一种减少蛋白质聚体产生的蛋白制剂保存方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蛋白制剂保存方法。
【背景技术】
[0002] 在过去的10年里，获得批准上市的治疗性蛋白制剂新药越来越多，而且高浓度 (50mg/ml以上）的适于皮下注射的蛋白制剂，因其使用方便已成为蛋白制剂的发展方向。 一般地，使用高于lmg/kg或者IOOmg/剂量的高剂量蛋白药物给药方案一般要求蛋白制剂 浓度达到几十mg/ml以上，但是高浓度的蛋白制剂容易发生蛋白质聚集，进而影响药物的 活性、药物代谢动力学以及药物安全性。
[0003] 研究发现，当高浓度的蛋白溶液储存于低温（低于0°C )时，蛋白质在反复冻融过 程中容易形成二聚体或多聚体。进一步的研究发现，蛋白质聚集的形成需要两分子之间的 碰撞，而浓度与聚集的形成关系取决于聚集物的大小和结合机制，蛋白质聚集可引起共价 (例如二硫键连接）或非共价（可逆或不可逆）结合，由非共价结合引起的不可逆聚集通常 经由可改变蛋白质天然构象的由温度、机械或化学过程暴露的疏水区域发生。
[0004] 目前已知有多种方法使蛋白制剂更加稳定。例如，欧洲专利EP0599344A中描述 了通过加入诸如HSP25的热激蛋白来提高蛋白质的稳定性。中国专利CN101745103B中报 道了添加饱和脂肪酸、L-精氨酸、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽以提高白蛋白稳定性。 欧洲专利EP0025275A描述含氮基质的盐如含精氨酸、胍或咪唑用于稳定免疫球蛋白。其 它的方法还有：通过添加聚醚（欧洲专利EP0018609A)，通过添加甘氨酸、白蛋白以及硫酸 葡聚糖（美国专利US4808705)，通过添加去污剂T Ween20(德国专利DE2652636,英国专利 GB8514349)，通过添加十二烷基聚乙二醇（中国专利CN101007840)，通过添加柠檬酸缓冲 液（国际专利申请W09322335)，通过添加螯合剂（国际专利申请W09115509)等等，从而提 高蛋白质溶液的稳定性。虽然上述方法可使蛋白制剂具有一定的稳定性，但没有一种方法 适用于反复冻融时仍维持蛋白质稳定，尤其是在蛋白质再冻融、(TC以下低温保存或冻干后 再加水溶解时能更好减少蛋白聚体生成的方法，目前尚未见报道。
[0005] 因此，如何有效减少蛋白制剂在冷冻和/或解冻时蛋白质聚体的生成一直是本领 域急需解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的申请人经过大量的研究发现蛋白制剂中蛋白聚体的生成与制剂的冷冻 温度密切关系，通过调节合适的冷冻温度，可有效减少蛋白制剂中蛋白聚体的形成，从而完 成本发明。具体地，本发明公开了：
[0007] 1. -种蛋白制剂保存方法，其特征在于，所述蛋白制剂冷冻温度为：零下40摄氏 度到零下196摄氏度。
[0008] 2.根据上述1所述的方法，其特征在于，所述蛋白制剂的冷冻温度为：零下40摄 氏度到零下80摄氏度。
[0009] 3.根据上述2所述的方法，其特征在于，所述蛋白制剂的冷冻温度为：零下80摄 氏度。
[0010] 4.根据上述1-3任一所述的方法，其特征在于，所述蛋白制剂的解冻温度为：4摄 氏度到37摄氏度。
[0011] 5.根据上述1-3任一所述方法，其特征在于，所述制剂的蛋白质浓度大于5mg/ml。
[0012] 6.根据上述5所述方法，其特征在于，所述制剂的蛋白质浓度大于50mg/ml。
[0013] 7.根据上述1-3任一所述方法，其特征在于，所述蛋白质为抗体或者融合蛋白。
[0014] 8.根据上述7所述方法，其特征在于，所述蛋白质为融合蛋白。
[0015] 9.根据上述8所述方法，其特征在于，所述蛋白质为TNFR-FC融合蛋白。
[0016] -般蛋白质制剂在大约-20°C以下已可以完全冷冻，因此人们一般会在-20°C的 环境下将蛋白质制剂冷冻保存。蛋白制剂的解冻过程则是蛋白冷冻过程的反向过程，如果 解冻的温度过高有可能造成蛋白聚体的增加，但同时解冻的温度比较低，那么解冻时间会 比较长也有蛋白聚体增加的可能，一般选择4-37度进行解冻。
[0017] 我们的研究人员经过大量的研究发现，蛋白制剂随着冷冻温度的增加，蛋白聚体 也会增加。通过进一步的研究，我们发现，蛋白制剂冷冻温度为零下40摄氏度到零下196 摄氏度，优选零下40摄氏度到零下80摄氏度，最优选零下80摄氏度，可有效减少蛋白制剂 在冷冻和/或解冻时蛋白质聚体的生成。具体见本发明的具体实施例。
[0018] 本发明所述的蛋白聚体是指：分子量至少是单体蛋白分子量2倍的蛋白聚集物， 其含量可以用SEC-HPLC方法测定。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例、实验例是对本发明的进一步说明，不应理解为对本发明的限制。
[0020] 检测仪器和方法
[0021] 按现行版《中国药典》三部附录III B项"高效液相色谱法"测定。
[0022] 高压液相色谱仪：Dionex Ultimate3OOO
[0023] 色谱柱：亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限500kD，孔径烈0Λ，粒度5 μ m，柱内 径 7. 8_，柱长 30cm ;选用 Tskgel G3000SWXL
[0024] 流动相为200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH6. 6-7. 0 ;上样量10~40 μ g，检测波长 280nm。按峰面积归一化法计算
[0025] 实施例1蛋白制剂在不同冷冻温度下的蛋白聚体生成实验
[0026] 样品I =TNFR-FC蛋白溶液（浓度39mg/ml)(来源苏州康宁杰瑞生物科技有限公 司）
[0027] 取5个1000 ml离心瓶，在离心瓶分别倒入550ml样品1，分别把这些装好蛋白的离 心瓶置于-201：、-401：、-701：、-801：冰箱中和液氮（一196°〇中冷冻，液氮冷冻好后放 置在-20度的冰箱中48小时，然后分别将上述冷冻的蛋白溶液在30度水浴中进行化冻，然 后用SEC-HPLC法检测各化冻蛋白溶液的蛋白聚体生成情况，检测结果见表1 :
[0028] 表1不同冷冻温度下的蛋白聚体生成实验结果
[0029]
[0030] 从表1可以看出，零下40摄氏度到零下196摄氏度条件下对蛋白溶液进行冻存， 其蛋白聚体增加均比常规的零下20摄氏度冻存的蛋白聚体生成少，尤其是在-80°C进行冷 冻时，蛋白聚体减少了近36%。
[0031] 实施例2不同浓度蛋白制剂在不同冷冻温度下的蛋白聚体生成实验
[0032] 样品2 :TNFR-FC蛋白溶液（浓度5mg/ml)(来源苏州康宁杰瑞生物科技有限公司）
[0033] 样品3 :TNFR-FC蛋白溶液（浓度50mg/ml)(来源苏州康宁杰瑞生物科技有限公 司）
[0034] 拿3个500ml离心瓶，在离心瓶分别倒入200ml的样品2蛋白溶液，同时，再拿3 个500ml离心瓶，然后在离心瓶分别倒入200ml的样品3蛋白溶液，然后分别把上述6个装 好蛋白溶液的离心瓶置于-20度，-40度，-80度的冰箱中，冷冻过夜。冷冻完毕后,置于室 温水浴化冻。用SEC-HPLC方法检测已化冻溶液的聚体情况，同时用SEC-HPLC法检测没经 过冻存的原样品2和样品3溶液的聚体情况作为对照，检测结果见表3。
[0035] 表3不同浓度蛋白制剂在不同冷冻温度下的蛋白聚体生成情况表
[0036]
[0037] 由上表可以看出5mg/ml的蛋白溶液-20°C冻存后化冻液的蛋白聚体比原溶液的 蛋白聚体增加了 28%，而-80°C冻存后的化冻液蛋白聚体仅比原溶液增加了 9 % ;另外， 50mg/ml的蛋白溶液-80°C冷冻后化冻液蛋白聚体仅是-20°C冷冻后化冻液蛋白聚体的 65%。可见相比常规的-20°C冻存，_40°C或_80°C条件下冷冻保存蛋白溶液，蛋白聚体的生 成均有减少，且蛋白溶液浓度越高效果越明显。
【主权项】
1. 一种蛋白制剂保存方法，其特征在于，所述蛋白制剂冷冻温度为：零下40摄氏度到 零下196摄氏度。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白制剂的冷冻温度为：零下40摄 氏度到零下80摄氏度。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白制剂的冷冻温度为：零下80摄 氏度。4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述蛋白制剂的解冻温度为：4摄 氏度到37摄氏度。5. 根据权利要求1-3任一所述方法，其特征在于，所述制剂的蛋白质浓度大于5mg/ml。6. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述制剂的蛋白质浓度大于50mg/ml。7. 根据权利要求1-3任一所述方法，其特征在于，所述蛋白质为抗体或者融合蛋白。8. 根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述蛋白质为融合蛋白。9. 根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述蛋白质为TNFR-FC融合蛋白。
【专利摘要】本发明公开了一种减少蛋白质聚体产生的蛋白制剂保存方法，其特征在于，所述蛋白制剂冷冻温度在零下40摄氏度到零下196摄氏度。该方法可有效减少蛋白制剂在冻融过程中蛋白二聚体或多聚体的形成。
【IPC分类】A61K39/395, A61K38/00
【公开号】CN105267964
【申请号】CN201410323054
【发明人】胡辉, 朱云斌, 贡以捷
【申请人】上海中信国健药业股份有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年7月8日