一种雪松松针总黄酮的富集方法及其在抗肿瘤中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药、天然药物制药领域，尤其涉及一种雪松松针总黄酮的富集方法 及其在抗肿瘤中的应用。
【背景技术】
[0002] 雪松Cedrus deodara (Roxb.) G. Don是松科Pianaceae植物雪松属Cedrus Trew 树种的泛称，又称喜马拉雅雪松、喜马拉雅杉、香柏。该属共有4种，包括雪松Cedrus deodara (Roxb.) G. Don、黎巴嫩雪松Cedrus libani Rich·、短叶雪松Cedrus brevifolia Hook. f.和北非雪松Cedrus atlantica manetti，它们分别间断分布于喜马 拉雅山、亚洲西部(黎巴嫩、叙利亚和土耳其）、塞浦路斯及北非(摩洛哥和阿尔及利亚）（郑 万钧，傅立国《雪松?中国植物志》1978,第七卷，167;Dallimore W, Jackson AB, Harrion SG《A handbook of Coniferae and Ginkgoaceae》，1966,137)。传统中医认为雪松具有怯 风活络、消肿生肌、活血止血之功效;现代药理证实，雪松具有解痉、镇痛、抗炎、抗癌、抗菌、 抗病毒等多种药理活性(张军民，石晓峰，范彬，等《雪松的化学成分及药理活性研究进展· 中成药》，2009,31(6):928-933)。其针叶药用历史悠久，主要化学成分为黄酮类、苯丙素类、 有机酸类、三萜类、留体类、多糖及针叶胶等，其中黄酮类化合物主要为杨梅素、槲皮素、山 柰酚、异鼠李素及其它们的苷类(刘东彦，石晓峰，王东东，等《雪松松针黄酮类化学成分的 研究?中草药》，2011，42(4):631-633;Liu DY，Shi XF, Wang DD, et al《A New Flavonoid In Pine Needles Of Cedrus Deodara · Chinese Herbal Medicines》，2011，3 (I):5-6.；Liu DY1Shi XF, Wang DD， et al《Two New Myricetin Glycosides from Pine Needles of Cedrus deodara · Chemistry of Natural compound》， 2011,47(5):704-707 ;刘东彦，石晓峰，李冲，等《雪松松针醋酸乙酯部位化学成分研究?中草药》，2011，42 (10): 1921-1924);目前采取正交试验法优选出雪松松针中总黄酮的最佳提取工艺为加无 水乙醇30倍量，在40°C下超声提取3次，每次20min(范彬，石晓峰，沈薇，等《正交试验法优选 雪松松针中总黄酮提取工艺?中国药师》，2008，11 (8): 938-940)。雪松松针具有抗肿瘤、抗 氧化、改善记忆、抗菌及抗病毒、毒杀蚊虫等多种功效（白朝辉，石晓峰，刘东彦，等《雪松松 针的化学成分及药理作用研究进展?中国药师》，2012，15(12):1791-1793)，其中有关雪 松松针抗肿瘤的报道，系雪松枝叶的乙醇提取物中挥发物质对人非小细肺癌(NCI-H460)细 胞的抑制作用，当浓度为50yg/mL时，对肿瘤细胞没有抑制作用，而当浓度增加至100 yg/ mL时，抑制率达到73.45%(卓盼，陈先晖，朱峰，等《雪松枝叶弱极性物质的GC-MS分析及抗肿 瘤活性?江苏农业科学》，2011，39(3): 429-431)。雪松松针水溶性提取物显示出强大的抗 氧化活性，对ABTS自由基的IC5q为25.5 ± 0.64yg/mL，其水溶性提取物中总酚含量每克相 当于31.4±0.53mg没食子酸，总黄酮含量每克相当于23. l±0.79mg芦丁(Wei-Cai Zeng, Li-Rong Jia, Yan Zhang,et al《Antibrowning and antimicrobial activities of water-soluble extract from pine needles of Cedrus deodara · Journal of Food Science》,2011，76(2): 318-323)。但未见雪松松针总黄酮的大孔树脂富集方法及其在抗 肿瘤中的应用的相关报道。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、易于实施的雪松松针总黄酮的 富集方法。
[0004] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供该雪松松针总黄酮的富集方法制得的 雪松松针总黄酮在抗肿瘤中的应用。
[0005] 为解决上述问题，本发明所述的一种雪松松针总黄酮的富集方法，包括以下步骤： ⑴将新鲜雪松松针置阴凉处晾干，得到干燥的雪松松针;该干燥的雪松松针中加入其 重量22~28倍的体积浓度为40~80%的乙醇进行回流提取，经过滤，得到雪松松针提取液； ⑵将所述雪松松针提取液经减压回收乙醇至无醇味，得60°C热测密度为1.05~1.10的 流浸膏； (3)将所述流浸膏分散于其质量3~4倍的水中，经超声溶解、离心分离，得到浓度为2.85~ 4.25mg/mL的雪松松针总黄酮粗提液； ⑷大孔树脂湿法装柱后，将所述雪松松针总黄酮粗提液用体积浓度为10%的盐酸或氢 氧化钠调pH至3~6，然后以1~3mL/min流速上样，最大上样量为0.5~4.0倍柱体积，上样完成 后先用3~5BV水洗除杂，然后用1~3BV的体积浓度为60~90%的乙醇洗脱，收集洗脱液； (5)所述洗脱液经减压浓缩、干燥，即得含量超过50%的雪松松针总黄酮。
[0006] 所述步骤⑴中回流提取的条件是指温度为85~90°C，共提取2次，其中一次2 h，一 次lh。
[0007] 所述步骤⑵中减压回收及所述步骤(5)中减压浓缩的条件均是指压力0.07~ 0 · 08MPa，水浴温度50~60°C。
[0008] 所述步骤⑶中超声溶解的条件是指功率35~45KHZ，温度40~50°C。
[0009] 所述步骤⑶中离心分离的条件是指转速2500~3500r/min。
[0010] 所述步骤⑷中大孔树脂是指DlOl )8-8、冊0450、冊0722型大孔树脂中的任意一 种。
[0011] 所述步骤(5)中中干燥的条件是指50~60°C。
[0012] 如上所述的一种雪松松针总黄酮的富集方法制得的雪松松针总黄酮在抗肿瘤中 的应用，其特征在于:该雪松松针总黄酮作为有效组分按常规方法与药学上可接受的任何 载体制成各类抗肿瘤的药用制剂。
[0013] 所述药用制剂是指胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液及其复方制剂。
[0014] 本发明与现有技术相比具有以下优点： 1、本发明方法只需一定浓度的乙醇溶液加热回流提取，使用大孔吸附树脂柱纯化，所 得雪松松针总黄酮稳定性和均一性良好，为应用到大规模工业生产提供有利基础，可望开 发为以雪松松针总黄酮为原料的具有广泛临床使用价值的抗癌新药。
[0015] 2、本发明工艺简单，成本低，易操作，得到的雪松松针总黄酮含量高。
[0016] 3、本发明所得的雪松松针总黄酮的体外抗肿瘤作用： 2.1材料与仪器 2.1.1药品 雪松松针总黄酮（Total flavonoids from Cedrus deodara，TFCD)由甘肃省医学科学 研究院药物研究所提供。
[0017] 制备方法:雪松松针经乙醇回流提取，过滤除杂，大孔吸附树脂富集、纯化，低温干 燥后得棕褐色粉末(纯度:54.28%)，4°C保存备用。
[0018] 雪松松针总黄酮溶液的配制:将总雪松松针黄酮用PBS溶液配制成浓度分别为50、 100、200、300、400、500、600、800、1000 ug/mL的雪松松针总黄酮系列溶液，分装于1.5 mL离 心管中，4°C保存备用。
[0019] 2.1.2材料人宫颈癌HeLa细胞株、人胃癌细胞株MKN45、人肺癌细胞株A549、人肝 癌细胞株HepG2、人胶质瘤细胞株SHG44分别由兰大二院普外科研究所、甘肃省医学科学研 究院、兰州军区兰州总医院骨研所提供。
[0020] 改良型RPMI-1640培养基(美国HyClone公司），DMEM高糖培养基（美国HyClone公 司