椎间盘的修复和/或重建的制作方法
【专利说明】椎间盘的修复和/或重建 发明领域
[0001] 本发明涉及个体中椎间盘修复和重建的方法，本发明的方法在治疗特征为椎间盘 退变的脊柱疾病状况中是有用的。
[0002] 发明背景
[0003] 椎间盘（IVD)是人体内最大的主要无血管、无神经并且无淋巴的结构。椎间盘对 于脊柱的正常功能至关重要，因为其在轴向压缩、弯曲和伸展中提供柔韧性和机械稳定性。 IVD由数种特定的结缔组织组成：（i)软骨终板（CEPs)的透明软骨，所述软骨终板覆盖位于 椎间盘上方和下方的脊椎骨（体）的表面；（ii)封装髓核（NP)的纤维软骨纤维环（AF);和 (iii)中央胶状的髓核（NP)，尽管其含有软骨样细胞，但其不是透明软骨。已经鉴定出移行 区（TZ)，正如其名称所指，其位于AF和NP之间。纤维软骨AF由同心胶原层（骨板）组成， 所述同心胶原层与椎体的骨边缘连接。
[0004] 蛋白聚糖（PGs)和I型、II型、III型、V型、VI型、IX型、X型、XI型胶原蛋白是所 有这些椎间盘组织的主要基质成分，但它们的相对丰度和分布取决于它们的解剖学定位。 具有对于水分子的高亲和力的PGs在"健康椎间盘"的NP中最丰富。PGs所吸收的水在NP 内产生流体静力压，所述流体静力压使封装的纤维软骨AF"膨胀"。这些特定的结缔组织及 其各自的生理化学性质的联合有助于IVD的水动力学性质和粘弹性性质，所述水动力学性 质和粘弹性性质是脊柱的正常生物机械功能所必需的。
[0005] 在衰老和退变中，IVD发生显著的基质改变。对于人类尸体和脊柱手术时获得的椎 间盘样本的研究表明，来自中年至老年群体中的个体的椎间盘通常具有大范围的病变（1， 2) 〇
[0006] 从这些样本中已鉴定出三种主要类型的椎间盘病变：（i)边缘病变，即靠近于AF 与椎体边缘的骨的连接横截面缺损；（ii)同心（圆周）撕裂，其中环状骨板彼此分离；和 (iii)辐射状撕裂，其来自始于NP内的裂口的扩展（1，2,3)。边缘病变尤其受到关注，因为 其较常见出现于青春期和成年早期，AF前部内，AF前部靠近于AF在椎骨边缘的骨中的插 入，这提示所述边缘病变可能是机械上介导的。边缘病变的存在提示AF的早期衰竭并且是 椎间盘退变的首要原因，但对尸体样本的研究还表明其他病理学特征（同心撕裂、囊性环 状退变、NP脱水、椎骨边缘韧带骨赘和后椎间关节的骨关节炎）也在某种程度上始终存在 (1，2)。尽管这些各自的椎间盘病变的时间历史仍然是争论的主题，但公认的是来源于PGs 及其相关的水从NP的丢失是椎间盘退变的早期病因学决定因素（4)。
[0007] 如已经所讨论的，椎间盘作为柔韧的水弹性垫发挥功能，其很大程度上受NP中水 分子的吸取所调节。NP水含量的减少并由此的膨胀压的减少将导致强加于AF的超生理机 械压迫，导致局部衰竭。
[0008] 90%的人口在他们生活的某些时间会发生起因于椎间盘退变的背部和颈部疼痛 相关的医学问题（5,6)。在人类中，足够的严重程度而需要医疗介入的背部或颈部疼痛的发 生率在30多岁和40多岁时增加，在50多岁时达到高峰并在此后下降（5)。
[0009] 在美国，背部疼痛是就诊的第二位最常见原因，并且背部和颈部疼痛相关的医学 状况造成多于任何其他肌肉骨骼病症的住院治疗。背部疼痛是损失工作时间的首要原因。 例如，在英国，据估计每年由于该疾病损失超过一千一百万的工作天数。此外，由于在接下 来的几十年人口的长寿增加，所以预计背部和颈部疼痛问题会相应增加。
[0010] 尽管在当今社会中，颈部和背部疼痛具有高发生率和经济负担，但是原因仍了解 很少。然而，达成共识的是，IVD的退变和/或衰竭是疼痛的首要原因，该疼痛或者直接来 自于外部AF中存在的神经或者来自由于椎间盘水弹性功能的丢失而变为机械上受损的邻 近的脊柱结构（7,8,9,10)。椎间盘疾病是所有下背部疼痛病例中23%-40%的原因（11， 12)。外部AF受神经支配并且神经纤维可以延伸到其内部三分之一的深度，因此外部AF的 任何病理学改变可能引起疼痛（13,14,15)。
[0011] 用于治疗椎间盘来源的背部或颈部疼痛的已有模式是以经验为依据的，其致力于 生活方式的改变或者使用抗炎药/镇痛药缓解症状或者可能需要切除退变组织或用于限 制运动的脊柱关节融合术的手术介入。尽管用于缓解颈部或下背部疼痛的脊柱融合术被广 泛使用，但是已知这并不是无害的手术，因为通过越过椎间盘间隙引入刚性节段而强加于 邻近椎间盘的机械压迫加速邻近椎间盘中的退变改变，这在稍后的阶段可能变为有症状的 (16)。显然需要治疗的备选方法。
[0012] 据报道，在通过实验产生退变后，蛋白，即成骨蛋白-I(OP-I)(骨形态形成蛋 白-7)的椎间盘内给药可以刺激椎间盘基质修复。通过将去聚合酶软骨素酶ABC预先注射 入椎间盘NP中在兔中产生椎间盘退变，该步骤被称为化学髓核溶解术（17)。化学髓核溶解 术后，发现NP和AF细胞在重建功能性基质中更加高效。发现嵌在正常密度的细胞外基质 中的椎间盘细胞很大程度上对于OP-I对PG合成的刺激效应没有反应（17)。
[0013] 使用自体软骨细胞，检测潜在细胞治疗以实现退变的犬和人IVD的修复的研究已 有报道（18,19)。所用的细胞是从相同物种的健康NP收获的软骨细胞并且随后再植入到缺 损的椎间盘中。所述方法的缺点在于用于该用途的细胞需要从邻近的健康椎间盘或从相同 物种的其他供体收获。AF的违背需要获得这些细胞并且该过程不仅损伤AF结构而且从NP 中移除活细胞会加速该组织中的退行性改变。显然，该方法具有受限的人类应用。
[0014] 发明概述
[0015] 本申请首次描述了体内应用STRO-I+专能细胞以促进退变椎间盘的髓核和纤维环 重建。STRO-I+专能细胞来源于同种异体来源并且在本研究使用的动物模型中良好耐受。这 提示来自供体的STRO-I+专能细胞可以大量生长并且开发为用于治疗退变椎间盘的"现成" 产品。
[0016] 因此，本发明提供了修复和/或重建个体中椎间盘的方法，所述方法包括将间充 质前体细胞（STRO-I+专能细胞）和/或其后代细胞给予椎间盘。
[0017] 在本发明的实施方案中，将STRO-I+专能细胞和/或其后代细胞给予椎间盘的髓 核中。
[0018] 优选地，STRO-I+专能细胞也是TNAP+、VCAM-l+、THY-r、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+ 或其任意组合。
[0019] STRO-I+专能细胞和/或其后代细胞可以来源于自体来源、同种异体或异种来源。 在一个实施方案中，所述细胞来源于同种异体来源。
[0020] 本发明方法还包括将糖胺聚糖（GAG)给予椎间盘，所述糖胺聚糖例如透明质酸 (hyaluronicacid)(透明质酸（hyaluronan)) (HA)、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、 肝素、硫酸肝素。GAG可以与STRO-I+专能细胞和/或其后代细胞在相同或不同的组合物中 进行给药。
[0021] 应当理解，本发明方法可以在任何脊椎动物上实施。例如，个体可以为哺乳动物， 诸如人、狗、猫、马、牛、或绵羊。
[0022] 本发明方法可以用于特征为椎间盘退变的脊柱疾病状况的治疗或预防，所述脊柱 疾病状况例如下背部疼痛，年龄相关的椎间盘改变或椎骨脱离。
[0023] 在本说明书各处，词语"包括（comprise) "或诸如"包括"（comprises)或"包 括"(comprising)的变体应理解为是指，包括所阐明的元件、整体或步骤、或元件组、整体组 或步骤组，但不排除任何其它的元件、整体或步骤、或元件组、整体组或步骤组。
[0024] 在下文中，通过以下非限制性实施例并参照附图描述本发明。
[0025] 附图简要说明
[0026] 图1.所有绵羊组中用STR0-1细胞治疗的腰椎脊柱节段的示意图。
[0027] 图2.放射学测定的椎间盘高度指数（DHI)。基线时和软骨素酶ABC诱导退变3个 月后（3个月，STR0-1细胞前），接受低剂量（A)和高剂量（B)的STR0-1细胞的绵羊组的X 射线测定的椎间盘高度指数（DHI)的平均值土标准误差。
[0028] 图3.MRI测定的注射软骨素酶ABC的椎间盘的总椎间盘退变评分。注射软骨素酶 ABC后，用低剂量STR0-1细胞+HA或单独HA治疗3个月（A)或6个月⑶之前，MRI测定 的总椎间盘退变评分的平均值土标准误差。
[0029] 图4.MRI测定的注射软骨素酶ABC的椎间盘的总椎间盘退变评分。注射软骨素酶 ABC后，用低剂量STR0-1细胞+HA或单独HA治疗3个月（A)或6个月⑶之前，MRI测定 的总椎间盘退变评分的平均值土标准误差。
[0030] 图5.总组织病理学椎间盘退变评分。对于低剂量STR0-1细胞，3个月（A)和6个月 (B)时的总组织病理学椎间盘退变评分的平均值。#表示与对照存在显著性差异p〈0. 001， Q表示与STRO-1+细胞存在显著性差异p〈0. 01。
[0031] 图6.总组织病理学椎间盘退变评分。对于高剂量STR0-1细胞，3个月（A)和6个月 (B)时的总组织病理学椎间盘退变评分的平均值。#表示与对照存在显著性差异p〈0. 001， Q表示与STRO-1+细胞存在显著性差异p〈0. 01。
[0032] 图7.总MRI椎间盘退变评分。对于低剂量STR0-1细胞，3个月（A)和6个月（B) 时的总MRI椎间盘退变评分。#表示与对照存在显著性差异p〈0. 05,Q表示与STRO-I+细 胞存在显著性差异p〈〇. 05。
[0033] 图8.总MRI椎间盘退变评分。对于高剂量STR0-1细胞，3个月（A)和6个月（B) 时的总MRI椎间盘退变评分。#表示与对照存在显著性差异p〈0. 05,Q表示与STRO-I+细 胞存在显著性差异p〈〇. 05。
[0034] 图9.髓核（NP)组织病理学退变评分。对于低剂量STR0-1细胞，3个月（A)和6 个月（B)时的NP组织病理学退变评分的平均值。
[0035] 图10.髓核（NP)组织病理学退变评分。对于高剂量STR0-1细胞，3个月（A)和6 个月（B)时的NP组织病理学退变评分的平均值。
[0036] 图11.生化测定的髓核的糖胺聚糖（GAG)含量。生化测定的用低剂量或高剂量 STRO-I细胞注射3个月（A)或6个月（B)的椎间盘的髓核的糖胺聚糖（GAG)含量的平均值 土标准差。#表示与对照存在显著性差异（p〈〇. 05)。
[0037] 图12.放射学测定的椎间盘高度指数（DHI)。A:软骨素酶ABC诱导的退变椎间 盘在HA或HA+低剂量STR0-1细胞注射后3个月和6个月时X射线测定的椎间盘高度指 数（DHI)的平均值土标准误差。B:软骨素酶ABC诱导的退变椎间盘在HA或HA+高剂量 STR0-1细胞注射后3个月和6个月时X射线测定的椎间盘高度指数（DHI)的平均值土标 准误差。
[0038] 发明优选实施方案的详细描述
[0039] 通用抟术和所诜择的宙义
[0040] 除非另外特别定义，本文所用的所有技术和科学术语应当认为具有与本领域技术 人员通常理解的相同的含义。（例如，在细胞培养、干细胞生物学、分子遗传学、免疫学、免疫 组织化学、蛋白质化学和生物化学中）。
[0041] 除非另外表明，本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术是本领域技术 人员公知的标准操作。下述资源中的文献中描述和解释了这些技术，例如J.Perbal,A PracticalGuidetoMolecularCloning(分子克隆操作指南），JohnWileyand Sons(1984),J.Sambrooketal,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆：实 验手册），ColdSpringHarbourLaboratoryPress(l989)，T.A.Brown(编辑），Essential MolecularBiology:APracticalApproach(基础分子生物学：操作方法），Volumesland 2,IRLPress(1991)，D.M.GloverandB.D.Hames(编辑），DNACloning:APractical Approach(DNA克隆：操作方法），Volumes1-4,IRLPress(1995 和1996)，以及F.M.Ausubel etal.(编辑），CurrentProtocolsinMolecularBiology(现代分子生物实验方 法）