用于下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂的制作方法
【专利说明】用于下调Be卜xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂
[0001] 发明领域和背景 本发明，在其一些实施方案中，涉及通过下调编码Bel-2-家族蛋白和/或p21的基因 而杀死衰老细胞以治疗年龄相关性障碍的方法。
[0002] 细胞衰老是细胞周期停滞的一种稳定形式，是限制细胞增殖潜力的一种机制。衰 老可以在许多细胞类型中响应于多种细胞应激形式而触发。它是肿瘤发生的有效屏障并促 成某些抗癌药的细胞毒性。尽管衰老以细胞自主方式限制肿瘤发生和组织损伤，但是衰老 细胞在其存在部位以细胞非自主方式诱导炎症、组织老化、组织破坏并促进肿瘤发生和转 移。因此，将其消除可导致对肿瘤的预防和对组织老化的抑制。的确，在动物模型中，衰老 细胞的消除显示出减缓组织老化（Baker等人，2011)。
[0003] 生物体可发展出精细机制以消除衰老细胞，以避免其对微环境的有害效应。然而， 对它们在组织中的命运并未充分表征。一方面，良性黑素细胞性痣（黑痣）高度富集于衰 老细胞，但可终生都在皮肤中存在，这意味着衰老细胞可以被稳定地并入组织。另一方面， 先前已经显示出先天免疫系统的组分在体外特异性地识别和消除衰老细胞并在体内靶向 衰老细胞，导致肿瘤的衰退和肝纤维化的逆转（Krizhanovsky等人，2008b;Sagiv等人， 2012 ;Xue等人，2007)。因此，衰老细胞可在体内周转（turnover)，免疫系统促进这样的 周转。免疫系统所进行的对衰老细胞的识别和消除的努力表明（尽管并非直接地）衰老细 胞对生物体是有害的，将其消除是有益的。
[0004] 最近十年间，多项研究鉴定了衰老诱导所需的基因和途径或衰老表型的旁路。由 p53 (TP53)和pl6INK4a(⑶KN2A)所控制的两种肿瘤抑制基因途径，调节衰老反应。p53 通过反式激活能抑制增殖的基因而促进衰老，而pl6INK4a，连同p53革Elp21 (⑶KN1A) -起， 抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK) 2和4,从而阻止pRB磷酸化和促进阻遏性异染色质形 成，使增殖相关基因沉默。
[0005]Bel-2-家族蛋白在细胞死亡调节中起到重要作用并且能够调节多种细胞死亡机 制，其包括细胞凋亡、坏死和自噬（Cory等人，2003 ;Reed，2008)。对于该家族的创始成员 Bel-2在衰老中的功能仍然有争议。已经提出其在衰老细胞中上调或下调并且与这些细胞 的细胞凋亡的阴性或阳性调节有关（Uraoka等人，2011 ;Wang，1995)。除了Bel-2之外， 该家族还包括抗凋亡蛋白Bcl-xL、Bcl-w、Mel-Ι和A1，并且集中研究了该家族作为癌症的 药理学干涉的祀标（Azmi等人，2011 ;Zeitlin等人，2008)。
[0006] 美国专利申请号20120189539教导了下调Bcl-xL用于癌症治疗的一种化学物。
[0007] 美国专利申请号20040001811教导了用于癌症治疗的包含靶向Bel-2家族成员的 dsRNA的药物组合物。
[0008] 美国专利申请号20070258952教导了靶向包括Bcl-xL和p-21的多种基因的 siRNA的给予。
[0009] 美国专利申请号20110301192教导了用于癌症治疗的下调p-21的化学试剂的给 予。
[0010] 发明概沐 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗炎性或纤维化 疾病的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或 量的试剂，从而治疗所述炎性或纤维化疾病，条件是所述炎性疾病不是癌症。
[0011] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了制品，其包含： (i) 下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂；和 (ii) 下调p21的活性和/或量的试剂。
[0012] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了药物组合物，其包含药学上可接受 的载体和作为活性剂的： (i) 下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂；和 (ii) 下调p21的活性和/或量的试剂。
[0013] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制 剂1 (P21)的活性和/或量的试剂，用于治疗炎性或纤维化疾病，其中所述疾病不是癌症。
[0014] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了下调表达Bcl-xL的内源核酸序列 的多核苷酸试剂和下调表达Bcl-w的内源核酸序列的多核苷酸试剂，用于治疗炎性或纤维 化疾病。
[0015] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了组合物，其包含载体和下调p21的 活性和/或量的至少一种活性剂和下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一种 活性剂，其中所述组合物被配制为供局部给药用。
[0016] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗炎性或纤 维化疾病的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 1 (P21)的活性和/或量的试剂，从而治疗所述炎性或纤维化疾病，条件是所述疾病不是癌 症。
[0017] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗炎性或纤 维化疾病的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调表达Bcl-xL的内源核酸序列 的至少一种多核苷酸试剂和下调表达Bcl-w的内源核酸序列的至少一种多核苷酸试剂，从 而治疗所述炎性或纤维化疾病。
[0018] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗癌前病变 的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的 试剂，从而治疗所述癌前病变。
[0019] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗癌前病 变的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 (P21)的活性和/或量的试剂，从而治疗所述癌前病变。
[0020] 根据本发明的一些实施方案，所述试剂是化学试剂。
[0021] 根据本发明的一些实施方案，所述试剂是革E1向Bcl-xL和/或Bcl-W的多核苷酸试 剂。
[0022] 根据本发明的一些实施方案，所述疾病与软骨变性相关。
[0023] 根据本发明的一些实施方案，所述疾病选自肝纤维化、伤口愈合、皮肤纤维化、肺 病、骨质疏松症、肾纤维化、前列腺炎、动脉粥样硬化、关节炎和胰腺炎。
[0024] 根据本发明的一些实施方案，所述肺病包括慢性阻塞性肺病（C0PD)。
[0025] 根据本发明的一些实施方案，所述下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试 剂被包含在与所述下调P21的活性和/或量的试剂分开的包装中。
[0026] 根据本发明的一些实施方案，所述下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试 剂被包含在与所述下调P21的活性和/或量的试剂相同的包装中。
[0027] 根据本发明的一些实施方案，所述制品进一步包含选自以下的至少一种试剂：皮 脂调节剂、抗菌和/或抗真菌剂、角质软化剂和/或角质调节剂、收敛剂、抗炎和/或抗刺激 剂、抗氧化剂和/或自由基清除剂、愈合剂、抗老化剂和保湿剂。
[0028] 根据本发明的一些实施方案，所述至少一种试剂是抗老化剂。
[0029] 根据本发明的一些实施方案，所述药物组合物被配制为供局部递送。
[0030] 根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸试剂是siRNA试剂。
[0031] 根据本发明的一些实施方案，下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一 种活性剂是ABT-737或ABT-263。
[0032] 根据本发明的一些实施方案，所述组合物进一步包含选自以下的至少一种试剂： 皮脂调节剂、抗菌和/或抗真菌剂、角质软化剂和/或角质调节剂、收敛剂、抗炎和/或抗刺 激剂、抗氧化剂和/或自由基清除剂、愈合剂、抗老化剂和保湿剂。
[0033] 根据本发明的一些实施方案，所述至少一种试剂是抗老化剂。
[0034] 根据本发明的一些实施方案，所述试剂是针对表达p21的内源核酸序列的多核苷 酸。
[0035] 根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸试剂是siRNA。
[0036] 根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括给予所述受试者下调Bcl-xL 和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一种试剂。
[0037] 根据本发明的一些实施方案，所述至少一种试剂是针对表达Bcl-xL和/或Bcl-w 的内源核酸序列的多核苷酸。
[0038] 根据本发明的一些实施方案，所述试剂是针对Bcl-xL和/或Bcl-w的siRNA。
[0039] 根据本发明的一些实施方案，所述至少一种试剂是化学试剂。
[0040]根据本发明的一些实施方案，所述化学试剂选自ABT-737、ABT-263、棉酚、AT-101、 TW-37 和Obatoclax。
[0041] 根据本发明的一些实施方案，所述疾病与软骨变性相关。
[0042] 根据本发明的一些实施方案，所述疾病选自肝纤维化、伤口愈合、皮肤纤维化、肺 病、肾纤维化、前列腺炎、动脉粥样硬化、关节炎和胰腺炎。
[0043] 根据本发明的一些实施方案，所述试剂被配制为局部组合物。
[0044] 根据本发明的一些实施方案，所述至少一种多核苷酸试剂包含siRNA。
[0045] 根据本发明的一些实施方案，所述疾病是癌症。
[0046] 根据本发明的一些实施方案，所述疾病选自肝纤维化、伤口愈合、皮肤纤维化、肺 病、肾纤维化、前列腺炎、动脉粥样硬化、关节炎和胰腺炎。
[0047] 根据本发明的一些实施方案，所述至少一种试剂被配制为局部组合物。
[0048] 根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括给予所述受试者下调p21的活 性和/或量的试剂。
[0049] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语都具有本发明所属领域 普通技术人员公知的相同含义。尽管类似于或等同于本文所述的那些的方法与材料可以用 于本发明实施方案的实践或试验，但是以下描述了示例性的方法和/或材料。在有矛盾时， 将以本专利说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的和无意作为必 要限制。
[0050]附图简沐 参考附图和图像，仅以实例的方式在本文中描述了本发明的一些实施方案。现将详细 地对附图的具体提及，强调以实例的方式和为了本发明实施方案的说明性讨论的目的而显 示了细节。在这一点上，【附图说明】使本领域技术人员清楚本发明的实施方案可以如何实践。
[0051] 在附图中： 图1A-C说明了在衰老细胞中Bcl-w和Bcl-xL蛋白的升高的表达。（A)对应于以下细 胞的细胞裂解物（頂1?-90和MEF)的免疫印迹：经溶媒处理的生长细胞（G)、经依托泊苷处 理以诱导衰老的细胞（Eto);用空载体（V)或用表达H-rasv12的逆转录病毒（H-rasv12)转导 的细胞。β-微管蛋白用作上样对照。（B)对如A所述处理的頂R-90细胞进行的SA-β-gal 活性染色。（C)在如A所述处理的頂R-90细胞中的Bcl-2、Bcl-w和Bcl-xL的mRNA水平 的定量RT-PCR分析。数值是平均值+SEM。
[0052] 图2A-B说明了Bcl-w和Bcl-xL的组合敲减诱导杀死衰老细胞。（A)经依托泊苷 处理的衰老頂R-90细胞用指定siRNA转染。转染后4天测定细胞活力。（B)经依托泊苷处 理的衰老细胞用指定siRNA转染后4天，Bcl-2、Bcl-w和Bcl-xL表达的蛋白质印迹分析。 β-微管蛋白用作上样对照。
[0053] 图3A-D说明了Bcl-w和Bcl-xL的组合敲减诱导衰老细胞死亡。（Α)经依托泊苷 处理的衰老頂R-90细胞用指定siRNA转染。转染后4天测定细胞活力。（B)经依托泊苷处 理的衰老頂R-90细胞用指定siRNA转染。转染后3天细胞用10μΜABT-199处理24小时 或用DMS0 (作为对照）处理。在孵育期结束时测定细胞成活力。（C)頂R-90或MEF经溶 媒处理的生长细胞（G)、衰老的经依托泊苷处理的细胞（Ε)、用空载体（V)或用表达H-rasV12 的逆转录病毒（H_rasV12)转导的细胞，用ABT-199处理24小时。在孵育期结束时测定细胞 成活力。对Bcl-2抑制敏感的SH-SY5Y细胞用作处理的阳性对照。
[0054] 图4A-B说明了BH3模拟ABT-737在衰老细胞中诱导细胞死亡。頂R-90 (图4A)或 MEF(图4B)生长细胞（G)、经依托泊苷处理的细胞（Eto)、用空载体（V)或用表达H-rasV12 的逆转录病毒（H_rasV12)转导的细胞用指定剂量的ABT-737或用DMS0 (作为对照）处理24 小时。在孵育期结束时测定细胞成活力。
[0055] 图5A-B说明了頂R-90生长细胞（G)、经依托泊苷处理的细胞（Eto)或用表达 H-rasv12的逆转录病毒（Ras)转导的细胞，在z-VAD-fmk存在或不存在时用ABT-737或 DMS0(作为对照）处理24小时。（A)在孵育期结束时测定细胞成活力。（B)对应于以下细 胞的细胞裂解物的免疫印迹：在如所示的DMS0、ABT-737或ABT-737加上z-VAD-fmk存在时 的生长细胞（G)、经依托泊苷处理的细胞（Eto)或用表达H-rasv12的逆转录病毒（Ras)转导 的细胞。微管蛋白用作上样对照。
[0056] 图6Α-Ε说明了p21影响衰老细胞的成活力。（A-D)生长（G)和经依托泊苷（Eto) 处理的原代人（MR-90，BJ)和小鼠（MEF)成纤维细胞以及人肺癌细胞（H1299)用针对p21 的siRNA或对照siRNA转染。转染后4天（A-D)或在指定时间点（E)测定细胞成活力。
[0057] 图7A-C说明了p21以p53和pRB非依赖性方式维持衰老细胞成活力。㈧在BJ 生长细胞（G)和经依托泊苷处理的BJ细胞（Eto)用针对p21的siRNA或对照siRNA转染 后4天的指定蛋白的蛋白质印迹分析。β-微管蛋白用作上样对照。（B-C)经依托泊苷处 理的BJ细胞用指定siRNA转染。转染后4天测定细胞成活力。在同一时间，收集细胞裂解 物并通过蛋白质印迹分析，证实指定蛋白的有效敲减。
[0058] 图8是图，说明了对胱天蛋白酶活性的抑制部分地营救了衰老细胞免于细胞凋 亡。经依托泊苷处理的BJ细胞用sip21或对照siRNA转染。在z-VAD-fmk(每天补充） 存在或不存在时将细胞孵育4天。在孵育期结束时测定细胞成活力。
[0059] 图9A-E说明了作为对p21敲减的响应，E2F靶和炎症基因被上调。生长（G)和经 依托泊苷（Eto)处理的BJ细胞的指定基因的mRNA水平的定量RT-PCR分析。GAPDHmRNA 用作参考。数据表示为3次独立的RT-PCR分析的平均值+SEM。
[0060] 图10是照片，说明了在p21敲除小鼠中同时减少了衰老细胞和纤维化瘢痕的存 在。野生型和P21-/-(敲除）小鼠经历6周CC14处理以诱导纤维化。处理后对肝通过针对 衰老细胞的存在情况的SA-β-gal和通过针对纤维化瘢痕形成的天狼星红（SiriusRed) 染色进行评价。
[0061] 本发明的具体实施方案的描沐 本发明，在其一些实施方案中，涉及通过下调编码Bcl-2-家族蛋白和/或p21的基因 而杀死衰老细胞用于治疗年龄相关性障碍的方法。
[0062] 在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解，本发明不一定将其应用 限制在以下说明中给出的或通过实施例举例说明的细节上。本发明能够具有其它实施方案 或以不同方式被实践或实施。
[0063] 衰老细胞可以在皮肤、肝、肺、胰腺、前列腺的纤维化或炎性疾病中以及关节软骨、 动脉粥样硬化斑块和其它年龄相关性疾病中找到。此外，衰老细胞显示出在正常组织、尤其 是皮肤中随年龄增长而积累并表明促进组织老化。因此，消除衰老细胞可显著地延迟许多 组织的老化并治疗其中存在衰老细胞的病理状况。
[0064] 本发明人已经表明，通过siRNA(图2A-B和3A-B)或通过Bcl-2家族的特异性抑 制剂（ABT-737 ;图4A-B和5A-B)对Bcl-xL和Bcl-w的组合抑制导致衰老细胞的特异性消 除。对Bcl-2本身的抑制不能执行这项任务（图3C-D)。因此，本发明人提出对Bcl-xL和 Bcl-w的组合抑制允许衰老细胞的特异性消除并可用于治疗其中存在衰老细胞的疾病。 [0065] 令人惊奇的是，本发明人已经发现，对衰老细胞的相同效应可以通过降低p21表 达而实现（图6A-E和7A-C)，p21是通常与衰老的发作（作为⑶K4和⑶K2的抑制剂）和 肿瘤抑制相关的一种蛋白。尽管在生长细胞中的P21敲减对细胞成活力没有有害效应，但 在衰老细胞中对P21敲减导致頂R-90、BJ、H1299和MEF细胞的细胞成活力分别下降30%、 50%、75%和30%(图6A)。因此，本发明人提出p21对于维持衰老细胞成活力而言是必要的。 [0066] 正如根据p21作为RB蛋白磷酸化抑制剂的功能所料的，注意到在响应p21敲减 时，E2F介导的细胞周期调节相关的基因（例如，细胞周期蛋白-A2和CDK-1)的mRNA水平 显著增加（图9)。另外，出乎意料的是，发现了p21敲减导致IL-8和IL-1βmRNA水平增 加，指向衰老细胞生物相关的炎性反应。因此，本发明人推断p21敲减在衰老细胞中诱导促 炎反应和细胞死亡。这可导致其治疗潜力增加，因为炎性细胞因子将会募集免疫系统，以杀 死通过敲减本身未能消除的细胞。
[0067] 因此，本发明人提出，由下调Bcl-xL和Bcl-w的试剂在衰老细胞中对细胞凋亡的 直接诱导（其导致细胞死亡的诱导）连同由P21敲减所诱导的促炎反应的组合应在从癌前 病变、损伤的和老化的组织中有效地消除衰老细胞方面达到极点。这将对其中存在着衰老 细胞的各种各样的病症提供重要的治疗影响。
[0068] 因此，根据本发明的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗炎性或纤维化疾病 的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的活性 和/或量的试剂。
[0069] 术语"Bcl-xL"是指具有SEQIDN0: 21所示的序列的人蛋白（也称为B-细胞淋 巴瘤-超大）及其同源物和直向同源物。人Bcl-xL的cDNA序列如SEQIDN0: 22所示。
[0070] 术语"Bcl-W"是指具有SEQIDNO: 23所示的序列的人蛋白（也称为Bcl-2-样 蛋白2)及其同源物和直向同源物。人Bcl-w的cDNA序列如SEQIDN0: 24所示。
[0071] 术语"p21"也称为"细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1"是指具有SEQIDNO: 25 所示的序列的人蛋白及其同源物和直向同源物。人p21的cDNA序列如SEQIDNO: 26所 不。
[0072] 根据具体的实施方案，所述方法包括下调Bcl-xL和Bcl-w。
[0073] 根据另一实施方案，所述方法包括下调Bcl-xL、Bcl-w和p21的每一种。
[0074] 根据再一实施方案，所述方法包括下调p-21和下调Bcl-xL。
[0075] 根据再一实施方案，所述方法包括下调p-21和下调Bcl-w。
[0076] 本文使用的短语"下调（靶蛋白）的活性和/或量"是指下调至少10%、至少20%、 至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或甚至至少90%。另外，术语"下 调"也可指完全抑制。
[0077] 使用化学试剂可实现对Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的下调。已知能降低 Bcl-xL和/或Bcl-w的活性的化学试剂包括ABT-737、ABT-263、棉酚、AT-101、TW-37和 0batoclax〇
[0078] 根据具体的实施方案，所述试剂是ABT-737或ABT-263。
[0079]ABT-737 和ABT-263 (ABT-263 是生物可利用形式，称为 "Novatoclax"，Abbot) 目前处于用于多发性骨髓瘤、淋巴瘤、急性白血病、CLL、小细胞肺癌的II期。
[0080] 棉酚（天然的）用于头颈部肿瘤、胰腺癌的II/III期。
[0081] AT-101 (棉酸衍生物；AscentaTherapeutics)用于胰腺癌、头颈部癌症、胶质瘤 的Π/ΙΙΙ期。
[0082] TW-37(UniMichigan)用于胰腺癌、淋巴瘤的II期。
[0083] Obatoclax(GX15-070MS;GeminX，稍后称为Cephalon,现在称为Teva)用于骨 髓瘤、骨髓纤维化和套细胞淋巴瘤的II期。
[0084] 下调p21活性的化学试剂的实例公开于美国专利申请号20110301192,通过引用 结合到本文中。
[0085] 使用干扰转录和/或翻译的各种分子（例如，RNA沉默剂、核酶、DNA核酶和反义 物），也可在基因组和/或转录本水平上实现Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的下调，或者 使用例如拮抗剂、切割多肽的酶等，也可在蛋白质水平上实现Bcl-xL和/或Bcl-w和/或 p21的下调。
[0086] 以下是能够下调Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的表达水平和/或活性的试剂 列表。
[0087] 能够下调Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的试剂的一个实例是能够与之特异性 结合的抗体或抗体片段。优选地，所述抗体能够被细胞内在化。
[0088] 本发明使用的术语"抗体"包括完整分子及其功能