0017]图1.卵巢碎裂和移植促进在小鼠中的卵泡生长。将来自未成年小鼠的配对卵巢移植到成年切除卵巢的小鼠的肾中(完整:IN;部分:PI)。在移植物收回之前对宿主每日注射FSH，历时5天。A，有或没有碎裂成三部分的配对卵巢移植物的形态。上图:在肾囊内的移植物；下图:分离的配对移植物。B，在来自10天(DlO)小鼠的配对卵巢碎裂成2-4部分并在移植之前培育1-24小时之后配对卵巢的重量。将在移植之前(DlO)和在移植之后5天具有FSH处理(D15FSH)或没有FSH处理(D15)的卵巢重量充当对照。η = 8-22。C，在移植来自10天小鼠的完整卵巢和碎裂卵巢(3部分)前后的卵泡动力学。左:总卵泡数，右:卵泡动力学。η = 5。Pmd =原始；Prm =初级；Sec =次级；P0 =排卵前。D，来自处于不同龄的小鼠的配对卵巢在碎裂成3-4部分并移植之后的重量。平均值土SEM;*p〈0.05。η=8-22。
[0018]图2.鼠卵巢的碎裂增加肌动蛋白聚合、破坏Hippo信号传导并增加CCN生长因子和细胞凋亡抑制剂。A，卵巢碎裂增加F-肌动蛋白水平。在免疫印迹分析F-肌动蛋白和G-肌动蛋白水平(上图)之前将来自10天小鼠的配对卵巢切割成3部分或保持完整。下图:F-肌动蛋白与G-肌动蛋白的比率。N = 6-11。B，卵巢碎裂减小磷酸基-YAP(PYAP)水平和pYAP与总YAP的比率。将切割或没有切割的配对卵巢培育I小时，接着免疫印迹。左图:代表性免疫印迹；右图:不同抗原的比率。η = 8对。C，卵巢碎裂增加CCN生长因子和BIRC细胞凋亡抑制剂的表达。在通过GAPDH标准化来分析转录体水平之前，将切割或没有切割的配对卵巢培育I小时，接着移植。完整卵巢:实线，汇合的3部分:虚线。η = 10-15。D，卵巢碎裂增加CCN2蛋白。在免疫印迹之前，将切割或没有切割的配对卵巢培育3-5小时。上图:代表性印迹；下图:定量分析。N = 3-5ο Ε，用CCN2、3、5和6处理增加卵巢外植体重量。在称重之前，将来自10天小鼠的外植体用不同的CCN生长因子培养4天。η = 5-6。平均值土 SEM ；*ρ<0.05。IN =完整；PI =部分。
[0019]图3.Hippo信号传导破环和Akt刺激促进次级卵泡生长的相加效果。A)次级卵泡响应IVA处理。将次级卵泡(直径115 μπι)从10天龄的小鼠中分离并用标准IVA方案体外培养(第一天，用3mM的bPV(hopic)和15ug/ml的740YP培养，接着再单独用740YP培养一天)，接着再每日用FSH(100ng/ml)处理两天(IVA+FSH)。将对照组单独用培养基处理4天，或者用IVA试剂处理两天，接着单独用培养基(单独IVA)处理。B)卵巢碎裂和IVA处理对卵巢重量增加和次级卵泡生长产生相加效果。将来自10天龄小鼠的配对卵巢碎裂成三部分。将来自一侧的碎片用IVA方案处理(30uM bpV(hopic)和150ng/ml740YP处理I天，接着再仅用740YP处理一天)，而将来自对侧的碎片仅在培养基中培育。随后将卵巢碎片异体移植到成年切除卵巢的小鼠的肾囊中，其中对宿主注射FSH (每日，IIU/动物)。5天后，将卵巢移植物收回，固定并称重。左图:移植物重量；右图:移植卵巢碎片的卵泡动力学。处于不同阶段的卵泡的百分数基于移植物的连续切片测定。C，用或未用Akt刺激剂处理的完整和碎裂的鼠卵巢在移植前后的卵泡动力学。左:总卵泡数，右:卵泡动力学。η =
4。上述字母符号指示显著差异(ρ〈0.05)。D-F.将玻璃化人类皮层带解冻并碎裂成立方体，之后用Akt刺激剂处理2天，接着移植到免疫缺陷小鼠中历时4周。D.在移植之前的皮层带。箭头:次级卵泡，三角(arrowhead):原始/初级卵泡。标度条，100 μπι。Ε.就地肾移植物(左)和在分离之后的肾移植物(右)，显示窦卵泡。F.两个大窦卵泡的组织学，其中一个的侧视图显示处于胚泡阶段的卵细胞(箭头)。标度条，1mm。平均值土SEM ;*p<0.05。
[0020]图4.卵巢碎裂/移植产生有活力的幼崽。A，在有或没有切割成三部分的情况下，接着移植5天，来自10天小鼠的卵巢移植物的代表性组织学。条形图= 200 μπι。B，在移植来自10天龄小鼠的完整和碎裂(3部分)的卵巢前后的绝对卵泡数。左:总卵泡数，右:卵泡动力学。η = 5个卵巢。上述星号符号指示显著差异(ρ〈0.05)。C，在切割/移植来自10天小鼠的卵巢之后取回卵细胞(左图)，以便受精和胚胎发育。显示成熟卵细胞的百分数(中图)和发育到不同胚胎阶段的受精卵细胞的分数(右图)。在右图中的对照表示在用eCG处理23天小鼠、接着用hCG处理以诱发排卵(3)之后获得的卵细胞。η = 8个卵巢。GVBD:胚泡分解。D.在转移从在卵巢碎裂/移植之后获得的成熟卵细胞得到的胚胎之后产出健康幼崽。将来自10天B6D2F1小鼠的卵巢碎裂成三部分，之后移植5天，其中每日FSH处理。随后将动物用eCG(48小时)和hCG(12小时)依次处理，之后取回成熟卵细胞以便受精和胚胎培养。将2-细胞胚胎转移到CDl品系的代孕母体，接着妊娠并生产。由卵巢碎裂得到的幼崽是健康并能生育的。E和F，卵巢碎裂和移植促进大鼠的卵泡发育。来自10天大鼠的配对卵巢完整地或以三部分自体移植到相同动物的肾中。在测定卵巢重量之前，将动物用FSH处理5天。E，分离的卵巢的形态。F.卵巢重量。在括号中的数为所使用的卵巢的数。平均值+/-SEM，ρ〈0.05。
[0021]图5.在卵巢碎裂之后Hippo途径基因的卵巢表达并增加核YAP定位。Α，在10天小鼠卵巢中Hippo途径基因的转录体的实时RT-PCR分析。η = 6。B，在10天龄(dlO)小鼠的卵巢中Hippo途径蛋白的免疫印迹。来自3T3细胞的提取物充当对照(3T3)。特殊信号用箭头标记。PYAP:磷酸基-YAP(Serl27)。C，在成年小鼠的卵巢中的Hippo信