用于持续的免疫治疗的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了组合物和方法，它们用于通过抗原特异性的方式来促进TR1细胞和/或Breg细胞的形成、扩增和招募，以及在有需要的对象中治疗自身免疫性疾病和病症。
【专利说明】
用于持续的免疫治疗的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2013年11月4日提交的美国临时专利申请61/ 899,826号的优先权，通过引用将其W整体形式合并至本文中。
技术领域
[0002] 本发明设及和免疫疗法和药物相关的组合物和方法。
【背景技术】
[0003] 在本说明书的全文中都有用标识性引用或用阿拉伯数字来引用的技术和专利公 开文献。在权利要求书之前的说明书中，可W找到对应于阿拉伯数字的所有引用文献的目 录。通过引用的方式将所有在此引用的文献合并入本申请，W更完整地描述与本发明相关 的现有技术的状态。
[0004] 自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是由免疫系统由自身组织的攻击引起 的。理想的疗法是能够选择性地纯化(blunt)自身免疫反应(针对在该疾病中祀定的所有抗 原表位)而不会损害全身免疫(对外来抗原的免疫反应)的疗法。不幸地，任何一种自身免疫 性疾病设及的淋己细胞特异性都非常多并且没有被完全地界定，使其成为具有挑战性的目 标。
【发明内容】
[0005] 为响应现有技术的运一需求，本发明描述的是在治疗自身免疫性疾病中有用的治 疗性组合物。本发明的一个方面设及一种用于在有需要的对象中扩增和/或发展抗致病的 自身反应性T细胞和/或B细胞的群体的方法，所述方法包括W下步骤、或实质上由W下步骤 组成、或由W下步骤组成：向所述对象施用抗原-II类MHC-纳米颗粒（"NP")复合物（"NP-复 合物"），其中所述抗原是自身免疫相关的抗原或自身抗原。在一些方面，在特定的NP上的所 有抗原都是相同的或者它们可W是不同的。在另一个方面，在NP上的抗原具有不同的氨基 酸序列，但是可W分离自相同的抗原蛋白。在另一个方面，在NP上的抗原来自不同的抗原。 在另一个方面，所述MHCII是相同的或不同的。
[0006] 在一个方面，本发明提供了 NP-复合物，所述NP-复合物包括W下物质、或实质上由 W下物质组成、或由W下物质组成:纳米颗粒、II类血1C蛋白和疾病相关的抗原，它可W是抗 原/ MHCII复合物的形式，用于在对象中扩增和/或发展B调节细胞和TR1细胞(例如TR1和 CD4+细胞）的一个或多个群体，其中所述纳米颗粒的直径选自：从约1 nm至约100 nm的直 径;从约1 nm至约50 nm的直径或从约1皿至约20皿或从约5nm至约100皿的直径，并且抗 原-MHCII复合物与纳米颗粒的数量的比例是从约10:1至约1000:1。在一个方面，所述复合 物的II类MHC密度为从约0.05 pMHCII /100 nm2NP表面积(包括涂层)至约25 pMHCII /100 nm2NP表面积(包括涂层）。所述抗原是设及自身免疫反应的自身抗原或其模拟物，所述反应 例如是糖尿病前期、糖尿病、多发性硬似"MS")或多发性硬化相关的疾病，并且任选地其中 当疾病是糖尿病前期或糖尿病时，所述自身抗原是来自由膜腺β细胞或自身抗原IGRP、膜岛 素、GAD或IA-2蛋白表达的抗原的表位（epitope)。在另一个方面，所述II类MHC成分包括 HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的全部或部分。所述抗原-II类MHC复合物被共价地或非共价地连 接至所述纳米颗粒。所述纳米颗粒是生物可吸收的和/或生物可降解的。
[0007] 在另一个方面，所述纳米颗粒是非脂质体的和/或具有固体核屯、，所述核屯、优选是 金核屯、或氧化铁核屯、。当被共价地连接时，所述抗原-II类MHC复合物通过尺寸小于5 kD的 接头被共价地连接至所述纳米颗粒。在一个方面，所述接头包括聚乙二醇(PEG)。所述pMHC 可W通过任何结构(包括但不限于接头)或通过交联被连接至所述纳米颗粒或纳米颗粒涂 层。在一个方面，所述MHC通过C末端被定向地连接至所述纳米颗粒或涂层。
[0008]
【申请人】已经发现，抗原-Π 类MHC复合物在纳米颗粒上的密度对治疗效果有贡献。 因此，如本文所描述地，抗原-MHCII纳米颗粒复合物可W具有确定的密度，所述密度的范围 是从纳米颗粒的表面积(包括任何涂层而测量的表面积)的每100 nm2约0.05(个)MHC分子， 假设至少有2 MHCII、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12(个)MHCII被复合至 纳米颗粒。在一个方面，所述复合物的MHCn的密度为从每100 nm2约0.01 MHCII (0.05 MHCII/100 醒2)至约30 MHCII/100 醒2、或从约Q.1 MHCII/100 醒2至约25 MHCII/100 皿2、或从约0.3 MHCII/100 皿2至约25 MHCII/100 皿2、或从约Q.4 MHCII/100 皿2至约25 MHCII/100 nm2、或从约0.5 MHCII/100 醒2至约20 MHCII/100 nm2、或从0.6 MHCII/100 皿2至约20 MHCII/100 皿2、或从约 1.0 MHCII/100 皿2至约20 MHCII/100 皿2、或从约5.0 MHCII/100 皿2至约20 MHCII/100 ηπΛ或从约 10.0MHCII/100 皿2至约20 MHCII/100 皿2、 或从约15 MHCII/100 nm2至约20 MHCII/100 nm2、或至少约0.5、或至少约1.0、或至少约 5.0、或至少约10.0、或至少约15.0 Μ肥11/100 nm2，纳米颗粒的nm嗦面积包括任何涂层。在 一个方面，当9个或至少9个MHCII被复合至纳米颗粒时，密度是从约0.3 MHCII/100 nm2至 约20 MHCII/100 nm2。
[0009] 本发明还提供了一种组合物，其包括治疗有效量的本文所述NP复合物W及载体 (例如药学上可接受的载体）。在一个方面，在所述组合物中的所有NP复合物是相同的。在另 一个方面，所述组合物的NP复合物包括多样化的或不同的MHC-抗原复合物。
[0010] 本发明进一步提供了制造复合物和组合物的方法。所述方法可W包括W下步骤、 或实质上由W下步骤组成、或由W下步骤组成:将抗原-MHCII复合物(例如MHCII复合物)非 共价地涂布或共价地复合至纳米颗粒上。
[0011] 本发明还提供了医疗和诊断方法。在一个方面，本发明提供了一种用于在有需要 的对象中W抗原特异性的方式促进B调节细胞和/或化1细胞(例如TR1和CD4+细胞）的形成、 扩增和招募的方法，所述方法包括W下步骤、或实质上由W下步骤组成、或由W下步骤组 成：向所述对象施用有效量的本文所述的NP复合物或组合物。
[0012] 在另一个方面，本发明提供了一种用于在有需要的对象中治疗或抑制本文所述的 自身免疫性疾病或病症(例如MS、MS相关的疾病、糖尿病或糖尿病前期）的方法，所述方法包 括W下步骤、或实质上由W下步骤组成、或由W下步骤组成：向所述对象施用有效量的本文 所述的NP复合物或组合物，其中所述自身抗原对于将要治疗的疾病来说是疾病相关的，例 如为了防止或治疗糖尿病，所述抗原是糖尿病相关的抗原。在另一个方面，所述自身免疫性 疾病是MS或MS相关的疾病并且所述抗原是MS相关的。
[0013] 本发明还提供了试剂盒。所述试剂盒包括W下物质、或实质上由W下物质组成、或 由W下物质成:本文所述的NP复合物或组合物W及使用说明。
[0014] 在一个方面，本发明提供了一种制造纳米颗粒的方法，所述方法包括热分解或加 热纳米颗粒前体。在一个实施方式中，所述纳米颗粒是金属或金属氧化物纳米颗粒。在一个 实施方式中，所述纳米颗粒是氧化铁纳米颗粒。在一个实施方式中，所述纳米颗粒是金纳米 颗粒。在一个实施方式中，本发明提供了根据目前的技术制备的纳米颗粒。在一个实施方式 中，本发明提供了一种制造氧化铁纳米颗粒的方法，所述方法包括乙酷丙酬铁的热分解反 应。在一个实施方式中，得到的所述氧化铁纳米颗粒是可溶于水的。在一个方面，氧化铁纳 米颗粒适于蛋白结合。在一个实施方式中，所述方法包括单一步骤的热分解反应。
[0015] 在一个方面，所述热分解在存在功能化的PEG分子的情况下发生。功能化的PEG接 头的一些非限制性例子示出于表1中。
[0016] 在一个方面，所述热分解包括加热乙酷丙酬铁。在一个实施方式中，所述热分解包 括在存在功能化的PEG分子的情况下加热乙酷丙酬铁。在一个实施方式中，所述热分解包括 在存在苄基酸和功能化的PEG分子的情况下加热乙酷丙酬铁。
[0017]不受理论约束，在一个实施方式中，功能化的PEG分子被用作还原剂和表面活性 剂。本发明提供的制造纳米颗粒的方法通过使颗粒可溶于水的PEG分子，简化和改进了常规 方法(其使用难W被置换或难W被完全置换的表面活性剂）。常规地，表面活性剂可W是昂 贵的（例如憐脂)或有毒的（例如油酸和油胺）。在另一个方面，不受理论约束，制造纳米颗粒 的所述方法避免了使用常规的表面活性剂的需要，从而得到了较高程度的分子纯度和水溶 性。
[0018] 在一个实施方式中，所述热分解设及乙酷丙酬铁和苄基酸W及在不存在常规的表 面活性剂(除了运里使用的试剂)的情况下进行。
[0019] 在一个实施方式中，用于热分解的溫度是约80°C至约300°C、或约80°C至约200°C、 或约80°C至约150°C、或约100°C至约250°C、或约100°C至约200°C、或约150°C至约250°C、或 约150°C至约250°C。在一个实施方式中，所述热分解在约1小时至约2小时的时间发生。
[0020] 在一个实施方式中，所述制备氧化铁纳米颗粒的方法包括纯化步骤，所述步骤例 如通过使用MiItenyi Biotec LS磁性柱进行。
[0021] 在一个实施方式中，所述纳米颗粒在憐酸盐缓冲盐水(PBS)中在约4°C下是稳定 的，没有任何可检测的降解或聚集。在一个实施方式中，所述纳米颗粒能够稳定至少6个月。
[0022] 在一个方面，本发明提供了一种制造纳米颗粒复合物的方法，所述方法包括将 pMHC与本发明提供的氧化铁纳米颗粒接触。不受理论约束，pMHC编码在其簇基末端的半脫 氨酸，它能够在约pH 6.2至约抑6.5下与功能化的PEG中的马来酷亚胺基反应约12至约14 小时。
[0023] 在一个方面，所述制造纳米颗粒复合物的方法包括纯化步骤，所述步骤例如通过 使用Mi Itenyi Biotec LS 磁性柱(ma 即 etic column)进行。
【附图说明】
[0024] 附图构成说明书的一部分并且用来进一步说明本发明的某些方面。本发明可通过 参考运些附图中的一个或多个并结合所呈现的【具体实施方式】的详细描述而被更好地理解。
[00剧图lA-lC示出了NP-复合物的示意图。图ΙΑ示出了单链I类pMHC表达构建体(上）和 对应的pMHC四聚体(标记有巧光物）结合至同源CD8+ T-细胞的代表性流式细胞仪简图。图 1B示出了接头/连接物和NP复合物的二维结构。如可W看到的，一个NP能够包含通过各种化 学接头复合至纳米颗粒核屯、的相同的抗原。图1C示出了结合至NP的马来酷亚胺功能化的 NP。
[0026] 图2示出了典型的II类pMHC单体的结构(上）W及使用对应的pMHC四聚体染色或未 染色的同源CD4+ T-细胞的代表性FACS简图。
[0027] 图3A-3B示出了在刚患糖尿病的NOD小鼠中不同的T1D-相关的II类pMHC-NP逆转血 糖升高。图3A示出了单个小鼠血糖曲线。在正常血糖稳定4周时，认为小鼠"被治愈"，此后停 止治疗。将外来抗原肥L14-22作为对照。图3B示出了疾病逆转的发生。
[0028] 图4示出了腹腔糖耐量试验（IPTGTT)和在长期被治愈的小鼠中的膜岛素生产能 力。IDDM，糖尿病的未治疗的小鼠；被治愈的，在50周龄(治疗停止之后>30周)具有正常血糖 的小鼠；对照，年龄匹配的非糖尿病的未治疗的小鼠巧0周龄）。
[0029] 图5示出了 T1D相关的II类pMHC-NP扩增同源的自身调节性CD4+ T细胞。数据与使 用2.5mi/I-Ag7-NP处理的小鼠一致。右下角，扩增对于NP上的pMHC是特异的，因为使用 2.5mi/I-Ag7-NP处理的小鼠没有显示出两种其他自身反应性CD4+ T-特异性的增加百分 比。PLN，膜腺淋己结;MN，肠系膜淋己结;BM，骨髓(巧区T细胞的储存库）。
[0030] 图6示出了 T1D相关的II类pMHC-NP扩增同源的自身调节性CD4+ T细胞。示出的扩 增是对于脾的，但是在膜腺淋己结、血液和骨髓中看到了相似的模式。"发病"对应于治疗之 前的值；"被治愈的"是使用pMHC-NP而血糖正常的小鼠（在治疗停止的>30周分析）；"IDDM" 是在治疗停止之后复发的小鼠（~25%); "59周龄"对应于年龄匹配的未处理的非糖尿病的对 照。
[0031] 图7示出了T1D相关的II类pMHC-NP扩增同源记忆样T-调节-U "Trl或ΤΚΓ )细胞。
[0032] 图8示出了由II类pMHC-NP扩增的自身反应性CD4+ T-细胞制造化-10。使用同源的 和非同源的肤对来自使用IGRPi26-i45^-Ag7-NP或对照NP处理的小鼠的IGRPi26-i4s/I-Ag 7四聚 体+细胞进行分选、处理，并通过1皿inex技术测试上清液的细胞因子含量。
[0033] 图9示出了 II类pMHC-NPW依赖于IL-10和TG化的方式逆转高血糖。图9示出了 IGRP4-22/IAs7-NP能够使使用细胞因子阻断抗体（"Ab")处理的小鼠恢复正常血糖(上）、扩增 同源化1细胞（左下）并抑制化N中的自身抗原提呈（至IGRP206-214-反应性CD8+ T-细胞；右 下）。抗-IL10和抗-TG邱Ab部分地恢复自身抗原提呈并抑制pMHC-NP的治疗效果，而不损害 Trl细胞扩增。
[0034] 图10A-10B显示，II类pMHC-NP治疗不损害全身免疫。图10A显示，经pMHC-NP处理的 NOD小鼠能够容易地清除急性病毒(牛痘病毒)感染(下，比较感染后4日与14日），而不管自 身调节化1 CD4+ T-细胞的全身扩增(上）。图10B显示，与未处理和未接种疫苗的小鼠相比， 经pMHC-NP处理的小鼠（10个剂量)能够在CFA中的免疫接种时对KLH-DNP产生抗体反应。
[0035] 图11示出了 II类pMHC-NP治疗降低了在巧7BL/6小鼠中已经建立的EAE的严重程 度。使用在CFA中的PM0G35-55免疫接种B6小鼠，并静脉内使用百日咳毒素进行处理。使用15 分制的已经建立的标准，针对EAE的症状对小鼠进行打分。从免疫接种之后21日开始，使用 两周剂量的7.5-22.5 ug的涂布有pM0G38-4VlAb的NP处理被感染的小鼠。
[0036] 图12A-12C示出了 II类pMHC-NP的结构和性质。图12A描述了能够被用来将pMHC共 价地涂布至功能化的、生物相容的氧化铁NP的不同的化学方法。图12B是涂布了 pMHC的NP的 透射电子显微照片。图12B示出了涂布了 pMHC的NP和未涂布的NP的动态光散射图。
[0037] 图13A-13C示出了在经II类pMHC-NP处理的小鼠中，同源B细胞进入化eg细胞的扩 增和分化。在图13A中，将经PKH26标记/经2.5mi肤脉冲的B细胞(下）（或者树突状细胞，上） W及经CFSE标记/经GPI肤脉冲的B细胞（下）（或者树突状细胞，上）的1:1混合物注射进经 2.5mi/IAg7-NP处理的N孤小鼠中。屯天之后，分析宿主的B细胞(下)或树突状细胞(上）的亚 型的出现。左侧图板显示了代表性的结果，右侧直方图显示了从几个实验获得的结果的概 述。该数据显示，经2.5mi-肤脉冲的B细胞(而非DC)在经2.5mi/IAg7-NP处理的NOD小鼠中扩 增。在B(左侧面板），
【申请人】比较了在经处理2.5mi/IAg7-NPW及经涂布有对照(糖尿病不相 关的)pMHC-NP的NP处理的NOD小鼠的膜腺癌(PLN)和肠系膜(MLN)淋己结中的B细胞含量。数 据显示，B细胞在前者中的招募增加。在B(右侧面板），
【申请人】比较了B细胞至PLN的招募随着 Trl细胞招募的变化。使用数种不同的pMHC-NP制剂得到数据。数据显示，在扩增有pMHC-NP 的TR1细胞的招募和B细胞至PLN的招募之间存在统计学上显著的相关性。在图13B中，申请 人将经2.5mi肤或对照肤脉冲的B细胞(来自ILlO-eGFP敲入的NOD小鼠）转移入数种不同的 供体小鼠类型（上部标签）。7天之后，分析脾的被灌注的B细胞向表达高水平的CDld和CD5、 产生IL10的（eGFP+化细胞(B调节细胞）的转变。数据显示，只有在经2.5mi/IAg7-NP处理的 宿主中，存在稳健的扩增和同源(装载有2.5mi)B细胞向B-reg细胞的转变。
[0038] 图14示出了通过乙酷丙酬铁的热分解及生物结合而合成表面功能化的氧化铁纳 米颗粒。
[0039] 详细描述 要理解的是，本发明并不限于所描述的特定实施方式，因为运些实施方式肯定可W变 化。还要理解的是，本文所使用的术语仅为描述特定实施方式的目的而使用，并非意在限 审IJ，因为本发明的范围仅由所附权利要求来限定。
[0040] 必须注意的是，本文和权利要求中所使用的单数形式"一个"和"该"，除非文中有 明确说明，否则都包括复数个指代。因此，例如，当提到"赋形剂"时，其包括多种赋形剂。 [0041 ] 定义 除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技 术人员通常所理解的含义。如本文所使用的，W下术语具有下述含义。
[0042] 如本文所使用的，术语"包括"是指该组合物和方法包括所引述的内容，但不排除 其他内容。当用来定义组合物和方法时，"实质上由…组成"意味着排除对于该组合物或方 法具有任何实质性意义的其他内容。因此，如本文所定义的，实质上由该元素组成的组合物 不会排除不会实质性影响所要求保护的发明的基本的和新颖的特性的材料或步骤，例如是 用于治疗或防止多发性硬化症的组合物。"由…组成"意味着排除高于痕量的其他组分和实 质性的方法步骤。由每个运些过渡术语定义的实施方式都在本发明的范围内。
[0043] "自身反应性T细胞"是识别"自身抗原"的T细胞，该抗原是由包含该T细胞的相同 的个体产生和包含的分子。
[0044] "致病性T细胞"是对含有该T细胞的对象有害的T细胞。反之，非致病性T细胞是对 对象实质上无害的T细胞，并且抗致病性T细胞减少、改善、抑制或无效化致病性T细胞的损 害。
[0045] 如本文所使用的，术语调节B细胞或B-调节细胞（"B-reg")是指对抗炎症作用负责 的那些细胞，该作用是由CDld、CD5的表达和IL-10的分泌表征的。B-reg还通过Tim-1的表达 来识别，并且可W通过Tim-1连接来诱导从而提高耐受性。资料显示，作为B-reg的能力是由 许多刺激因子驱动的，运些因子例如是toll样受体、CD40配体和其它因子。但是，B-reg的全 面表征正在进行中。B-reg还表达高水平的CD25XD86和TGF-βηΒ细胞的运一亚型能够抑制 Thl增殖，因此对自身耐受的维持有贡献。B-reg作用的增强应该成为许多免疫调节药物的 目标，有助于更好地控制自身免疫疾病。参看例如：ncbi . nlm. nih. gov/pubmed/23707422， 最后一次登录是在2013年10月31日。
[0046] T调节1细胞(化1)是CD4+ T的亚型，它具有调节特性并且能够抑制体外和体内的 抗原特异性免疫反应。运些T调节l(Trl)细胞是由它们独特的细胞因子生成来界定的，并且 制造高水平的IL-10和TGF-β而不制造比-4或比-2。由运些细胞生成的比-10和TGF-β介导体 外的主要的初始(naive^细胞的抑制。还存在化1细胞在体内存在的证据，并且有文献报导 了在已经接受了异基因干细胞移植的具有严重的联合免疫缺陷的患者中存在生成高水平 比-10的CD4( + ) T细胞。Trl细胞参与外周耐受的调控，并且它们有可能被用作细胞疗法W 调节体内的免疫反应。参看例如:ncbi .nlm.nih.gOv/pubmed/10887343,最后一次登录是在 2013年10月31日。
[0047] 1型T调节(Trl)细胞是由它们制造高水平的化-10和TGF-β的能力来界定的。对多 种抗原特异的Tr 1细胞出现在体内，但是也可W存在IL-10的情况下分化自体外的初始CD4+ T细胞。Trl细胞具有较低增殖能力，运可W通过IL-15来克服。Trl细胞通过产生IL-10和 TGF-β来抑制初始和记忆T辅助1或2型响应。分子水平的化1细胞的进一步表征将界定它们 的作用机制并弄清它们与化细胞的其他亚型的关系。可W预见化1细胞被用来识别新型祀 标W用于开发新的治疗剂W及被用作细胞疗法W调节外周耐受。参看例如： ncbi . nlm. nih. gov/pubmed/11722624，最后一次登录是在2013年 10月31 日。
[0048] 术语"抑制"、"减少"或"防止"或运些术语的任何变形，当被用在权利要求和/或说 明书中时，包括任何可检测的下降或完全抑制W达到期望的结果。
[0049] 在本发明全文中，术语"约"被用来表示该值包含用来检测该值的装置或方法的误 差的标准偏差。当用在数字表示（例如溫度、时间、量和浓度）之前时（包括范围值），术语 "约"表示近似值，其可上(+)下（-)改变10 %、5 %或1 %。
[0050] "生物相容性的"是指递送系统的成分不会导致组织损伤或对人类生物系统造成 损伤。为赋予生物相容性，会优先使用已在人体中有安全使用记录或具有GRAS化enerally Accepted As Safe)状态的聚合物和赋形剂。生物相容性是指用在组合物中的组分和赋形 剂最终会被"生物吸收"或被身体清除而不会对身体产生不利作用。一种组合物要成为生物 相容的，并且被认为是无毒的，其必须不能对细胞造成毒性。类似地，术语"生物可吸收的" 是指由在一段时间内在体内经历生物吸收的材料制成的纳米颗粒，因而可避免在患者体内 形成该材料的长期累积。在优选的实施方式中，该生物相容性纳米颗粒在少于2年的时间段 内被生物吸收，优选少于1年，更优选少于6个月。生物吸收率与颗粒的尺寸、所使用的材料、 W及本领域技术人员普遍意识到的其他因素相关。生物可吸收的生物相容性材料的混合物 可被用来形成本发明中使用的纳米颗粒。在一个实施方式中，可将氧化铁和生物相容性的 生物可吸收的聚合物混合。例如，可将氧化铁与PGLA混合W形成纳米颗粒。
[0051] 抗原-MHC-纳米颗粒复合物(NP-复合物)是指在表面上(例如生物相容性生物可降 解纳米球上）的抗原分子或蛋白质的肤、碳水化合物、脂质或其他抗原节段、片段或表位的 表现形式（即，自身肤或自身抗原）。如本文所使用的，"抗原"是指可在对象中诱导免疫响应 或抗病原性细胞的扩增的分子的全部、部分、片段或节段。
[0052] "模拟物"是特定配体或肤的类似物，其中该类似物与该配体实质上相似。"实质上 相似"是指该类似物的结合属性与该配体类似，但该模拟物具有一个或多个功能基团或修 饰位点，它们共同占据该配体的分子量的少于约50%、少于约40%、少于约30%、少于约20%、少 于约10%、或少于约5〇/〇。
[0053] 术语"抗病原性自身反应性T细胞"是指具有抗病原性特性的T细胞(即抵消自身免 疫疾病(例如MS、MS相关的疾病或病症、或糖尿病前期）的T细胞）。运些T细胞可W包括抗炎T 细胞、效应T细胞、记忆T细胞、低亲和力T细胞、T辅助细胞、自动调节T细胞、细胞毒性T细胞、 自然杀伤T细胞、TR1细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞等。
[0054] 术语"抗炎T细胞"是指促进抗炎响应的T细胞。T细胞的抗炎功能可通过抗炎蛋白 质、细胞因子、趋化因子等的生成和/或分泌而实现。抗炎蛋白质也旨在包括抑制免疫响应 的抗增殖性信号蛋白。抗炎蛋白质包括化-4、化-10、化-13、化-21、化-23、化-27、IFN-a、 TGF-β、比-lra、G-CSFW及TNF和比-6的可溶性受体。还包括具有炎症表型但杀死抗原提呈 细胞或安排特定自身免疫响应的抗炎细胞。相应地，本发明的一些方面设及用于在患者中 治疗自身免疫疾病(例如MS、MS相关的疾病、糖尿病或糖尿病前期）的方法，该方法包括W下 步骤、实质上由W下步骤组成或进一步由W下步骤组成：向该患者施用抗原MHCII -纳米颗 粒复合物，其中所述抗原是疾病相关的抗原。
[00对术语"比-10"或"白介素-10"是指由比-10基因编码的细胞因子。比-10序列可通过 GenBank 登录号 NM_000572.2(mRNA)和 NP_000563.1 (蛋白质）获得。
[0056] 术语"TGF-护或"转化生长因子护是指可具有抗炎作用的蛋白质。TGF-β是W至少 Ξ种同种型存在的分泌蛋白，分别被称为TGF-m、TGF-的和TGF-防。它也是TGF-βΙ的原名， 其是该家族的创始成员。TGF-β家族是转化生长因子β超家族的一部分，其包括抑制素类、激 活素、抗中肾旁管激素、骨形态生成蛋白、decapen化plegic蛋白和Vg-1。
[0057] "有效量"是足W实现预期目的的量，预期目的的非限制性的例子包括：启动免疫 响应、调节免疫响应、抑制炎症响应和调节T细胞活性或T细胞群。在一个方面，有效量是指 实现所提及的治疗目的的量，例如治疗有效量。如本文所详细描述的，有效量或剂量取决于 目的和组合物、成分，并且可根据本发明公开的内容来确定。
[0058] 词语"一个"或"一种"与术语"包括"在权利要求和/或说明书中结合使用时，其可 能意味着"一个"，但也与"一个或多个"、"至少一个"W及"一个或多于一个"的意思一致。
[0059] "纳米球"、"NP"或"纳米颗粒"在本文是指W单个或多个形式适当施用给对象、细 胞或组织的小的离散颗粒。在某些实施方式中，纳米颗粒的形状是实质上球形的。在一些实 施方式中，纳米颗粒并非是脂质体或病毒颗粒。在进一步的实施方式中，纳米颗粒是固体或 者具有固体核屯、。如本文所使用的，术语"实质上球形的"是指颗粒的形状不偏离球状超过 约10%。本发明的各种已知抗原或肤复合物可被施用至运种颗粒。本发明的纳米颗粒的尺寸 为约1皿至约1 μηι，并且优选地为约1皿至约100皿，或者约1皿至约50皿，或者约5至50 nm或者约5 nm至100 nm，并且在某些方面，当指代多个纳米颗粒时，是指多个纳米颗粒的平 均直径或中间值。较小的纳米尺寸的颗粒可通过例如分离工艺获得，从而允许较大的颗粒 沉淀在水性溶液中。该溶液的上部随后通过本领域已知的方法回收。该上部富集了较小尺 寸的颗粒。该工艺可被重复直到生成期望的平均尺寸。
[0060] 权利要求中使用的术语"或"，除非另有明确说明仅指择一方案或运些替代方案相 互排斥之外，是指"和/或"，即使公开的内容支持指代择一方案和"和/或"的定义。
[0061] 如本文所使用的，短语"免疫响应"或其等同体"免疫学响应"是细胞介导的响应 (由抗原特异性T细胞或它们的分泌产物介导）的进展。细胞免疫响应是通过将多肤表位与I 类或II类MHC分子相关联而提呈来诱导，从而治疗或防止病毒感染、扩增抗原特异性化eg细 胞、TCUCD4+ T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞和/或疾病生成的、自动调节的T细胞和 B"记忆"细胞。运些响应有可能设及其他成分的激活。
[0062] 本文使用的术语"炎症反应"和"发炎"表示个体的血管组织对有害刺激(例如病原 体、受损细胞或刺激物）的复杂的生物学响应，包括分泌细胞因子，更具体地是促炎性细胞 因子，即，主要是由活化的免疫细胞产生并且设及炎症反应的扩大的细胞因子。促炎性细胞 因子的例子包括但不限于，比-1、比-6、比-10、TNF-a、比-17、化21、化23、化27和了6。-0。示例 性的发炎包括急性发炎和慢性发炎。急性发炎表示短期过程，其特点在于由于血浆和白细 胞对组织的浸润导致的典型的发炎症状(肿胀、发红、疼痛、发热和功能丧失）。急性发炎通 常只要存在损伤刺激即出现，并且一旦刺激被除去、分解或通过形成癒痕而隔离(纤维化） 即停止。慢性发炎表示一种状态，其特点是并发活性炎症、组织破坏并且尝试修复。慢性发 炎没有W上列出的急性发炎的那些典型症状。相反，慢性发炎组织的特点是单核免疫细胞 (单细胞、巨隧细胞、淋己细胞和浆细胞)的浸润、组织破坏，并尝试愈合(包括血管生成和纤 维化）。在本发明的意义上，发炎可通过影响，特别是抑制形成个体内炎症相关的复杂生物 学响应的任何一个事件来抑制。
[0063] 自身免疫性疾病可W包括但不限于:糖尿病、糖尿病前期、移植排斥、多发性硬化、 多发性硬化相关的疾病、卵巢早衰、硬皮病、斯耶格伦氏病、狼疮、vilelego病、脱发(秀顶）、 腺体衰竭、格雷夫斯病、甲状腺功能减退症、多发性肌炎、天瘤疮、克罗恩病、结肠炎、自身免 疫性肝炎、垂体功能减退症、屯、肌炎、阿狄森氏病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、 甲状旁腺功能减退、和/或类风湿性关节炎。在一些方面，抗原/ MHCII/颗粒复合物的肤成 分衍生自或设计自在将被该治疗探测、调制、或减弱的自身免疫响应中设及的自身抗原或 自身抗原表位、或其模拟物。在特定的方面，自身抗原是肤、碳水化合物、或脂质。在一些方 面，自身抗原是由对象的某些细胞(例如膜腺β细胞)表达的片段、表位、或蛋白的肤、碳水化 合物、或脂质，并且包括但不限于IGRP的片段、膜岛素、GAD或ΙΑ-2蛋白。已经对多种自身免 疫性疾病鉴定了多种运样的蛋白或表位。所述自身抗原可W是衍生自第二内分泌或神经分 泌成分(例如膜岛周围雪旺氏细胞等)的肤、碳水化合物、或脂质。
[0064] 如本文所使用的，术语"疾病相关的"抗原是指其被选择来治疗被选择的疾病的抗 原或片段。例如，糖尿病相关的抗原是其将会治疗糖尿病的抗原或片段。MS相关的抗原被选 择来治疗MS。糖尿病相关的抗原不会被选择来治疗MS。相似地，自身免疫相关的抗原是与自 身免疫疾病相关的并且不会被选择来治疗自身免疫之外的疾病或病症(例如癌症)的抗原。
[0065] 如本文所使用的，术语"糖尿病"是指由遗传和环境因素引起的碳水化合物代谢的 可变疾病，其特征通常是膜岛素的分泌或利用不足、生成的尿量过多、在血液和尿中的糖含 量过多、W及口渴、饥饿和体重减轻。糖尿病的特征在于1型糖尿病和2型糖尿病。非肥胖糖 尿病（"NOD")小鼠是被接受的用于研究和治疗糖尿病的动物模型。小鼠中的1型糖尿病 (T1D)与自身反应性CD8+ T-细胞相关。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠发展出与人类T1D非常相似 的一种形式的T1D，它起因于识别不断增加的自身抗原的T细胞对膜腺β细胞的选择性破坏。 虽然T1D的引发明显需要CD4+细胞的参与，但是有令人信服的证据表明T1D是CD8+ Τ细胞依 赖性的。已经发现，NOD小鼠中的膜岛相关的CD8+细胞的很大一部分使用CDR3-不变的να17- Ja4化TCR(被称为巧.3-TCR样"）。运些细胞在MHC分子Kd的情况下识别模拟表位NRP-A7(使 用组合肤库来定义的），它们已经是最早的NOD膜岛CD8+浸润物的显著成分、是致糖尿病的， 并且祀定来自膜岛特异性葡萄糖-6-憐酸酶催化的亚基相关的蛋白（IGRP，一种未知功能的 蛋白）的肤。识别该肤（IGRP206-214 ,与NRP-A7相似）的CD8+细胞在循环中异常频繁O1/200 CD8 +细胞）。值得注意的是，NOD小鼠中的膜岛炎到糖尿病的进展总是伴随着循环的 IGRP206-214-反应性CD8+池的循环扩展，W及其膜岛相关的配对物的快速成熟。最近，已经显 示，NOD小鼠中的膜岛相关的CD8 +细胞识别多个IGRP表位，表明IGRP是对CD8+细胞的主要 的自身抗原，至少在鼠类T1D中是。NOD膜岛相关的CD8 +细胞，特别是那些早在疾病过程中 发现的细胞，也识别膜岛素表位(Ins Bi日-23)。
[0066] 相关研究已经表明，某些化A I类等位基因（即化A-A*0201)使得易患人类T1D。病 理学研究已经显示，初诊患者的膜岛病变主要由（HLA I类限制的乂D8+ T-细胞组成，运些 细胞也是通过移植膜腺同基因移植物(来自同卵双胞胎)或同种异体移植(来自相关的捐献 者)治疗的患者中主要的细胞群体。
[0067] 膜岛素是人类和鼠类T1D中抗体和CD4+响应的关键祀标。在膜岛移植接受者和在 自发性疾病的过程中，人类膜岛素 B链表位hInsBio-18由HLA-A*0201提呈至自身反应性CD8+ 细胞。此外，已经从小鼠前膜岛素原1或2识别了四个额外的肤，它们在HLA-A*0201的情况下 从HLA-A*0201-转基因小鼠中被膜岛相关的CD8+ T-细胞识别。
[0068] 如本文所使用的，术语"糖尿病前期"是指在糖尿病症状之前的无症状期，其特征 是亚临床β细胞损伤，其中患者表现出正常的血浆葡萄糖水平。它的特征还在于存在膜岛细 胞自身抗体(ICAs)，当接近的临床症状的发作时，还伴随着对葡萄糖的不耐受。
[0069] 如本文所使用的，术语"多发性硬化症"或"MS"是指自身免疫性疾病，其中身体的 免疫系统在覆盖神经的保护套进行侵蚀。运干扰了大脑和身体其余部分的通信。最终，运会 导致神经自身的恶化，该过程是不可逆的。
[0070] 如本文所使用的，术语"多发性硬化症相关的疾病"是指与MS的易感性或与MS共同 呈现的疾病。运些疾病的非限制性例子包括:视神经脊髓炎(NM0)、葡萄膜炎、神经性疼痛硬 化、动脉粥样硬化、动脉硬化、硬化播散性全身性硬化症、脊髓-光学MS、原发性进行MS (PPMS)、W及复发缓解型MS(PPMS)、进行性全身性硬化症、W及共济失调硬化症。
[0071 ]术语"表位"和"抗原决定簇"可互换使用，并且是指抗原上B细胞和/或T细胞所响 应或识别的位点。B细胞表位可由连续氨基酸形成或通过蛋白质的Ξ次折叠而并置的非连 续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时仍保留，但由Ξ次折叠 形成的表位通常在用变性溶剂处理时会丢失。表位通常包括至少3个、更常见为至少5个或 8-10个W独特空间构象存在的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如X射线晶体分 析法和2维核磁共振法。参见例如Glenn E. Morris, Epitope Mapping Protocols (1996) dT细胞识别CDS细胞的约9个氨基酸的连续表位，或CD4细胞的约13-15个氨基酸的表 位。识别该表位的T细胞可通过测定抗原依赖性增殖的体外实验来识别，该测定可通过化- 胸腺喀晚加入、通过已接触抗原的T细胞对表位的响应(Burke et al., J. Inf. Dis., 170:1110-1119，1994)、通过抗原依赖性杀伤(细胞毒性T淋己细胞实验，Tigges et al.， J. Immunol.，156(10):3901-3910, 1996)、或通过细胞因子分泌来确定。细胞介导的免疫 响应的存在可通过增殖实验(CD4+ T细胞)或CTL实验(细胞毒性T淋己细胞)来确定。
[0072] 任选地，抗原或优选地抗原的表位可化学地结合至，或表达为，与其他蛋白融合的 融合蛋白，所述其他蛋白例如是MHC和MHC相关蛋白。
[0073] 如本文所使用的，术语"患者"和"对象"可意思相近，并且是指哺乳动物。在一些实 施方式中，患者是人。在其他实施方式中，患者是通常用在实验室中的哺乳动物，例如是小 鼠、大鼠、猴、狗、猫、牛、马或羊。
[0074] 如本申请中所使用的，术语"多核巧酸"是指一种核酸分子，其可为重组的，或是分 离的且不含全基因组核酸。术语"多核巧酸"包括寡核巧酸（长度为100个残基或更少的核 酸）、重组载体(包括例如质粒、粘粒、隧菌体、病毒等）。在某些方面，多核巧酸包括调节序 列，它们被分离得实质上远离它们的天然基因或蛋白质编码序列。多核巧酸可为RNA、DNA、 其类似物、或它们的组合。编码多肤的全部或部分的核酸可含有编码该多肤的全部或一部 分的连续核酸序列，并具有 W 下长度：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、 140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、 330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、 510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、 700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、 890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、 1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、 6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000、或更多个核巧酸、核巧或碱基对。还预期的是，来 自特定物种的特定多肤可由含有天然变体的核酸编码，所述天然变体具有稍微不同的核酸 序列但编码相同或实质性相似的蛋白质、多肤或肤。
[0075] 多核巧酸是由特定序列的四种核巧酸碱基构成的：腺嚷岭(A);胞喀晚(C);鸟嚷岭 (G);胸腺喀晚(T);W及如果多核巧酸是RNA时替代胸腺喀晚的尿喀晚(U)。因此，术语"多核 巧酸序列"是多核巧酸分子的字母表现形式。该字母表现形式可被输入到具有中央处理单 元的计算机的数据库中，并且可用于生物信息学应用，例如功能基因组学和同源性检索。
[0076] 如本文关于核酸(例如DNA或RNA)所使用的，术语"分离的"或"重组的"是指分离自 其它DNA或RNA的分子，分别为存在于大分子W及多肤的天然来源中的分子。术语"分离的或 重组的核酸"包括不是天然地作为片段存在并且在自然状态下找不到的核酸片段。术语"分 离的"在本文中也用来指分离自其他细胞蛋白质的多核巧酸、多肤和蛋白质，并且意在包括 纯化的和重组的多肤。在其他实施方式中，术语"分离的或重组的"是指分离自成分、细胞， 其中细胞、组织、多核巧酸、肤、多肤、蛋白质、抗体或其片段在天然状态下通常是联合在一 起的。例如，一个分离的细胞是指分离自不相似表型或基因型的组织或细胞的一个细胞。分 离的多核巧酸是分离自3'和5'连续核巧酸，该分离的多核巧酸在其天然或自然环境中（例 如在染色体上)通常是与3'和5'连续核巧酸相连的。对于本领域技术人员明显的是，非天 然的核巧酸、肤、多肤、蛋白质、抗体或其片段不需要进行"分离"从而预期天然副本相区别。
[0077] 多核巧酸或多核巧酸区域(或多肤或多肤区域）与另一序列具有特定百分数（例 如，80%、85%、90%或95%)的"序列一致性"是指，在比较着两个序列时，当比对时，该百分数的 碱基(或氨基酸)是相同的。该比对W及同源性或序列一致性百分比可利用本领域已知的软 件来确定，例如在Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30，7.7.18部分，表格7.7.1中描述的那些软件。优选地，比对时使用默 认参数。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序为BLASTN和BLASTP， 使用W下默认参数:遗传密码=标准；过滤器=无;链=两种；切断=60;预期=10; Ma化ix =化0SUM62;描述=50个序列；分类=HI細SCORE;数据库=非冗余，GenBank + EMBL + 孤BJ + PDB + GenBank CDS翻译 + SwissProtein + SPupdate + PIR。运些程 序的详细信息可在W下网址找到ncbi .nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
[0078] 不用明确说明即可推测得出，除非另有说明，否则当本发明设及到多肤、蛋白质、 多核巧酸或抗体时，其等价物或生物学等价物也在本发明的保护范围之内。如本文所使用 的，当提到参考抗原、蛋白、抗体、片段、多肤或核酸时，术语"其生物学等价物"与"其等价 物"同义，并且是指具有最小同源性但仍保持期望的结构或功能性的抗原、蛋白、抗体、片 段、多肤或核酸。除非本文另有特别说明，否则预期的是，任何本文提及的多核巧酸、多肤 或蛋白质也包括其等价物。在一个方面，等价多核巧酸是在严格条件下与本文所述用于所 描述的方法的多核巧酸或其互补序列杂交的多核巧酸。在另一个方面，等价抗体或抗原结 合多肤是指W至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%的亲和性 或更高的亲和性结合至参考抗体或抗原结合片段的抗体或多肤。在另一个方面，其等价物 在竞争性化ISA实验中与该抗体或抗原结合片段竞争结合至其抗原。在另一个方面，等价物 具有至少约80%同源性或一致性，或者至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约98% 的同源性或一致性，并且表现出与参考蛋白、多肤或核酸实质上等同的生物学活性。
[0079] "杂交"是指一个或多个多核巧酸发生反应W形成复合物的反应过程，该复合物通 过核巧酸残基的碱基之间的氨键结合而稳定化。氨键结合可为Watson-Crick碱基配对、 Hoogstein结合或任何其他序列特异性方式结合。该复合物可包括形成双链结构的两个链、 形成多链复合物的Ξ个或更多个链、单个自身杂交的链、或运些的任何组合。杂交反应可W 为更广泛过程中的一个步骤，例如是PC反应的起始步骤，或多核巧酸核酶催化中的酶促裂 解步骤。
[0080] 严格杂交条件的例子包括:溫育溫度为约25°C至约37°C;杂交缓冲液浓度为约6x SSC至约lOx SSC;甲酯胺浓度为约0%至约25%;并且洗涂溶液为约4x SSC至约8x SSC。中等 杂交条件的例子包括:溫育溫度为约40°C至约50°C ;缓冲液浓度为约9x SSC至约2x SSC;甲 酷胺浓度为约30%至约50%;并且洗涂溶液为约5x SSC至约2x SSC。高严格杂交条件的例子 包括:溫育溫度为约55°C至约68°C ;缓冲液浓度为约lx SSC至约0. lx SSC;甲酯胺浓度为约 55%至约75%;并且洗涂溶液为约lx SSC、0. lx SSC、或去离子水。一般而言，杂交溫育时间为 5分钟至24小时，具有1、2或更多个洗涂步骤，并且洗涂溫育时间为约1、2、或15分钟。SSC是 0.15 Μ化C1和15 mM巧樣酸盐缓冲液。要理解的是，可使用利用其它缓冲系统的SSC等价 物。
[0081 ]"同源性"或"一致性"或"相似性"是指两个肤之间或两个核酸分子之间的序列相 似性。同源性可通过比较每个序列中的一个位置来确定，运些序列可被对齐从而进行比较。 当被比序列中的一个位置被相同碱基或氨基酸占据时，那么运些分子在该位置是同源的。 序列之间的同源性程度与序列共享的匹配或同源位置的数量有关。"不相关的"或"非同源 的"序列与本发明的序列中的一个共享少于40%的一致性，或少于25%的一致性。
[0082] "同源性"或"一致性"或"相似性"也可W指在严格条件下杂交的两个核酸分子。
[0083] 如本文所使用的，术语"治疗"是指获得期望的药理学和/或生理学效果。该效果可 为治疗性的，表现为部分地或完全地治愈疾病和/或由该疾病造成的负面作用。在一个方 面，治疗表示使用已建立的规模的疾病症状的减少。
[0084] IGRP是由基因 IDDM7(2q31)(位于染色体2q28-32,与T1D易感基因重叠 )编码的，近 期它也被识别为人类T1D中潜在相关的β-细胞自身抗原。通过表达HLA-A*0201转基因的、来 自鼠类I类MHC缺失的NOD小鼠的膜岛相关的CD8+细胞识别了人类IGRP的两个HLA-A*0 201 - 结合表位(hIGRP228-236和hIGRP26日-273)。结合至鼠类II类Μ肥分子（IAg7)的IGRP抗原的非限制 性例子包括例如IGRP2G6-214(其包含抗原肤VYLKTNVFL)、IGRP4-22(其包含抗原肤 LHRSG化II皿LQ抓YRTY或其等价物）和IGRPi28-i45(其包含抗原肤TAALSYTISRMEESSVTL或其 等价物）。
[0085] "防止"是指在体外或体内防止在倾向于患有疾病或具有作用的系统或对象中出 现的该疾病或作用。
[0086] "组合物"是指活性试剂和惰性(例如可检测试剂或标记物)或活性的另一种化合 物或组合物(例如佐剂)的组合。在一些实施例中，该组合物不包含助剂。
[0087] "药物组合物"包括活性试剂与惰性或活性的载体的组合，所述载体使得该组合物 适于体外、体内或间接体内的诊断或治疗用途。
[0088] 术语"功能上等同的密码子"是指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸 的6个密码子，并且也指编码生物学等价氨基酸的密码子(见下表）。
[0089] 密码子表
[0090] 如本文所使用的，"蛋白质"或"多肤"或"肤"是指包含至少五个氨基酸残基的分 子。
[0091] 本发明的其他目的、特点和优点将从W下详细描述中明显看出。但是，要理解的 是，详细的描述和具体的例子虽然表示了本发明的【具体实施方式】，但仅为了解释的目的而 给出，因为对于本领域技术人员明显的是，可根据该详细的描述，在本发明的范围内做出各 种改变和修饰。
[0092] 描述性实施方式 目前没有治疗平台使得能够完全抑制多克隆自身免疫反应而不影响全身免疫。本文描 述的本
【申请人】的发现使得能够设计自身免疫性疾病特异性药物，该药物使自身反应性疾病 特异的CD4+ T细胞和B细胞转变为同源的、单特异性的调节CD4+ T细胞和B细胞，它们协同 地抑制宿主的所有其他自身反应性T和B细胞反应，不论其精细的抗原特异性，但是具有灵 敏的疾病特异性，而不会损害全身免疫。
[0093] 型糖尿病(T1D)的自身抗原复杂性 TID是由逐渐侵蚀膜岛β细胞的慢性自身免疫反应引起的。在人类和NOD小鼠中的B细胞 破坏都受到识别许多自身抗原的T细胞影响（Tsai, S. et al. (2008) Adv. Immunol. 100:79-124; Lieberman, S. et al. (2003) Tissue Antigens 62:359-377)。虽然运些 事件的精确序列仍然不明确，但是目前的证据表明：TID需要CD4+和CD8+细胞；自身反应性Τ 细胞通过结合在局部APC上的Β细胞抗原而分化为杀伤子;运些Τ细胞祀定相当多的自身抗 原（Tsai, S. et al. (2008) Adv. Immunol. 100:79-124; Santamaria, Ρ. (2010) Immunity 32:437-445)。
[0094]已经表明，可溶性肤能够引起体内的肤特异性T细胞耐受，但是不能够纯化多特异 性自身免疫反应化an et al. (2005) NaUire Medicine 11(6) :645-652)。令人意外地，已 经发现，与使用可溶性肤的治疗不同，使用涂布有单T1D相关的I型pMHC的NP的治疗(最初被 用作阴性对照）纯化了糖尿病前期NOD小鼠的恶化并且恢复了糖尿病动物中的正常血糖 (Tsai, S. et al. (2010) Immunity 32:568-580)。后续的工作意外地发现，pMHC-NP治疗 通过W表位特异性的方式使经历了自身抗原的自身反应性CD8+细胞扩增而发生作用，运些 CD8+细胞通过抑制和杀死装载了自身抗原的APC，从而抑制其他自身抗原性T细胞特异性的 招募。更近地，
【申请人】发现，该治疗平台可W被用于自身反应性T调节CD4+细胞的体外扩增。 特别地，
【申请人】发现，涂布有单个T1D相关的II类pMHC的NP使疾病特异性TR1 CD4+ T细胞扩 增，表达TR1 标记物CD49b 和LAG3 (Gagliani, N. et al. (2013)化ture Medicine 19: 739-746)并产生细胞因子ILIO和TGF-β(见W下）。
[00%]运些发现共同地支持了自身免疫的进展中的新范例，其中通过内源性表位进行的 初始自身反应性CD8+或CD4+ T细胞的慢性刺激触发了它们分化为记忆样自身反应性调节T 细胞;运些记忆自身反应性调节细胞通过抑制和/或杀死装载了自身抗原的APC，抑制同源 和非同源的高亲和力的自身反应性T细胞特异性的激活（Tsai, S. et al. (2010) Immunity 32: 568-580)。重要地，并且不受理论约束，当被作为配体涂布至NP上时，在自身 免疫性疾病(在众多之中的）中设及的任何单个表位(pMHC)特异性都可W被用来纯化复杂 的自身免疫反应。
【申请人】相信，运些NP制剂不能激活初始T细胞，从而诱导效应T细胞反应， 因为它们缺少关键的共刺激分子(例如CD80和CD86)。实际上，同源的初始和效应自身反应 性细胞通过该方法被删除。所W，实行其发现的治疗方法为自身免疫中的一类新的治疗提 供了平台，它潜在地能够W疾病和器官特异性的方式解决多克隆自身免疫反应，而不会影 响全身免疫。
[0096] 方法 本发明还提供了医疗和诊断方法。在一个方面，提供了一种用于在有需要的对象中W 抗原特异性方式促进B调节细胞和/或TR1细胞(例如TR1和CD4+细胞)的形成、扩增和招募的 方法，所述方法包括W下步骤、或实质上由W下步骤组成、或由W下步骤组成：向所述对象 施用有效量的本文所述的NP-复合物或组合物。
[0097]在另一个方面，提供了一种在有需要的对象中治疗或防止自身免疫性疾病或病症 (例如MS、MS相关的疾病、糖尿病或糖尿病前期）的方法，所述方法包括W下步骤、或实质上 由W下步骤组成、或由W下步骤组成：向所述对象施用有效量的本文所述的NP-复合物或组 合物，其中抗原对于将要治疗的疾病是疾病相关的，例如，对于糖尿病的防止或治疗，抗原 是糖尿病相关的抗原。在进一步的方面，自身免疫性疾病是多发性硬化或多发性硬化相关 的疾病并且抗原是MS相关的。
[009引用于治疗或防止糖尿病前期或糖尿病的肤抗原包括但不限于：hInsBio-18 (HLVEALYLV)、hIGRP228-236 化NIDLLWSV)、hIGRP265-273 (VLF化GFAI)、IGRP206-214 (VYLKTNVFL)、NRP-A7 (KYNKANAFL)、NRP-I4 (KYNIANVFL)、NRP-V7 (KYNKANVFL)、YAI/Db (FQDENYLYL)和/或INS Bis-23 化化VCGERG)、GAD65ii4-i23、VMNILLQYVV;GAD65536-54己、 RMMEYGTTMV; GFAPi43-i5i、NLAQTDLATV; GFAP214-222、QLARQQVHV; IA-2i72-i80、SLS 化 QA化；I A- 2482-490、化 AAGVK1X;IA-28 日日-813、VIVMLTTLV;卵 lAPP 日-i3、KLQWLIV1^;wIAPP9-i7JLIVLSVA1^; IGRP152-160、化WSVFMLI; IGRP211-219、化化化FAV; IGRP215-223、化FAVGFYL; IGRP222-230、 YIXLR化NI; IGRP228-236、LNIDLLWSV; IGRP26日-273、VLF化GFAI; IGRP293-30i、RUXALT化；Pro- insul inL2-io、ALWMRLLPM Pro-insul inL3-ii、LWMRLLPIX; Pro-insul inL6-i4、RLLPLLAIX; Pro- insul inB 日-i4、HLCG 細 LVEA; Pro-insul inBio-18、HLVEALYLV; Pro-insul inBi4-22、ALYLVCG 邸； Pro-i n su 1 i ΠΒ15-24、LYLVCGERGF; Pro-in sul inBi7-25、LVCGERGFF; Pro-in sul inBi8-27、 VCGERGFFYT; Pro-insul inB20-27、GERGFFYT ; Pro-insul inB2i-29、ERGFFYTPK; Pro- insul i 邮2 已-Cl 、FYTPKTRRE; Pro-insul i 邮27-C5 、TPKTRREAEDM Pro-insul inc20-28、 SLQPLALEG; Pro-insul inc25-33、ALEGSLQKR; Pro-insul inc29-A5、SLQKRGIVEQ; Pro-insul iriAi-io、 GIVEQCCTSI; Pro-insul inA2-io、IVEQCCTSI; Pro-insul inAi2-20、SLYQLENYC 或其等价物和/或 组合。额外的例子包括：Pro Ins 76-90、化QPLALEGSLQKRG、Pro Ins 79-89、化ALEG化QKR、 Prolns 90-109、GIVEQCCTSIC化YQLENYC、ProIns 94-105、QCCTSICSLY化、GAD 247-266、 NMYAMMIARFKMF阳VKEKG、GAD 255-265、RFKMF阳VK邸、GAD 555-567、NFFRMVISNPAAT、IGRP 13-25、QHLQKDYRAYYTF、IGRP 8-27、GVLIIQHLQKDYRAYYTTLN、Pro Ins B24-C36、 FFYTPMSRREVED及其每个的等价物。
[0099] 当所述方法设及MS或MS相关的疾病的治疗时，所述复合物包括设及多发性硬化的 抗原。运些抗原包括例如在美国专利公开2012/0077686号中公开的抗原，W及来源于髓銷 碱性蛋白、髓銷相关糖蛋白、髓銷少突胶质细胞蛋白、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓銷糖 蛋白、髓銷相关的少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶 质细胞特异性蛋白N0G0 A、糖蛋白Po、外周髓銷蛋白22、W及2'3'环状核巧酸3'-憐酸二醋 酶的抗原。在一些实施例中，所述抗原来源于髓銷少突胶质细胞糖蛋白（M0G)。非限制性的 例子包括例如MAG287-29日、S化LELEEV; MAG日日9-日 17、LMWAKIGPV; MAG日日6-日64、VLFSSDFRI; MBPiio-118、 SLSRFSWGA; MOG114-122、KVEDPFYWV; MOG166-17日、RT抑PHFLRV; MOG172-180、FLRVPCWKI; MOG179-188、 ?αTLFVIVPV; M0G188-196、VLG化VALI; M0G181-189、TLFVIVP化；M0G2日日-214、RLAGQFLffiL; PLP80-88、 FLYGA化LA或其等价物或组合。
[0100] 能够被用在本发明中的抗原的其他非限制性例子包括多肤，运些多肤包括W下多 肤、或实质上由W下多肤组成、或由W下多肤组成:MOG35-55、MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; M0G36-日日、EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MAG287-29 日、化化化邸 V; MAG 日日 9-日 17、LMWAKIGPV; MAG 日日 6-564、 VLFSSDFRI; MBPI110-118、化SRFSWGA; M0G114-122、KVEDPFYWV; M0G166-175、RT抑PHFLRV; MOG172-180、 FLRVPCWKI ;M0Gi79-i88、KITLFVIVPV;M0Gi88-i96、VLG化VALI;M0Gi8i-i89、TLFVIVP化；MOG2日日-214、 RLAGQFLffiL; PLP8Q-88、FLYGA化LA或其每一个的等价物、或其组合。
[0101] 确定和监控疗法的方法在本领域是已知的，并在本文简要描述。当在体外递送时， 施用通过将组合物与组织或细胞W任何适当方法接触而进行，例如，通过施用至细胞或组 织培养基，并且用作筛选器w确定该疗法是否适合某个个体或者用w筛选出替代性疗法， 从而作为所公开的组合物的替代或与其结合。当在体内递送时，施用通过全身或局部施用 进行。在体内，所述方法可在人体施用之前在非人动物上实施，W筛选出替代性疗法，从而 作为所公开的组合物的替代或与其结合。在人或非人哺乳动物中，它们对于治疗疾病或病 症也是有用的。
[0102] 上述方法要求有效量的NP-复合物的施用。
[0103] 抗原-MHC-纳米颗粒复合物的MHC可为MHC I、MHC II或非经典Μ肥，但优选MHCII。 MHC蛋白在本文中有描述。在一个实施方式中，抗原-MHC-纳米颗粒复合物的MHC是I类MHC。 在另一个实施方式中，该MHC是II类MHC。在其他实施方式中，抗原-MHC-纳米颗粒复合物的 MHC成分是II类MHC或如本文所述的非经典MHC分子。在一个方面，所述抗原包括W下多肤 GWYRSPFSRVVH或GWYRSPFSRVVH的等价物、或实质上由其组成、或由其组成。
[0104] 纳米颗粒的尺寸可在约1 nm至约1皿之间变化。在某些实施方式中，纳米颗粒的 直径小于约1 μπι。在其他实施方式中，纳米颗粒的直径小于约500 nm、小于约400 nm、小于 约300 nm、小于约200 nm、小于约100 nm、或小于约50 nm。在另外的实施方式中，纳米颗粒 的直径为约 1 nm至约 10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、40 nm、50 nm、75 nm或 100 nm。在 具体的实施方式中，纳米颗粒为约1皿至约100 nm、约1 nm至约50 nm、约1 nm至约20 nm、 或约5 nm至约20 nm。
[0105] 复合物的尺寸可在约5 nm至约1皿之间变化。在某些实施方式中，复合物的直径 小于约1 ym或小于100 nm。在其他实施方式中，复合物的直径小于约500 nm、小于约400 皿、小于约300皿、小于约200皿、小于约100皿、或小于约50皿。在进一步的实施方式中， 复合物为约5皿或10皿至约50皿、或约5皿至约75皿、或约5皿至约50皿、或约5皿至 约60 nm、或约10 nm至约60 nm,或者在一个方面为约55 nm。
[0106]
【申请人】已经发现，纳米颗粒上的抗原-ifflC复合物的密度对治疗效果有贡献。因此， 如本文公开的，抗原-MHC纳米颗粒复合物可W具有所定义的密度，该密度为包括该复合物 的纳米颗粒的每100皿2表面积上约0.05个MHC分子，假设至少2 MHC、或至少8、或至少9、或 至少10、或至少11、或至少12(个)MHC被复合至纳米颗粒。在一个方面，复合物的MHC密度为 每100皿2约0.01 Μ肥（0.05 Μ肥/100皿2)至约30 MHC/100皿2、或约0.1 Μ肥/100皿2至 约25 MHC/100皿2、或约Q.3 MHC/100皿2至约25 Μ肥/100皿2、或约Q.4 Μ肥/100皿2至约 25 Μ肥/100皿2、或约0.5 Μ肥/100皿2至约20 MHC/100皿2、或约0.6 MHC/100皿2至约20 MHC/100 ηπΛ或约 1.0 MHC/100 醒2至约20 MHC/100 nm2、或约5.0 MHC/100 歴2至约20 MHC/100 ηπΛ或约 10.0MHC/100 歴2 至约 20 MHC/100 ηπΛ或约 15 MHC/100 歴2 至约 20 MHC/100 nm2、或至少约0.5、或至少约1.0、或至少约5.0、或至少约10.0、或至少约15.0 MHC/100 nm2。在一个方面，当9或至少9(个)MHC被复合至纳米颗粒时，密度范围是约0.3 Μ肥A00nm2至约 20 Μ肥/100皿2。
[0107] 在其方法的一个方面，提供了一种用于在有需要的患者中积累Β调节细胞和/或抗 炎Τ细胞的方法。在进一步的实施方式中，Τ细胞是CD4+或CD8+ Τ细胞。在相关的实施方式 中，Τ细胞分泌IL-10或TG邱。所述方法包括W下步骤、或实质上由W下步骤组成、或由W下 步骤组成：向所述患者施用有效量的本文所述的抗原-MHC纳米颗粒复合物。
[0108] 在一个实施方式中，本文所述的组合物和方法是用于治疗自身免疫性疾病，例如 MS、MS相关的疾病、糖尿病或糖尿病前期。所述方法包括W下步骤、或实质上由W下步骤组 成、或由W下步骤组成：向由此需要的患者施用有效量的本文所述的抗原-MHCII纳米颗粒 复合物。
[0109] 在本文中描述了关于体外和体内施用的模型的细节。
[0110] 本发明还提供了 NP-复合物用于制备用于治疗和/或防止本文所述的疾病或病症 的药物的用途。
[0111] 抗原-MHC-纳米颗粒复合物 A.多肤和多核巧酸 另一些方面设及分离和或纯化的多肤抗原，其包含W下组分、或实质上由W下组分构 成、或由W下组分构成:本文所述的氨基酸序列，或与抗原的氨基酸序列具有至少约80%的 序列一致性、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%的序列一致性的多肤，或由与编 码抗原的氨基酸序列的多核巧酸具有至少约80%的序列一致性、或至少85%、或至少90%、或 至少95%、或至少98%的序列一致性的多核巧酸或其互补序列编码的多肤，或由在中等至高 严格条件下与编码抗原的氨基酸序列的多核巧酸或其互补序列杂交的多核巧酸编码的多 肤。本发明还提供了分离的和纯化的编码本文所述的抗原多肤的多核巧酸，或与本文公开 的序列具有至少约80%的序列一致性、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%的序列 一致性的氨基酸或等价物，或者是在严格条件下与所述多核巧酸、其等价物或其互补序列 杂交的多核巧酸，并且提供了由运些多核巧酸编码的分离且纯化的多肤。运些多肤和多核 巧酸能够与它们在天然状态下不联合在一起的非天然的物质联合在一起，运些物质例如是 载体、药学上可接受的载体、运载体和血1C分子、本领域已知的和本文所述的纳米颗粒。
[0112] 来自抗原物种(antigenic species)的抗原(包括区段、片段和其他分子），包括但 不限于，由本发明的经典和非经典MHC分子提呈的肤、碳水化合物、脂质或其他分子，通常被 复合或可操作地连接至血1C分子或其衍生物。T淋己细胞的抗原识别受限于主要组织相容性 复合物(MHC)。特定的T淋己细胞仅在其被结合至特定的MHC分子时才识别抗原。一般而言，T 淋己细胞仅在存在自身血1C分子的情况下被刺激，并且当抗原的片段结合至自身血1C分子时 抗原被识别。MH邱良制作用确定出了 T淋己细胞特异性，表现在所识别的抗原W及结合其抗 原片段的Μ肥分子方面。在特定的方面，某些抗原可与某些Μ肥分子或由其衍生的多肤配对。
[0113] 本文使用的术语"可操作地连接"或"涂布"是指单个多肤(例如MHC)和抗原（例如 肤)成分被结合从而在结合于祀定位点（例如免疫细胞)之前形成活性复合物的情况。运包 括单个多肤复合物成分被合成或重组表达并随后被分离和组合W在施用至对象之前在体 外形成复合物的情况;嵌合或融合多肤（即复合物的每个离散的蛋白质成分被包含在单个 多肤链中）被合成或重组表达为完整复合物的情况。通常，多肤复合物被添加至纳米颗粒W 产生具有被吸附的或链接的多肤复合物的纳米颗粒，其中分子的数量:纳米颗粒的数量的 比率为从约、至少约、或至多约 0.1、0.5、1、3、5、7、10、15、20、25、30、35、40、50、100、125、 150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、 1000、1500或更多：1，更常见地为0.1:1、1:1至50:1或300:1。纳米颗粒的多肤含量可利用标 准技术来确定。
[0114] 分子 细胞内抗原和细胞外抗原对免疫系统的作用在识别和适当响应方面有很大区别。抗原 向τ细胞的提呈通过两种不同种类的分子来介导，即I类MHC(MHC-I)和II类MHC(MHC-II)(在 本文中还被称为"pMHC'），它们使用不同的抗原加工途径。来源于细胞内抗原的肤由I类MHC 分子提呈至CD8+ T细胞，I类MHC分子几乎在所有细胞上都表达，而细胞外抗原来源的肤由 MHC-II分子提呈至CD4+ T细胞。但是，运种二分法也有例外。多项研究显示，由胞饮颗粒生 成的多肤或可溶性蛋白质在巨隧细胞W及树突细胞中被提呈在MHC-I分子上。在本发明的 某些实施方式中，特定的抗原在合适血1C I类或II类多肤的情况下被识别并被提呈在抗原- MHC-纳米颗粒复合物中。在某些方面，对象的基因组成可被评估从而确定哪种MHC多肤要被 用于特定的患者W及特定一组的肤。在一些实施方式中，I类MHC成分包括化A-A、化A-B、 HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G或CD-1的全部或部分。在Μ肥成分是II类Μ肥成分的实施方式中， 所述II类Μ肥成分可W包括HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的全部或部分。
[0115] 预期非经典MHC分子也可用在本发明的MHC复合物中。非经典MHC分子是非多态性 的，在物种之间是保守的，并且具有狭窄、深的、疏水的配体结合袋。运些结合袋能够将糖脂 和憐脂提呈至自然杀伤T(NKT)细胞或特定亚型的CD8+ T细胞（例如Qal或化A-E-限制的 CD8+ T细胞）dNKT细胞是独特的淋己细胞群，其共表达NK细胞标记物和半不变（semi- invarianOT细胞受体(TCR)。它们参与了与许多疾病相关的免疫响应的调节。
[0116] 抗原成分 本发明的某些方法包括关于抗原成分的方法和组合物，所述抗原成分包括多肤的区 段、片段或表位、肤、核酸、碳水化合物、脂质和其他引起或诱导抗原响应的分子(统称为抗 原）。具体而言，抗原决定簇的抗原区段或片段，经自身免疫响应导致细胞破坏，其可W被识 别并用于制造本文所述的抗原-MHC-纳米颗粒复合物。本发明的实施方式包括用于调节身 体的细胞或组织中的免疫响应的组合物和方法。
[0117] 本发明的抗原多肤和肤可通过各种氨基酸缺失、插入和/或取代而被修饰。在特定 实施方式中，经修饰的多肤和/或肤能够调节对象中的免疫响应。在一些实施方式中，使用 了野生型的蛋白质或肤，但在本发明的许多实施方式中，使用了经修饰的蛋白质或多肤W 生成抗原-MHC-纳米颗粒复合物。抗原-MHC-纳米颗粒复合物可被用来产生抗炎免疫响应， 从而改变免疫系统的T细胞群（即，改造免疫系统），和/或为特定组织招募和累积抗炎T细 胞。W上所述术语可在本文中被互换使用。"经修饰的蛋白脉'或"经修饰的多肤"或"经修饰 的肤"是指相对于野生型蛋白质或多肤化学结构(特别是其氨基酸序列)被改变了的蛋白质 或多肤。在一些实施方式中，经修饰的蛋白质或多肤或肤具有至少一种经改变的活性或功 能（要意识到蛋白质或多肤或肤可具有多种活性或功能）。特别预期的是，经修饰的蛋白质 或多肤或肤的一种活性或功能可被改变，但另一方面可保留一种野生型活性或功能，例如 免疫原性或在MHC-纳米颗粒复合物的情况下的与免疫系统的其他细胞相互作用的能力。 [011引肤抗原的非限制性例子包括但不限于：hInsBio-18 (HLVEAL化V)、hIGRP228-236 化NIDLLWSV)、hIGRP26日-273 (VLFGLGFAI)、IGRP206-214 (νπΧΓΝν化）、NRP-A7 化YNKANA化）、 NRP-I4 (KYNIANVFL)、NRP-V7 (KYNKANVFL)、YAI/Db (FQDENYLYL)和/或INS Bi己-23 (LYLVCGERG)，W及在美国专利申请公开2005/0202032号中公开的肤和蛋白W及其等价物 和/或组合。
[0119]在一些方面，用于 T1D 的治疗的肤抗原是 GAD65ii4-i23、VMNI1XQYVV;GAD65536-545、 RMMEYGTTMV; GFAP143-151、NLAQTDLATV; GFAP214-222、QLARQQVHV; IA-2172-180、SLS化QA化；IA- 2482-490、化 AAGVK1X;IA-28 日日-813、VIVMLTTLV;卵 ΙΑΡΡ 日-i3、KLQWLIV1^;wIAPP9-i7JLIVLSVA1^; IGRPi52-i6〇、化WSVFMLI; IGRP211-219、化化化FAV; IGRP215-223、化FAVGFYL; IGRP222-230、 化化RVLNI; IGRP228-236、LNIDLLWSV; IGRP26日-273、VLF化GFAI; IGRP293-3〇i、RUXALT化；Pro- insul inL2-io、ALWMRLLPM Pro-insul inL3-ii、LWMRLLPIX; Pro-insul inL6-i4、RLLPLLAIX; Pro- insul inB 日-i4、HLCG 細 LVEA; Pro-insul inBio-18、HLVEALYLV; Pro-insul inBi4-22、ALYLVCG 邸； Pro-i n su 1 i ΠΒ15-24、LYLVCGERGF; Pro-in sul inBi7-25、LVCGERGFF; Pro-in sul inBi8-27、 VCGERGFFYT; Pro-insul inB2〇-27、GERGFFYT ; Pro-insul inB2i-29、ERGFFYTPK; Pro- insul i 邮2 已-Cl 、FYTPKTRRE; Pro-insul i 邮27-C5 、TPKTRREAEDM Pro-insul inc2〇-28、 SLQPLALEG; Pro-insul inc25-33、ALEGSLQKR; Pro-insul inc29-A5、SLQKRGIVEQ; Pro-insul iriAi-io、 GIVEQCCTSI;Pro-insul inA2-io、IVEQCCTSI; Pro-insul inAi2-2〇、SLYQLENYC或其等价物和/或 组合。
[0120] 抗原的其他非限制性例子包括能够被用在本发明中的MS和MS相关的抗原，它们包 括W下多肤、或实质上由W下多肤组成、或由W下多肤组成：MOG35-55、 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK ; M0G36-日日、EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MAG287-29日、SLLLELEEV; MAG509-517、LMWAKIGPV; MAG556-564、VLFSSDFRI; MBPI110-118、化SRFSWGA; M0G114-122、KVEDPFYWV; M0G166-175、RT抑PHFLRV; MOG172-180、化RVPCWKI; M0G179-188、?α TLFVIVPV; M0G188-196、VLG化VALI; M0G181-189、TLFVIVP 化;M0G2 日日-214、RLAGQFLffiL; PLP80-88、化 YGA1XLA、或其每一个的等价物、或 其组合。
[0121] 在进一步的方面，用于治疗MS和MS相关的疾病的肤抗原包括但不限于:M0G35-55、 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; M0G36-日日、EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MAG287-29日、S化LELEEV; MAG 日日 9-517、 LMWAKIGPV;MAG556-564、VLFSSDFRI;MBPiio-118、SLSRFSWGA;M0G114-122、KVEDPFYWV;M0G166-17已、 RTFDPHFLRV; M0G172-18Q、FLRVPCWKI; M0G179-188、UTLFVIVPV; M0G188-196、VLG化VALI; MOGisi-189、 TLFVIVP化；MOG2日日-214、化AGQFL邸L; PLP80-88、化YGAIXLA MAG287-29日、化化化邸V; MAG日日9-517、 LMWAKIGPV; MAG日日6-日64、VLFSSDFRI、及其等价物和/或组合。
[0122] 用于治疗MS和MS相关的疾病的抗原包括在美国专利申请公开2012/0077686号中 公开的抗原、W及来源于髓銷碱性蛋白、髓銷相关糖蛋白、髓銷少突胶质细胞蛋白、蛋白脂 质蛋白、少突胶质细胞髓銷糖蛋白、髓銷相关的少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异 性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白N0G0 A、糖蛋白Po、外周髓銷蛋白22、W及2' 3'环状核巧酸3'-憐酸二醋酶的抗原。在一些实施例中，所述抗原来源于髓銷少突胶质细胞 糖蛋白（M0G)。
[0123] 在一些实施方式中，蛋白质或多肤(野生型或经修饰）（包括感兴趣的蛋白质或肤 的任何复合物，特别是MHC-肤融合体)的尺寸可包含，但不限于，5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、 210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、 625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、 1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500个氨基分子或更多，包括延伸出的任何范围或值， W及它们的衍生物。在某些方面，5、6、7、8、9、10或更多个连续的氨基酸(包括其衍生物)和 抗原的片段(例如本文所公开和引用的那些氨基酸序列）可被用作抗原。预期的是，多肤可 通过截断而突变，使得它们短于它们相应的野生型形式，但它们也可能通过融合或结合具 有特定功能(例如为实现W蛋白质复合物形式呈现，或为实现增强的免疫原性等等）的异源 蛋白质序列而被改变。
[0124] 蛋白质组合物可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，包括（i)通过标准 化分子生物学技术表达蛋白质、多肤或肤，（ii)从自然来源中分离蛋白质化合物，或（iii) 化学合成蛋白质物质。各种基因的核巧酸W及蛋白质、多肤和肤序列之前已公开，并且可在 公认的计算机数据库中找到。一种运样的数据库是美国国家生物技术信息中屯、的GenBank 和GenPept数据库（网址ncbi .nlm.n化.gov/)。运些基因的全部或部分编码区可利用本文公 开的技术或本领域技术人员已知的技术来扩增和/或表达。
[0125] 运些组合物的自身抗原表位和其他多肤的氨基酸序列变化可W是取代变化、插入 变化或缺失变化。本发明的多肤的修饰，与野生型相比，可能影响肤或多肤的1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、100、101、102、103、104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、 143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、 162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、 181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、 238、239、240、241、242、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、 249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、 268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、 287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、 306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、 325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、 ：M4、：M5、：M6、：M7、：M8、：M9、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、 363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、 382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、 401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、 420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、4：34、435、436、437、438、 439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、 458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、 477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、 496、497、498、499、500个或更多个非连续或连续的氨基酸。
[0126] 缺失改变通常缺乏了天然或野生型氨基酸序列的一个或多个残基。可能缺失单个 残基，或者缺失多个连续的氨基酸。终止密码子可被引入(通过取代或插入)到编码核酸序 列中，W产生截短蛋白。插入突变通常设及在多肤的非末端位点添加物质。运可包括插入一 个或多个残基。也可W进行末端添加，产生所谓的融合蛋白。
[0127] 取代变化通常包含在蛋白质内的一个或多个位点处的一个氨基酸与另一个氨基 酸的替换，并且可被设计用来调节多肤的一种或多种性质，并伴随其他功能或性质的保留 或丧失。取代可W是保守性的，即，一个氨基酸被具有相似形状和电荷的氨基酸替代。保守 性取代在本领域是熟知的，包括例如W下改变:丙氨酸到丝氨酸;精氨酸到赖氨酸;天冬酷 胺到谷氨酷胺或组氨酸;天冬氨酸到谷氨酸;半脫氨酸到丝氨酸;谷氨酷胺到天冬酷胺;谷 氨酸到天冬氨酸;甘氨酸到脯氨酸;组氨酸到天冬酷胺或谷氨酷胺;异亮氨酸到亮氨酸或鄉 氨酸;亮氨酸到鄉氨酸或异亮氨酸;赖氨酸到精氨酸;蛋氨酸到亮氨酸或异亮氨酸;苯丙氨 酸到酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸;丝氨酸到苏氨酸;苏氨酸到丝氨酸;色氨酸到酪氨酸;酪氨酸 到色氨酸或苯丙氨酸；W及鄉氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。可替换地，取代可W是非保守的， 因而多肤或肤的功能或活性受到影响，例如对细胞受体的亲合力或亲和性受到影响。非保 守性变化通常设及W化学上不相似的残基来取代一个残基，例如极性或带电荷的氨基酸对 非极性或不带电荷的氨基酸的取代，W及相反的情况。
[0128] 本发明的蛋白质可W是重组的，或在体外合成的。可替代地，重组蛋白可从细菌或 其它宿主细胞中分离出来。
[0129] 还要理解的是，氨基酸和核酸序列可包括额外的残基，例如分别是额外的N-或C- 末端氨基酸，或5'或3'的核酸序列，但仍然基本上是如本文所公开的其中一个序列的序列， 只要该序列符合如上所述的条件，包括生物学蛋白活性(例如免疫原性）的维持。添加末端 序列特别适用于核酸序列，其可例如包括在5 '或3 '编码区的侧翼的各种非编码序列。
[0130] 预期的是，在本发明的组合物中，每ml含有约0.001 mg至约10 mg的总蛋白质。因 此，组合物中的蛋白质的浓度可为约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、50、100 pg/ml或mg/ml或更高(或由此衍生的任何范围值）。其 中，约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99、100%可W是抗原-MHC-纳米颗粒复合物。
[0131] 另外，美国专利4,554,101号化OPP)教导了表位的识别W及基于亲水性由主要氨 基酸序列制备表位，该专利通过引用合并至本文中。通过化PP公开的方法，本领域技术人员 能够从氨基酸序列中识别出潜在的表位，并确认它们的免疫原性。许多科技文献也设及到 二级结构的预测W及根据氨基酸序列的分析来识别表位（Chou & Fasman, Adv. Enzymol., 47:45-148, 1978; Chous and Fasman, Annu, Rev. Biochem., 47:251-276, 1978, Chou and Fasman, Biochemistry, 13(2):211-222, 1974; Chau and Fasman, Biochemistry, 13(2):222-245, 1974, Chou and Fasman, Biophys. J., 26(3):385- 399，1979)。如果期望的话，任何运些文献都可被用来补充化pp在美国专利4,554,101号中 的教导。
[0132] 对于任何特定的自身免疫性疾病，可W使用本领域已知的方法识别和预选择抗原 复合物。算法存在-来源于已知会结合至特定的血1C分子的一组对齐的肤，其可W被用作 肤-MHC结合和T细胞表位的预测器。
[0133] 非肤分子可作为抗原或抗原片段而与MHC分子复合，运样的分子包括，但不限于， 碳水化合物、脂质、小分子等。碳水化合物是多种细胞的外表面的主要成分。某些碳水化合 物是不同分化阶段的特征，并且很多时候运些碳水化合物被特异性抗体识别。独特的碳水 化合物的表达可被限制至特定的细胞类型。
[0134] 底物/纳米颗粒 在某些方面，抗原/ 复合物被可操作地连接至基底(底物），它可被共价或非共价地 结合至基底。基底可W是纳米颗粒的形式，其任选地包括生物相容性的和/或生物可吸收材 料。因此，在一个实施方式中，所述纳米颗粒是生物相容性的和/或生物可吸收的。在另一个 方面，所述纳米颗粒具有固体核屯、和/或并非是脂质体。基底也可W是例如那些在美国专利 公开2009/0155292号中所述的纳米颗粒的形式。纳米颗粒的结构的尺寸可变，已知的有纳 米球、纳米颗粒或生物相容性的生物可降解的纳米球或生物相容性的生物可降解的纳米颗 粒。含有抗原/ MHC复合物的运种粒状制剂可通过该复合物与纳米颗粒的共价或非共价结 合而形成。
[0135] 纳米颗粒通常由实质上球形的核构成，并且任选地包含一个或多个层。该核的尺 寸和成分可变化。除了核之外，纳米颗粒可具有一个或多个层W提供适合应用目的的功能 性。如果存在层的话，层的厚度可根据具体的应用需要而变化。例如，层可赋予有用的光学 性质。
[0136] 层也可赋予化学或生物学功能性，在本文运称为化学活性层或生物学活性层，并 且对于运些功能性而言，该层或运些层通常的厚度为约0.001微米(1纳米)至约10微米或更 大(取决于期望的纳米颗粒直径），运些层通常被施用在纳米颗粒的外表面。
[0137] 核和层的成分可不同。颗粒或核的合适材料包括，但不限于，聚合物、陶瓷材料、玻 璃、矿物质等。例子包括，但不限于，标准和特种玻璃、二氧化娃、聚苯乙締、聚醋、聚碳酸醋、 丙締酸聚合物、聚丙締酷胺、聚丙締腊、聚酷胺、含氣聚合物、有机娃、纤维素、娃、金属（例 如，铁、金、银）、矿物质(例如红宝石）、纳米颗粒(例如，金纳米颗粒、胶体粒子、金属氧化物、 金属硫化物、金属砸化物和磁性材料(如铁的氧化物）），W及它们的复合材料。核可W为同 质成分，或根据期望的性质可为两种或更多种材料的复合材料。在某些方面，会使用金属纳 米颗粒。运些金属颗粒或纳米颗粒可由Au、Pt、Pd、Cu、Ag、Co、Fe、Ni、Mn、Sm、Nd、P;r、Gd、Ti、 化、Si、和In、前体、它们的二元合金、它们的Ξ元合金W及它们的金属间化合物形成。参见 美国专利6,712,997号。在某些实施方式中，如果纳米颗粒是生物相容性的和生物可吸收 的，核和层的成分可不同。核可为同质成分，或根据期望的性质可为两种或更多种材料的复 合材料。在某些方面，会使用金属纳米球。运些金属纳米颗粒可由化、Ca、Ga等形成。在某些 实施方式中，所述纳米颗粒包括的核包括金属或金属氧化物，例如金或氧化铁。
[0138] 如前所述，纳米颗粒除包括核之外还可包括一个或多个层。纳米颗粒可包括由生 物可降解糖或其他聚合物构成的层。生物可降解层的例子包括但不限于葡聚糖；聚（乙二 醇）；聚（环氧乙烧）；甘露醇;基于聚丙交醋(PLA)、聚乙交醋(PGA)、聚己内醋(P化)的聚醋； P皿-PHV类的聚径基链烧酸醋；和其它改性的聚糖，例如淀粉、纤维素和壳聚糖。此外，纳米 颗粒可包括具有用于附接化学功能性W实现化学键合或结合位点的合适表面的层。
[0139] 层可通过本领域技术人员已知的多种方式产生于纳米颗粒上。例子包括溶胶-凝 胶化学技术，例如Iler,化emistiT of Silica, John Wiley & Sons, 1979; linker and Scherer, Sol-gel Science, Academic Press, (1990)所描述的。其他在纳米颗粒上 产生层的途径包括表面化学和包封技术，例如在化dch and化own, J. A化esion, 67: 259-276, 1998; Pekarek et al., Nature, 367:258, (1994); Hanprasopwattana, Langmuir, 12:3173-3179, (1996); Davies, Advanced Materials, 10:1264-1270, (1998) W及其中所引用的文献中所描述的。也可W使用蒸汽沉积技术，参见例如Golman and Siinohara，Trends Chem. Engin.，6:1-6，（2000);和美国专利6,387,498号。其他 途径包括逐层自组装技术，例如在Suldlo;rukovetal.,PolymersAdv.Tech.,9(10- 11):759-767, (1998); Caruso et al., Macromolecules, 32(7):2317-2328, (1998); Caruso et al., J.Amer. Qiem. Soc., 121(25):6039-6046, (1999);美国专利 6,103, 379号W及其中所引用的文献中所描述的。
[0140] 如在美国专利4，589，330号或4，818，542号中所教导的，纳米颗粒可通过接触含有 抗原/MHC/共刺激分子复合物的水相、聚合物和非水相，随后蒸发非水相W导致颗粒从水相 聚结而形成。用于此制备的优选聚合物是选自W下物质的天然的或合成的共聚物或聚合 物：明胶琼脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、胶原蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交醋-L(-)丙 交醋聚（ε己内醋）、聚（ε-己内醋-共聚-乳酸）、聚（ε-己内醋-共聚-乙醇酸）、聚（β径基下 酸）、聚环氧乙烧、聚乙締、聚(烷基-2-氯基丙締酸醋）、聚（甲基丙締酸径乙醋）、聚酷胺、聚 (氨基酸）、聚（2-径乙基化-天冬酷胺）、聚（醋脈）、聚化-苯丙氨酸/乙二醇/1,6-二异氯酸 醋）和聚（甲基丙締酸甲醋）。特别优选的聚合物是聚醋，如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交醋-U-) 丙交醋聚（ε己内醋）、聚（ε-己内醋-共聚-乳酸)和聚（ε-己内醋-共聚-乙醇酸）。用于溶 解聚合物的溶剂包括:水、六氣异丙醇、二氯甲烧、四氨巧喃、己烧、苯或六氣丙酬倍半水合 物。
[0141] 纳米颗粒的尺寸可在约1 nm至约1皿之间变化。在某些实施方式中，纳米颗粒的 直径小于约1 μπι。在其他实施方式中，纳米颗粒的直径小于约500 nm、小于约400 nm、小于 约300 nm、小于约200 nm、小于约100 nm、或小于约50 nm。在另外的实施方式中，纳米颗粒 的直径为约 1 nm至约 10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、40 nm、50 nm、75 nm或 100 nm。在 具体的实施方式中，纳米颗粒为约1皿至约100 nm、约1 nm至约50 nm、约1 nm至约20 nm、 或约5 nm至约20 nm。
[0142] 复合物的尺寸可在约5 nm至约1皿之间变化。在某些实施方式中，复合物的直径 小于约1 ym或小于100 nm。在其他实施方式中，复合物的直径小于约500 nm、小于约400 皿、小于约300皿、小于约200皿、小于约100皿、或小于约50皿。在进一步的实施方式中， 复合物为约10皿至约50皿、或约20皿至约75 nm、或约25皿至约60 nm、或约30皿至约 60 nm,或者在一个方面为约55 nm。
[0143] 抗原-MHC复合物与纳米颗粒的结合 为了将底物或纳米球结合至抗原复合物，可使用W下技术。
[0144] 该结合可通过化学改性底物或纳米颗粒而实现，改性通常设及在表面上生成"功 能基团"，所述功能基团能够结合至抗原-MHC复合物，和/或将底物或纳米颗粒的可选的化 学改性的表面与共价或非共价键合的所谓"连接分子"连接，随后使抗原-MHC复合物与所获 得的纳米颗粒反应。
[0145] 术语"连接分子"是指能够与底物或纳米颗粒连接并且能够连接至抗原-MHC复合 物的物质。在一些实施方式中，抗原-MHC复合物通过接头/连接物(linker)被结合至纳米颗 粒。合适的连接物的非限制性例子包括多己胺(DPA)-聚乙二醇(PEG)连接物，例如DPA-PEG- NHS醋、DPA-PEG-邻化晚基-二硫化物(0PSS)和/或DPA-PEG-叠氮化物。其他连接物包括肤连 接物、乙二醇、生物素和链霉亲和素。
[0146] 本文使用的术语"功能基团"并不限于形成共价键的反应性化学基团，而且包括导 致与抗原复合物形成离子相互作用或氨键的化学基团。而且，要注意的是，无法严格区 别在表面上生成的"功能基团"W及含有"功能基团"的连接分子，因为有些时候表面的改性 需要较小的连接分子(例如乙二醇)与纳米球表面反应。
[0147] 功能基团或含有功能基团的连接分子可选自氨基、碳酸基、硫醇、硫酸、二硫化物、 脈基、径基、胺基、邻二醇、醒、α-面代乙酷基、隶官能(mercu巧OTgany 1 eS)、醋基、酷基面、 酸硫醋、酸酢、异氯酸醋、异硫氯酸醋、横酸面化物、亚氨酸醋、重氮乙酸醋、重氮盐、1,2-二 酬、麟酸、憐酸醋、横酸、挫化物、咪挫、吗I噪、N-马来酷亚胺、α-β-幾基化合物、芳基面化物或 其衍生物。
[0148] 其他具有较高分子量的连接分子的非限制性例子是核酸分子、聚合物、共聚物、可 聚合连接剂、二氧化娃、蛋白质和相对于底物或纳米颗粒具有相反极性的表面的链样分子。 核酸虽然对于连接分子来说具有互补序列，但其可为含有自身核酸分子的亲和分子提供连 接。
[0149] 共价连接物的具体例子包括聚乙二醇(PEG)，例如功能化的PEG。如本文使用的， "功能化的PEG"是指包含末端官能团的PEG基团，运些官能团的非限制性例子包括氨基、琉 基、硫酸基、簇基等。在本文的表1和2中提供了多种纳米颗粒上的功能化的PEG连接物的非 限制性例子，例如，PEG连接物是琉基-PEG- N出连接物。
[0150] 在某些实施方式中，本文所述的连接物具有确定的尺寸。在一些实施方式中，连接 物小于约10 kD、小于约5 kD、小于约4.5 kD、小于约4 kD、小于约3.5 kD、小于约3 kD、小于 约2.5 kD、小于约2 kD、或小于约1 kD。在另外的实施方式中，连接物为约0.5 kD至约5、 4.5、 4、3.5、3、2.5、2、1.5或11^)。在另外的实施方式中，连接物为约11^)至约4.5、4、3.5、3、 2.5、 2或1.51^)。
[0151] 可聚合连接剂的例子可为下二烘、苯乙締下二締、乙酸乙締醋、丙締酸醋、丙締酷 胺、乙締基化合物、苯乙締、氧化娃、氧化棚、憐氧化物、棚酸醋、化咯、聚化咯和憐酸醋。
[0152] 底物或纳米颗粒的表面可被化学修饰，例如通过结合具有功能性反应基团的麟酸 衍生物而改性。运些麟酸或麟酸醋衍生物的一个例子是亚氨基-二(亚甲基麟簇基)碳酸，其 可通过"Mannich-Moe化itzer"反应合成。运种结合反应可与直接从制备工艺获得的或经预 处理（例如用Ξ甲基漠硅烷预处理）的底物或纳米球进行。在第一种情况下，麟酸（醋）衍生 物可例如置换仍结合至表面的反应介质的成分。运种置换可在较高溫度下被增强。另一方 面，Ξ甲基漠硅烷被认为用来对含烷基的、基于憐酸的偶联剂进行脱烷基化，从而为麟酸 (醋)衍生物产生新的结合位点。麟酸(醋)衍生物或结合至其上的连接分子可表现出与W上 给出的相同的功能基团。底物或纳米球的表面处理的另一个例子设及在二元醇(例如乙二 醇）中加热。应注意的是，如果合成已在二元醇中进行的话，那么运种处理是多余的。在运些 情况下，直接获得的合成产物可能显示出所需要的功能基团。但是，运种处理适用于在含N- 或P-偶联剂中产生的底物或纳米颗粒。如果运样的底物或颗粒经受使用乙二醇的后处理， 那么仍结合至底物的反应介质(例如偶联剂)的成分可被该二元醇取代和/或被脱烷基化。
[0153] 还可W通过具有第二功能基团的伯胺衍生物来取代仍结合至颗粒表面的含N偶 联剂。底物或纳米颗粒的表面也可涂布有二氧化娃。二氧化娃可实现相对简单的有机分子 的化学结合，因为二氧化娃容易与有机连接物(例如Ξ乙氧基硅烷或氯硅烷)反应。纳米颗 粒表面也可涂布有均聚物或共聚物。可聚合偶联剂的例子是N-(3-氨基丙基)-3-琉基苯甲 脉、3-(Ξ甲氧基甲娃烷基）丙基酷阱和3-Ξ甲氧基甲娃烷基）丙基马来酷亚胺。可聚合偶 联剂的其他非限制性例子在本文有提及。运些偶联剂可单独使用或组合使用，运取决于要 生成为涂层的共聚物的类型。
[0154] 另一种可用于含有氧化过渡金属化合物的底物或纳米颗粒的表面改性技术是通 过氯气或有机氯化剂将氧化过渡金属化合物转化成相应的氧氯化物。运些氧氯化物能够与 亲核试剂反应，例如通常在生物分子中找到的径基或氨基基团。运种技术使得产生于蛋白 质的直接结合(例如通过赖氨酸侧链的氨基基团而结合）。在用氧氯化物进行表面改性后与 蛋白质的结合也可利用双功能连接物(例如马来酷亚胺基丙酸酷阱)来实现。
[0155] 对于非共价连接技术，特别合适的是具有与底物或纳米球表面的极性或电荷相反 的极性或电荷的链型分子。可被非共价地连接至核/壳纳米球的连接分子的例子包括阴离 子、阳离子或两性离子表面活性剂、酸性或碱性蛋白质、聚胺、聚酷胺、聚讽或聚簇酸。底物 或纳米球与具有功能性反应基团的两亲性试剂之间的输水相互作用可产生所需的连接。特 别地，具有两亲性特征的链型分子(例如憐脂或可相互交联的衍生多糖)是有用的。运些分 子在表面上的吸附可通过共培养来实现。亲和分子和底物或纳米颗粒之间的结合也可基于 非共价自组装键来实现。其一个例子包括作为连接分子的具有生物素的简单探针和连接有 抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的分子。
[0156] 功能基团与生物学分子的偶联反应的方案可在文献中找到，例如"Biocon jugate Techniques" (Greg Τ. Hermanson, Academic Press 1996)。生物学分子（例如MHC分子或 其衍生物)可根据有机化学的标准程序共价地或非共价地偶联至连接分子，运些标准程序 例如是氧化、面化、烷基化、酷化、添加、取代或酷胺化。偶联所述共价地或非共价地结合的 连接分子的运些方法可在将连接分子偶联至底物或纳米球之前或之后进行。而且，通过溫 育可影响分子向相应的预处理的底物或纳米颗粒(例如通过Ξ甲基漠硅烷预处理）的直接 结合，由于该预处理其表现出改性的表面(例如更高的电荷或极性的表面）。
[0157] 蛋白质生产 本发明描述了用于本发明的各种实施方式的多肤、肤和蛋白质。例如，特定的肤和它们 的复合物被分析了它们的引起或调节免疫响应的能力。在特定的实施方式中，本发明的肤 或蛋白质的全部或部分也可根据常规技术在溶液中合成或在固体载体上合成。各种自动合 成仪在商业上是可获得的，并且可根据已知的方案使用。参见例如Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2"*^. Ed. , Pierce Chemical Co. 1, (1984); Tam et al., J. Am. Qiem. Soc., 105:6442, (1983); Merrifield, Science, 232(4748):341- 347, (1986); l^^Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meinhofer 化ds.)，Academic Press, NY, 1-284，（1979)，通过引用将各篇合并至本文中。替代地， 重组DNA技术可被使用，其中编码本发明的肤的核巧酸序列被插入到表达载体中，并被转化 或转染至合适的宿主细胞，并在适合表达的条件下培养。
[0158] 本发明的一个实施方式包括使用向细胞(包括微生物）的基因转移，从而生产蛋白 质。感兴趣的蛋白质的基因可被转移至合适的宿主细胞，随后在合适条件下培养细胞。编码 几乎任何多肤的核酸都可被使用。重组表达载体的产生W及其中包括的元件对于本领域技 术人员来说是已知的，并在本文简要描述。哺乳动物宿主细胞系的例子包括，但不限于，ero 和化la细胞，其他B细胞系和T细胞系（例如CEM、721.221、朋、Jurkat、Raji)W及中国仓鼠卵 巢细胞系（C册）、胖138、8服、〇35-7、293、胎962、3了3、1?1巧隨0〇(细胞。此外，可选择调节被插 入序列的表达或W期望的方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的运种修饰 (例如糖基化)和加工(例如剪切)对于蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞具有特征性 的和特定的蛋白质翻译后加工和修饰机制。可选择合适的细胞系或宿主系统W确保所表达 的外源蛋白的正确的修饰和加工。
[0159] 许多选择系统可被施用，包括但不限于，HSV胸巧激酶基因、次黄嚷岭鸟嚷岭憐酸 核糖转移酶基因和腺嚷岭憐酸核糖转移酶基因，分别在tk细胞、hgpd细胞或曰口的细胞中。 而且，抗代谢物耐药性可被用作选择的基础:对于化打，其赋予甲氧节氨喀晚和氨甲蝶岭耐 药性;gpt，其赋予霉酪酸耐药性;neo，其赋予氨基糖巧G418耐药性;和hygro，其赋予潮霉素 耐药性。
[0160] 核酸 本发明可包括编码本发明的蛋白质、多肤、肤的重组多核巧酸，例如编码抗原肤的多核 巧酸。
[0161] 在特别的实施方式中，本发明设及分离的核酸片段W及含有编码自身抗原和/或 MHC分子的核酸序列的重组载体。术语"重组"可与多肤或具体多肤的名称结合施用，它通常 是指由核酸分子产生的多肤，该核酸分子在体外被操作或者是运种分子的复制产物。
[0162] 用在本发明中的核酸片段，无论编码序列本身的长度如何，都可与其他核酸序列 结合，因而它们的总体长度可有很大变化，所述其他核酸序列例如是启动子、多腺巧酸化信 号、其他限制酶切位点、多克隆位点、其他编码片段等。因此，本发明预期可使用几乎任何长 度的核酸片段，总长度优选受限于制备的容易程度W及在预期重组核酸方案中的用途。在 一些情况下，核酸序列可与其他异源编码序列一起编码多肤，从而例如可纯化出多肤、运 输、分泌、翻译后修饰，或用于实现治疗利益(例如祀定或功效）。标签或其他异源多肤可被 添加至经改性的多肤编码序列，其中"异源的"是指不与经改性的多肤相同的多肤。
[0163] 药物组合物和施用 本发明提供用于治疗疾病的药物组合物。
[0164] 药物组合物 抗原纳米颗粒复合物可W被单独地施用或与组合物中的载体(例如药学上可接受 的载体)联合施用。本发明的组合物可通过注射而不经肠道地常规施用，例如静脉内、皮下 或肌内注射。适合其他施用模式的其他制剂包括口服制剂。口服制剂包括那些通常使用的 赋形剂，例如药学等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸儀、糖精钢、纤维素、碳酸儀等。运些组 合物的形式有溶液、悬浮液、片剂、药片、胶囊、缓释制剂或粉末，并且含有约10%至约95%的 活性组分，优选为约25%至约70%。含有改变对象的免疫状态的抗原-MHC-纳米颗粒复合物的 水性组合物的制备，根据本发明公开的内容，对于本领域技术人员将是熟知的。在某些实施 方式中，组合物可被吸入(例如，美国专利6,651，655号，通过引用将其全部内容合并至本文 中）。在一个实施方式中，抗原-MHC-纳米颗粒复合物被全身性施用。
[0165] 通常，本发明的组合物W与给药制剂相容的方式施用，并且施用的量使得是治疗 上有效的和免疫上改变的。施用的量取决于要被治疗的对象。需要施用的活性组分的精确 的量取决于操作者的判断。但是，合适的剂量范围是每次施用给予十至几百纳克或微克的 级别的抗原-MHC-纳米颗粒复合物。合适的初始施用和加强方案也是变化的，但是典型的是 先进行初始施用，接下来进行后续施用。
[0166] 在许多情况下，期望的是多次施用肤-MHC-纳米颗粒复合物，约、至多约或至少约 3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用间隔时间通常为2天至十二周，更常见的是一至两周间 隔。间隔0.25-5年(通常2年)的周期性加强对于维持免疫系统的状态是合乎需要的。施用过 程之后可进行发炎免疫响应实验和/或自身调节抗炎T细胞活性实验。
[0167] 在一些实施方式中，药物组合物被施用至对象。本发明的不同方面设及向对象施 用有效量的抗原-MHC-纳米颗粒复合物组合物。此外，运种组合物可与免疫系统的调节剂结 合施用。运种组合物通常被溶解于或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。
[0168] 术语"药学上可接受的"或"药理学上可接受的"是指当施用至动物或人时不会产 生负面的、过敏性的或其他不良反应的分子实体和成分。如本文所使用的，"药学上可接受 的载体"包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂 等。运些介质和试剂用于药学上有活性的物质的用途在本领域是熟知的。除非任何常规介 质或试剂不与活性成分相容，预期其可用于免疫原性组合物和治疗性组合物中。
[0169] 合适注射应用的药物形式包括无菌水溶液或分散体;制剂，包括芝麻油、花生油或 水性丙二醇；W及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。无论如何，该药物形式 都必须是无菌的，并且必须是流体从而它能够容易注射。它还应当在制造和存储条件下是 稳定的，并且被保存得不受微生物(例如细菌和真菌)的污染。
[0170] 组合物可被配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐（与蛋白 质的游离氨基酸一起形成），它们是用无机酸形成的，无机酸例如是盐酸、憐酸，或是用有机 酸形成，例如是乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。W游离簇酸基形成的盐也可衍生自无机碱， 例如氨氧化钢、氨氧化钟、氨氧化锭、氨氧化巧或氨氧化铁，或衍生自有机碱，例如是异丙 胺、Ξ甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
[0171] 载体可为含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、乙二醇和液态聚乙二醇等）、它们 的合适的混合物W及植物油的溶剂或分散介质。例如，可利用涂层(例如卵憐脂）、如果是分 散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸、W及通过利用表面活性剂，可维持合适的流动性。 可通过各种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对径基苯甲酸醋类、氯代下醇、苯 酪、山梨酸、硫隶撒等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钢。使用试剂延迟吸 收成分，例如单硬脂酸侣和明胶，可为注射组合物带来延长的吸收效果。
[0172] 无菌注射溶液通过将所需量的活性化合物加入具有各种其他W上所列成分(按需 要）的合适溶剂中，随后灭菌而制备。溶液的灭菌方式不应减少抗原-MHC-纳米颗粒复合物 的治疗性质。通常，分散体通过将各种灭菌的活性组分加入到无菌载体中而制备，所述无菌 载体含有碱性分散介质W及所需的来自W上列出的其他组分。如果是利用无菌粉末来制备 无菌注射液，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生了活性组分的W及来自 之前灭菌溶液的任何额外的期望组分的粉末。溶液灭菌的一种运样的方法是无菌过滤，但 是，本发明意在包括不显著降低抗原-MHC-纳米颗粒复合物的治疗性质的任何灭菌方法。设 及高热高压的灭菌方法(例如高压蒸汽灭菌法)可能会损害复合物的Ξ级结构，因而显著降 低抗原-MHC-纳米颗粒复合物的治疗性质。
[0173] 治疗组合物的有效量是基于预期的目的而确定的。术语"单位剂量"或"剂量"是指 适合用于对象的物理上分散的单元，每个单元含有预定量的组合物，该预定量被计算出来 W产生W上关于其施用所述的期望响应，即，合适的施用途径和方案。施用的量(根据治疗 次数和单位剂量)取决于期望的结果和/或保护。组合物的精确的量还取决于医师的判断并 且对于每个个体都是特有的。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、施用途径、预期 的治疗目的(减轻症状或治愈）W及特定组合物的效力、稳定性和毒性。配制后，溶液将W与 剂量制剂相容的方式施用，并且施用的量使得其是治疗上或预防上有效的。制剂可容易W 各种剂量形式施用，例如上述的注射液的类型。
[0174] 联合疗法 本发明的组合物和相关方法(特别是抗原-MHC-纳米颗粒复合物的施用)也可与传统疗 法的施用结合进行。运些疗法包括但不限于阿沃纳斯（Avonex，干扰素 β-la)、倍泰龙 (Be1:ase;ron，干扰素 β-化）、克帕松（Copaxone，醋酸格拉替雷）、诺安托(No vantrone，米托蔥 酿）、利比（Rebif，干扰素 i3-la)、Tysabri (那他珠单抗）、Gilenya(芬戈莫德）、格拉默 (Glatiramer)、类固醇、环憐酷胺、依木兰（Imuran)、己氯芬（Baclofen)、深部脑刺激， Ampy ra (达伐化晚）、针灸和物理治疗。
[0175] 当使用联合疗法时，可使用各种组合，例如抗原-M肥-纳米颗粒复合物施用是"A"， 其他试剂是"B":
[0176] 本发明的肤-MHC-复合物组合物向患者/对象的施用，会根据运类化合物的一般性 施用方案进行，并考虑毒性（如有）。预期的是，如果需要的话，会重复治疗循环。还预期的 是，各种标准疗法(例如水合)可与所述疗法结合施用。
[0177] 体外或间接体内施用 本文使用的术语体外施用是指在从患者移出或在患者体外的细胞上进行的操作，包括 但不限于培养物中的细胞。术语间接体内施用是指已在体外被操作并随后施用给对象的细 胞。术语体内施用包括所有在对象体内进行的操作(包括施用）。
[0178] 在本发明的某些方面，所述组合物可被体外、间接体内或体内施用。在某些体外实 施方式中，自体T细胞被与本发明的组合物一起培养。该细胞或组织随后可被用于体外分析 或间接体内施用。
[0179] 实施例 w下实施例是为解释本发明的各种实施方式而给出，并不w任何方式限制本发明。本 领域技术人员会容易意识到，本发明易于被改造而实现所提及的目的并获得所提及的优 势，W及可从本文隐含得到的其他目的和优势。运些实施例W及所述方法是实施方式的当 前代表，并且是示例性的，并不用于限制本发明的范围。对于本领域技术人员来说，可对运 些实施例做出变化并且可将其用于其他用途，但运些都属于权利要求的范围定义出的本发 明的实质。
[0180] 实施例1. pMHC纳米颗粒的制备和分析 pM肥制造 使用了两种不同的方法来表达重组的I类pMHC复合物。第一种方法设及在存在肤的情 况下重新折叠在细菌中表达的I类MHC重链和轻链，然后通过凝胶过滤和离子交换层析进行 纯化，如（Garboczi, D.N. et al. (1992) Proc Natl. Acad Sci USA 89:3429-3433; Altman, J.D. et al. (1996) Science 274:94-96)所述。第二种方法设及作为单链构建 体在慢病毒转导的freestyle C册细胞中W高收率表达I类MHC复合物，其中通过柔性的GS 接头(Yu, Y.Y. et al. (2002) J Immunol 168:3145-3149)、编码BirA位点游离的切S 结束的6x化S标签)的簇基末端接头依次连接编码肤的序列、I类MHC轻链和重链。使用儀柱 和阴离子交换色谱从培养基上清液纯化分泌的蛋白，并将其直接用于NP涂布或对其生物素 化，W使用巧光染料结合的的链霉制造 pMHC四聚体。如通过流式细胞仪测定的，使用代表性 单链pMHC复合物(其编码IGRP206-214自身抗原肤或其模拟物NRP-V7)制造的四聚体高效地结 合至同源的单克隆自身反应性CD8+ T-细胞，但是不结合至它们的多克隆副本(未示出）。
[0181] 最初从使用构建物转染的果蛹SC2细胞纯化重组的II类pMHC单体，所述构建物编 码分别带有C-化η或c-Fos亮氨酸拉链的Ι-Αβ和Ι-Αα链、W及前述的BirA和6扯is标签 (Stratmann, T. et al. (2000) J Immunol 165:3214-3225, Stratmann, T. et al. (2003) J. Clin. Invest. 112:3214-3225)。因为该方法的收率通常较低并且耗时，申请 人开发了在freestyle 010细胞中的表达系统，该(?0细胞使用编码单顺反子信息的慢病毒 转染，其中复合物的肤-ΙΑβ和ΙΑα链被核糖体跳越P2A序列分开（Holst, J. et al. (2006)化t Protoc 1:406-417)。如前述的单链I类pMHC构建体一样，将编码BirA位点、 6xHis标签和游离的切S的接头加入至构建体的簇基末端。先后通过儀层析阴离子交换从细 胞培养物上清液分离自组装的II类复合物，并将其用于涂布在NP上或进行处理W用于 生物素化和四聚体形成。如通过流式细胞仪测定的，使用编码2.5mi自身抗原肤的代表性II 类pMHC复合物生成的II类pMHC四聚体特别地并且有效地被同源的单克隆自身反应性CD4 + T细胞结合。
[0182] 四聚体染色 使用所述的生物素化的pMHC单体制备结合有PE的TUM-H-2Kd、NRP-V7-H-2Kd、 IGRP2〇6-2i4-H-2Kd、肥Li4-22/IAg7和抓C2.5mVlAg7四聚体（Stratmann, T. et al. (2000) J Immunol 165:3214-3225; Stratmann, T. et al. (2003) J. Clin. Invest. 112:3214- 3225; Amrani, A. et al. (2000) NaUire 406:739-742)。在4°(：下在。4〔5缓冲液（在口88 中的0.1%叠氮化钢和1% FBS)中使用四聚体(5 ug/mL)对外周血单核细胞、脾细胞和淋己结 CD8+或CD4 + T细胞进行染色1小时，洗涂，并在4°C下使用结合有FITC的抗CD8a或抗CD4 (5 pg/mL)和结合有化rCP的抗B220(2 pg/mL作为"哑（dumb)"n)培育30分钟。将细胞进行洗 涂，固定在1% PFA/PBS中并用FACS分析。
[0183] 合成 如前所述地使用巧樣酸钢化学还原氯化金来合成金纳米颗粒化NP)^errault，S.D. et al. (2009) Nano Lett 9:1909-1915)。简单来说，在剧烈的揽拌之下将2 mL的1%的 HAuCU (Sigma Aldrich)加入至100 mL此0,并在油浴中加热溶液。将6 mL(对于14 nm GNP)或2 mL(对于40皿GNP)的1%巧樣酸钢加入至煮沸的HAu(n4溶液，将其额外揽拌10分 钟，然后冷却至室溫。通过加入1 uMo 1的使用-C00H或-NH2基团功能化的琉基-PEG接头 (Nanocs，M)(表1和表2)使GNP稳定化W作为pM肥的受体。用水洗涂聚乙二醇化的GNPW除 去游离的琉基-PEG,浓缩，并储存于水中W用于进一步的分析。通过分光光度法并根据比尔 定律(Beer's law)计算NP密度。
[0184] 通过在存在表面活性剂的情况下在有机溶剂中乙酸铁的热分解，制造 SFP系列氧 化铁NP(SFP I0NP)，然后通过聚乙二醇化使溶剂在水性缓冲液中。简单来说，将2 mMol Fe (acac)3 (Sigma Al化ich, Oakville, ON)溶解在10 mL苄基酸和油胺的混合物中，并加热 至100°C持续1小时，然后在300°C加热2小时，同时在氮气层的保护下回流。通过加入乙醇沉 淀出合成的NP，并重悬于已烧中。为了I0NP的聚乙二醇化，将100 mg不同的3.5 kDa DPA- 阳G接头（表1中的Sl-S5;Jenkem Tech USA)溶解在CHCI3和HC0N(C出）2 (DMF)的混合物中。 然后将NP溶液(20 mg Fe)加入至DPA-PEG溶液并在室溫下揽拌4小时。通过加入已烧过夜沉 淀出聚乙二醇化的SFP NP，然后重悬于水中。通过高速离屯、（20，000 xg，30 min)除去微量 的聚集体，并将单分散的SFP NP储存在水中W用于进一步的表征和pMHC结合。通过在2N Η化中在A410的分光光度法测定10NP产物中铁的浓度。根据SFP NP的分子结构和直径 (Fe3〇4;直径8±1 nm) (Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al. (2006)化reAppl.Chem.78:1003-1014)，
【申请人】估计，含有lmg铁的SFP溶液含有5xl0l4个NP。
[0185]
【申请人】随后开发了新的lONP设计，该设计使得能够在完全没有表面活性剂的情况 下，同样通过热分解，但是在一个步骤中，形成聚乙二醇化的I〇NP(PF系列I0NP)。在该新颖 的设计中，PEG分子同时被用作还原剂和表面活性剂。在典型的反应中，在100°C下将3 g 阳G (2 kDa)缓慢地融化在50血圆底烧瓶中，然后与7 mL的苄基酸和2 mMol Fe(acac)3混 合。剧烈地揽拌反应1小时，然后伴随着回流加热至260°C持续额外的2小时。将反应混合物 冷却至室溫，转移至离屯、管并与30 mL水混合。通过在2, OOOxg离屯、30分子，除去不溶性物 质。通过穿过Amicon-15过滤器(MWC0 100 kDa, Millipore, Billerica, MA)的超滤，除去 游离的PEG分子。
【申请人】能够产生I0NP，其中尽管不是所有的PEG分子都进行了测试，但测试 了大部分的PEG分子(表1，P1-P5)dI0NP的尺寸根据在热分解反应中使用的PEG接头的官能 团（表1和2)而变化。可W使用磁性(MACS)柱(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)或IMag细胞 分离系统（BD BioSciences, Mississauga, ON)容易地纯化NP。在室溫下或在4°C下将纯化 的I0NP储存在水中或各种缓冲液(pH 5-10)中，其中检测不到任何聚集体。如上用于SFP NP 的描述地计算NP密度。
[0186] 的 pMHC 结合 通过在存在1-乙基-3- [3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)的情况下酷胺键的形 成，实现将pMHC结合至用带有远端-N此或C00H基团的阳G接头制造的NP。首先将带有-C00H 基团的NP (GNP-C、SFP-C和PF-C，表2)溶解在20 ml MES缓冲液(pH 5.5)中。将N-径基硫代 班巧酷亚胺（横基-NHS，Thermo scientific,Waltham,ΜΑ，终浓度 10 mM)和抓C(Thermo scientific, Waltham, M，终浓度1 mM)加入至NP溶液。在室溫下揽拌20分钟之后，将NP溶液 逐滴加入至含有溶解在20 mM棚酸盐缓冲液(pH 8.2)中的pMHC单体的溶液。将混合物揽拌 额外的4小时。为了将pM肥结合至N出-功能化的NP(GNP-N、SFP-N和PF-N，表2)，首先将pMHC 复合物溶解在20 mM MES缓冲液(pH 5.5,含有100 ml化Cl)中。然后将横基-N服（10 ml)和 抓C (5 mM)加入至pMHC溶液。然后将活化的pMHC分子加入至在20 mM棚酸盐缓冲液（pH 8.2)中的NP溶液，并在室溫下揽拌4小时。
[0187] 为了将pMHC结合至马来酷亚胺-功能化的NP(SFP-M和PF-M,表巧日图1C)，首先在 室溫下通过Ξ下基麟(TBP, 1 ml)解育pMHC分子4小时。然后将被工程化W编码自由的簇基 末端Cys残基的pMHC与在40 mM憐酸盐缓冲液（pH 6.0,含有2 mM EDTA)中的NPU50 mM 化Cl混合，并在室溫下解育过夜。通过马来酷亚胺基团和切S残基之间形成的碳-硫键共价 地将pM肥与NP结合。
[0188] 使用点击化学来将pMHC或亲和素结合至通过酷胺基团功能化的NP( SFP-Z，表2)。 对于该反应，首先通过二苯并环辛締（dibenzoc^yclooctyl , DBC0, Click畑emistiT Tools, Scottdale，AZ)试剂在室溫下解育pMHC或亲和素分子2小时。通过过夜透析除去游 离的DBC0分子。然后通过SFP-Z解育pMHC-DBCO或亲和素-DBC0结合体2小时，导致形成pMHC 或亲和素分子与NP之间的Ξ挫键。
[0189] 通过大量的透析（针对PBS，pH 7.4,在4°C穿过300 kDa分子量截止膜（Spectrum 1 abS ))，除去在不同的pMHC-NP结合反应中未结合的pMHC复合物。替代地，通过磁力分离纯 化结合有pM肥的I0NP。通过穿过Amicon叫tra-15单元（100 W)a MWC0)的超滤，浓缩结合的 NP，并储存在PBS中。
[0190]电子显微镜、动态光散射、DLS和小角度电子束衍射 首先通过透射电子显微镜(TEM, Hitachi H7650)估算未结合的和结合有pM肥的NP的 核尺寸和分散度。使用动态光散射(DLS)来确定pMHC-NP的流体力学尺寸、zeta电位和单分 散性，其中使用Ze化Sizer仪器（Malvern, UK)。使用小角度电子束衍射(SE抓)评估NP的PF 系列的氧化铁核屯、的化学性质。
[0191] 傅里叶变换红外光谱 使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)评估PF系列I0NP设计的表面化学性质。使用ATR(衰减 全反射)模式上的Nicolet FTIR分光光度计，得到错定在PF-NP表面的对照阳G和阳G的FTIR 光谱。在4 cm-i光谱分辨率、平均256次扫描，记录每个光谱。识别PEG骨架C-0-C基团及其远 端pMHC-受体官能团的伸缩振动特征。
[0192] 琼脂糖凝胶电泳 为了快速评估NP电荷随着聚乙二醇化或pMHC涂层的变化，将NP在0.8%琼脂糖凝胶上进 行电泳。根据整体表面电荷，聚乙二醇化的NP迁移到负极或正极。进行考马斯亮蓝染色来确 认NP和pMHC的共同迁移。
[0193] 天然和变性的聚丙締酷胺凝胶电泳 将结合有pMHC的NP进行天然-PAGE (10%)和SDS-PAGE (12%)分析，W确认在pMHC-NP制 剂中不存在游离的(未结合的)pM肥，并确认在NP的表面上存在完整的Ξ分子pM肥复合物。
[0194] 效价测量 为了评估结合至单个NP上的pMffi：单体的数量(pMffi：效价），我们使用不同的方法测量了 pMHC-NP制剂的pM肥浓度，运些方法包括化a壯ord测定(Thermo Scientific)、氨基酸分析 (在水解的pMHC-NP制剂中17个不同的氨基酸的基于HPLC的量化）（化iversity of Toronto )、通过质谱W及转换为pM肥分子数量和NP数量的比例的值进行的斑点化ISA和签 名肤分析。简单来说，在"斑点化ISA"方法中，依次将结合了pMHC的NP和未结合的NPW及 pMHC单体溶液（作为标准）稀释在PBS中，然后吸收至在多孔过滤板中的PVDF膜（PALL Corporation)。使该平板在室溫下部分干燥，然后使用pMHC特异性一级抗体（即，用于涂布 有I类pMHC的NP的抗-β2Μ和抗-Kd抗体，2M2和SF1-1.1 克隆，BioLegend, San Diego, CA) 解育，然后使用结合有皿P或AP的二级抗体解育。在进行酶显色反应时，将孔的内容物转移 至常规的化ISA板的孔中，然后使用平板读数仪在450 nm测量它们的吸收。对于签名肤质谱 方法，通过质谱鉴别pMHC特异性的膜蛋白酶肤(对于Kd复合物，签名肤为TWTAADTAAUTR，对 于Ι-Α?7复合物，签名肤为AQNSELASTA匪LR)。使用稳定同位素（AQUA肤合成，Sigma A1化ich)标记对应的合成肤。然后将同位素标记的肤依次稀释至既定的浓度，然后和结合 有pMHC的NP混合W用于膜酶消化。将该混合物进行质谱(Agilent QT0F6520)W量化标记有 同位素的签名肤与未标记的签名肤的比例，其作为pMHC浓度的读出。因为由运些不同的方 法生成的值是相似的，出于简单和方便，所W化a壯ord测定(使用未结合的NP作为空白）成 为所选的方法。
[01M] 体外pMHC-NP的激动活性 在37° C下使用连续稀释的结合了pMHC的NP或对照NP解育来自TCR-TG小鼠的FACS分选 的脾CD8 +细胞(2.5 xlO5个细胞/mL)24-48小时。通过化ISA检测上清液的WN 丫。用1 mCi 的[3H]-胸巧对培养的细胞进行脉冲，在24小时之后收割W测量[3扣结合。
[0196] 治疗 使用在PBS中的涂布有pMHC的NP静脉注射一组10周龄的雌性NOD小鼠，每周两次并持续 5周（总共10次剂量）。通过所述的流式细胞仪（Tsai, S. et al. (2010) Immunity 32: 568-580) (W及Clemente-hsares et al., submitted)评估血、脾、淋己结和/或骨髓中 四聚体+ CD8+或CD4+ T-细胞群的尺寸的增加 W及它们的表型特征。在其他实验中，使用 pMHC-NP每周两次地静脉注射显示出血糖水平〉11 ml 2天的小鼠，并监控血糖升高，直至血 糖正常稳定(4周）。每日评估动物的糖尿，并在3+时皮下注射给予人膜岛素低精蛋白（每日1 IU)。
[0197] 统计分析 通过双尾5化(16]11:'8 1:,]\1日]1]1-胖11；[1：]167 1],化;[-5911日'6或双向4側￥4测试比较数据。统 计学显著性假设P < 0.05。
[019引小鼠 NOD/Lt小鼠来自化ckson Lab (Bar Harbor, ME). 17.4日/8.3 (8.3-N0D), 17.6α/ 8.3α(17.6-N0D)，抓C2-5-N0D小鼠已经有描述化atz，J.D.etal.α993)Cell74: 1089-1100; Verdaguer, J. et al. (1997) J E邱 Med 186:1663-1676; Han, B. et al. (2005) J Clin Invest 115:1879-1887)。
[0199] 实施例2. TID-相关的II类pM肥的制造 在真核细胞(S2或(?Ο细胞)中制造几种不同的TID相关和不相关(即阴性对照)的肤/Ι? α?7 复合物。使用由运些单体制剂产生的四聚体的研究证实了运些单体作为正确地折叠的 pMffi：复合物被分泌进上清液。图2提供了例子。
[0200] 通过使用T1D相关的II类pMHC-NP进行处理的NOD小鼠中的高血糖的逆转 使用7.5 yg的涂布了 II类pMHC的NP每周两次地处理糖尿病NOD小鼠。在正常血糖4周 时，认为小鼠被治愈，在该点停止处理。如图3所示，虽然在90-100%的小鼠（n=29只小鼠）中 2.5mi/I-Ag7-、IGRPi28-i45/I-Ag7-和IGRP4-22/I-Ag7-NP逆转了 高血糖，但是使用皿L14-22/I- AW-NP(-种外来pMHC)的处理没有效果。在停止处理之后>30周的被治愈的小鼠中的腹腔葡 萄糖耐量试验（IPGTT)得出的曲线，与年龄匹配的非糖尿病的未处理的对照非常相似，并且 和在未经处理的急性糖尿病NOD小鼠中得到的曲线显著不同（图4)。因此，涂布有T1D相关的 II类pMHC的NP在糖尿病小鼠中恢复了葡萄糖稳态。
[0201] 相关的II类pMHC-NP扩增同源记忆TR1自身调节性CD4+ T细胞 与对糖尿病发病或年龄匹配的非糖尿病的未处理的动物的研究相比，通过使用2.5mi/ I-AsLnP进行处理的已经血糖正常的50周龄糖尿病小鼠的血、脾、膜淋己结(PLN)、肠系膜淋 己结(MLN)和骨髓的研究，显示了 2.5mi/I-Ag7四聚体+ CD4+细胞的百分比显著升高（图5)。 CD4+ T-细胞扩增是抗原特异性的（图5)。扩增的节奏、大小和分布与被测试的Ξ种T1D相关 的II类pMHC-NP相似（图6)。在所有运些群体中的NP扩增的四聚体+细胞对比四聚体+细胞的 表型分析显示了记忆样TR1表型（图7,上），其具有近期描述(Gagliani，N. et al. (2013) Nature Medicine 19:739-746) (FIG. 7，bottom)的 TRl-特异性标记物的共表达： CD62i?/CD44high/ ic〇s7CD257FoxP37表面TG邱7 CD49bVLAG3+。在表达化xP3启动子- eGFP的NOD小鼠中，确认了运些细胞不是化xP3+，其中所有pMHC-NP-扩增的细胞都是eGFP- 阴性的(未示出）。
[0202] 与运些表型数据一致，从经pMHC-NP处理的小鼠分选的四聚体+ CD4+细胞，通过几 乎完全分泌IL-10并且较低程度地分泌IFN 丫，对同源肤脉冲的DC进行响应（图8W及未示出 的）。重要地，来自经pMHC-NP处理的供体的纯化的CD4+而非CD8+ T细胞抑制NOD中的T1D。 使用II类pMHC-NP处理转移有糖尿病性脾的scid小鼠和的宿主被100%保护>100天（未示 出）。
[0203] 与其四聚体副本不同，运些II类pMHC-NP扩增的四聚体+细胞抑制非同源T细胞向 肤脉冲的DC繁殖(提呈由响应子和四聚体+ TR1细胞祀定的肤）。相对于接收抗-IFN 丫或鼠 - IgG(未示出）的培养物，向培养物加入抗-IL10或抗-TGF0 mAb，部分地阻止了该抑制。最重 要地，使用IGRP4-22或2.5mi/I-Ag7-NP和阻断的抗-化-10、抗-TG邱或抗-IFN 丫 mAb或鼠 - IgG处理的糖尿病小鼠的研究（图9)显示，通过II类pMHC-NP的正常血糖的恢复需要IL-10和 TG邱但不需要IFN 丫。但是，在自发性糖尿病NOD. 111〇-/--和NOD. Ifng-/-小鼠中的研究显示， 比-10和IFN 丫的表达对于响应于II类pMHC-NP而扩增的TR1细胞的发展来说是必须的；在运 些小鼠中，pMHC-NP治疗扩增了Th2样细胞（NOD. Ifng-/-)或IFN 丫 +/化-47lLl〇-细胞 (NOD. 11小鼠）。在糖尿病IGRP-/- NOD小鼠（不能诱导(prime)IGRP-反应性T细胞）中的 研究显示，运些小鼠不响应IGRP4-22/I-As7-NP(没有T细胞扩增或正常血糖的恢复)是因为运 些小鼠缺少被诱导163?4-22的细胞。相反地，使用2.5111^1-487-肥处理的所有糖尿病161?口 N孤小鼠都被治愈(未示出）。所W，与I类pMHC-NP相似，Π 类pMHC-NP通过扩增疾病诱导的调 节记忆而发挥作用，但是不能重新开始（de novo)诱导运些响应，因为它们缺少共刺激信 号。
[0204] 最后，使用牛痘病毒(rW)的研究显示，通过II类pM肥-NP处理的NOD小鼠能够容易 地清除急性病毒感染(图10A)。与此一致，被处理的小鼠能够对助剂中的模型抗原产生抗体 反应(图10B)。
[02化]实施例3.单特异性II类pMHC-NP减少EAE的严重程度。
[0206]
【申请人】然后测试了基于II类pMHC-NP的纳米药物在实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)中的治疗潜力。该模型被用在尽可能严格的测试中：从而研究相对于防止或阻断EAE 的发展，pMHC-NP是否能够逆转已经建立的EAE。运并非小问题。EAE中的介入的近期综述表 明，超过400次研究的<1%在EAE诱导之后的21日开始治疗化olst，J. et al. (2006)化t Protoc 1:406-417);报道的数据是在小鼠中获得的，其中在EAE诱导之后21日开始治疗，并 且被改善的疾病W剂量依赖的方式来打分(图11)。
[0207] 实施例4.涂布有II类pMHC的NP的合成和质量控制
【申请人】开发了最佳的氧化铁NP设计，它不采用表面活性剂来进行合成，并且得到高度 稳定的、单分散的制剂，它能够W最佳的pMHC负载进行装载。虽然可W使用数种不同的pMHC 涂布化学方法（图12A)，但是
【申请人】经常使用通过结合了马来酷亚胺的PEG来功能化的NP， 它接收高效价的pMHC(高达多于60个pMHC/NP)，运些pMHC被工程化来编码在其簇基末端的 游离的Cys。通过数种质量控制检查来处理运些II类pMHC-NP，W确定每个NP的pMHC效价(斑 点化ISA、氨基酸分析）、NP密度、NP电荷和NP尺寸(如由??Μ确定的金属核；W及如通过动态 光散射(DLS)确定的流体动力学直径）。图12B示出了代表性的TEM图像，图12C示出了未涂布 pMHC的NP和涂布了pMHC的NP的DLS图。典型的剂量方案设及每次剂量施用1-50 yg的总pMHC (涂布NP)(约2 uL的制剂稀释在100 uL的PBS中）。
[020引实施例5.使用涂布了II类pMHC的NP进行治疗 上述数据与
【申请人】先前在使用I类pMHC-NP治疗的小鼠中得到的数据一致：II类pMHC- NP扩增同源的记忆调节T细胞(在该实施例中为TR1)，运些T细胞通过局部的装载了自身抗 原的AP巧Φ制其他自身抗原肤的提呈(Amrani, A. et al. (2000) NaUire 406:739-742)。
[0209] 已经报道，人类TRl CD4+ Τ细胞克隆杀死专业的APC的一些亚型（例如树突状细 胞KAmrani, A. et al. (2000)化Uire 406:739-742)。因此，
【申请人】研究了响应于II类 MHC-NP治疗而扩增的抗原特异性TR1细胞是否通过杀死装载了自身抗原的APC而抑制自身 免疫。通过将经2.5mi或GPI肤脉冲并且标记有PK肥6(经2.5mi脉冲的DC)或CF沈(经GPI脉冲 的DC)的DC的1:1混合物灌注进在之前5周内已经接受了 10次剂量的2.5mVlAg7-NP的NOD小 鼠或没有接受任何处理的NOD小鼠，来进行W上研究。7天后杀死宿主，W比较在两种不同的 宿主中PKH26+细胞与CFSE+细胞的比例。如图13A所示(上部），没有观察到任何差异，运表明 响应于pMHC-NP治疗而扩增的TR1 CD4+ T-细胞不杀死表达抗原的DC。
[0210] 为了研究运是所用的APC类型(一种DC)的特性还是其他APC类型的一般特征，重复 W上实验，但是相对于DC，使用脾B细胞。出乎意料地，
【申请人】发现，经2.5mi脉冲的B细胞的 数量在已经使用涂布了 2.5mi/IAg7-NP的NP处理的宿主中扩增(而非减少）（图13A，下部）。运 是意料之外的，因为根据本领域的现有技术，预期的是相反的结果(与其经GPI脉冲的副本 相比，经2.5mi脉冲的B细胞选择性和特异性地减少）。
[02川然后通过比较经2.5mi/IAg7-NP处理的小鼠与未经处理的对照的膜腺癌(PLN)和肠 系膜(MLN)淋己结中的B细胞的绝对数量和百分比，
【申请人】查明了是否能够报导II类pMHC- NP处理的运种B细胞扩增效果。如图13B所示，经II类pMHC-NP处理的NOD小鼠的化N中的B细 胞的百分比显著增加，但在MLN中缺没有。在未经处理的NOD小鼠中没有观察到PLN与MLN的 运些差异，运表明，运些效果是pMHC-NP治疗的结果。可W注意到，在单个小鼠的化N中的 2.5mi-特异性的TR1 CD4+ T-细胞的频率和PLN相关的B细胞的频率之间存在统计学上显著 的相关性，运表明，经pMHC-NP处理的NOD小鼠的B细胞向化N的招募的增加，是由响应于MHC- NP治疗而扩增的2.5mi-特异性TR1 CD4+ T细胞驱动的。
[0212] 总体上，运些数据提出了运样的可能性，即响应于Μ肥-NP治疗而扩增的B细胞可能 是Β调节细胞，它是获得了响应于与被pMHC-NP扩增的TR1 CD4+ Τ细胞的同源相互作用而产 生IL-10的能力的B细胞。运种情况假定，2.5mi-特异性TR1 CD4+ T细胞诱导未分化的嗜铭 粒蛋白A-特异性B细胞(嗜铭粒蛋白A是2.5mi表位的天然抗原来源）向产生化-10的化eg细 胞的分化和扩增，所述特异性B细胞已经捕获了嗜铭粒蛋白A并因此在其表面上提呈对应的 2.5mi/IAg7 pMHC复合物。
[0213] 为了检验该假设，
【申请人】将来自一株NOD小m其两个IL10基因位点中的一个携带 在终止密码子和外显子5的多聚腺巧酸化信号（11)之间的异种基因包IRES-eGFP的定向插 入）的经2.5mi脉冲的或经GPI脉冲的B细胞(标记有PKH26)灌注进经2.5mi/IAg7-NP处理的 NOD宿主或未经处理的NOD宿主。
[0214] 在转移之后屯天，测定了宿主中供体PKH26+ B-细胞的流式细胞仪表型（图13C，上 部面板）。如图13C所示（中部和下部面板），相当一部分的供体B细胞表达编码IL10的eGFP并 且CD5+和CDld都高。运是化eg细胞的Ξ个关键的标记物（Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al. (2006)化re Appl. Chem. 78:1003-1014)。运仅在经 2.5mi脉冲的Β细胞中观察到，而在经阴性对照肤(GPI)脉冲的Β细胞中观察不到，并且仅在 经pMHC-NP处理的小鼠中发生。重要地，该效果是（至少部分是）由化-10 pMHC-NP-扩增的 TR1 CD4+ T细胞介导的，因为在缺乏IL-10的NOD宿主中观察不到运种响应。
[0215]综上所述，运些数据证明了，II类pMHC-NP治疗诱导抗原特异性的B细胞分化和扩 增为B调节细胞。
[0216] 显示了具有调节特性的B淋己细胞的存在的数据的描述可W在追溯到1974年的文 献中找到。与响应于II类pMHC-NP治疗而扩增的TR1 CD4+ T细胞相似，Breg细胞表达免疫抑 制性细胞因子，其包括IL-10和TGFb，W及能够通过同源的、由II类pM肥驱动的细胞间相互 作用并W抗原依赖性和高度特异性的方式抑制致病的自身反应性T细胞和B细胞的其他分 子（Xu, C. et al. (2007) Polymer International 56:821-826)。虽然已经显示了不同 的刺激能够在体外W及在小得多的程度上在体内诱导Breg形成，但是尽
【申请人】所知，目前 没有治疗方法能够在体内诱导和扩增抗原特异性的化eg细胞。通过诱导高度疾病特异性的 TR1 CD4+ T-细胞，
【申请人】证明了基于II类pMHC的纳米药物也诱导疾病特异性的化eg细胞。 因为化eg细胞也能促进效应子分化为TR1 CD4+ T-细胞，基于II类pMHC的纳米药物释放深 厚和持久的免疫抑制性反应，该反应是高度抗原特异性的并因此能够选择性地抑制自身免 疫反应而不损害全身免疫。
[0217] 实施例6.通过乙酷丙酬铁的热分解及其生物结合而合成表面功能化的氧化铁纳 米颗粒 烙化PEG。加入苄基酸和乙酷丙酬铁。在105°切日热1小时之后，将溫度升高至260?并回 流。约2小时之后，铁纳米颗粒形成并且溶液的颜色变黑。将反应冷却至室溫并加入一些水 来从反应容器提取纳米颗粒。通过Miltenyi Biotec LS磁性柱纯化纳米颗粒。在6.2-6.5的 缓冲pH(0.15M化α和2mM抓TA)下加入蛋白质和铁纳米颗粒，在室溫下揽拌12-14小时，并 通过Miltenyi Biotec LS磁性柱纯化结合了蛋白质的颗粒，从而制备氧化铁纳米颗粒蛋白 质结合物。
[0218] 要理解的是，虽然本发明已通过优选实施方式和任选的特征进行具体公开，但本 领域技术人员可想象到对所具体描述的发明做出修改、改进和变化，并且运些修改、改进和 变化被认为是在本发明的范围之内。本文提供的材料、方法和实施例是优选实施方式的代 表，是示例性的，并且并非意在限制本发明的范围。
[0219] 本发明已在本文进行宽泛和概括性的描述。落入所公开的上位概念的较窄的种类 和下位群体也构成本发明的一部分。运包括对本发明进行一般性描述，但设定前提或消极 限制W从种类物中移除任何主题内容，而不论陪排除的内容是否明确地在本文提及。
[0220] 此外，当W马库什群组的形式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员会意 识到，本发明也据此W该马库什群组的任何单个成员或成员的子群组的形式描述。
[0221] 权利要求中使用的术语"或"，除非另有明确说明仅指择一方案或运些替代方案相 互排斥之外，是指"和/或"，即使公开的内容支持指代择一方案和"和/或"的定义。
[0222] 如在本说明书和权利要求书中使用的，术语"包括"（W及任何语法形式的包括）、 "具有"（W及任何语法形式的具有）、"包含"（W及任何语法形式的包含)或"含有"（W及任 何语法形式的含有)是包容性和开放性的，并且不排除其他的、未列举的元素或方法步骤。
[0223] 在本文的全文中，通过标识引用来引用了多种公开文献、专利和公开的专利说明 书。所有本文提及的公开文献、专利申请、专利和其他文献都明确地通过引用W其整体合并 至本文中，如同每个都单独通过引用合并到本文中一样。如果存在冲突，则W本发明的说明 书(包括定义)为准。
[0224] 表1.功能化的阳G接头
表2.纳米颗粒设计和pMHC结合能力。
【主权项】
1. 一种用于扩增和/或发展对象中的Trl细胞和/或B调节细胞的群体的复合物，所述复 合物包括纳米颗粒和疾病相关的抗原-MHCII复合物，其中所述纳米颗粒的直径选自：从约1 nm至约100 nm的直径；从约I nm至约50 nm的直径或从约Inm至约20 nm或从约5nm至约100 nm的直径，并且其中抗原-MHCII复合物与纳米颗粒的数量的比例是从约10:1至约1000:1。2. 根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物的抗原-MHCII密度为从约0.05 pMHC/100 nm2的纳米颗粒的表面积至约25 pMHC/100 nm2的纳米颗粒的表面积。3. 根据权利要求1或2所述的复合物，其中所述抗原来源于涉及自身免疫反应的自身抗 原或其模拟物，并且任选地其中所述自身抗原是来自由胰腺辟田胞、IGRP、胰岛素、GAD、IA-2 或髓鞘少突胶质蛋白（MOG)表达的抗原的表位。4. 根据权利要求1-3的任一项所述的复合物，其中所述纳米颗粒是非脂质体的和/或具 有固体核心，所述核心优选是金核心或氧化铁核心。5. 根据权利要求1-3的任一项所述的复合物，其中所述抗原-MHCII被共价地或非共价 地连接至所述纳米颗粒。6. 根据权利要求1-4的任一项所述的复合物，其中所述抗原-MHCII通过尺寸小于5 kD 的接头被共价地连接至所述纳米颗粒。7. 根据权利要求1-6的任一项所述的复合物，其中所述纳米颗粒是生物可吸收的和/或 生物可降解的。8. 根据权利要求1-6的任一项所述的复合物，其中纳米颗粒复合物包含的抗原-MHCII 复合物与纳米颗粒的比例为从约10:1至约100:1。9. 根据权利要求5所述的复合物，其中所述接头包括聚乙二醇。10. 根据权利要求1-9的任一项所述的复合物，其中所述抗原-MHCII复合物是相同的或 不同的。11. 根据权利要求9或10所述的复合物，其中所述接头是相同的或不同的。12. -种组合物，其包含治疗有效量的任一项前述权利要求所述的复合物、以及载体。13. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述载体是药学上可接受的载体。14. 一种制造、制备或获得任一项前述权利要求所述的复合物的方法，所述方法包括将 抗原-MHCII复合物涂布或复合至纳米颗粒上。15. -种在有需要的对象中以抗原特异性的方式促进Trl细胞和/或B调节细胞的形成、 扩增和招募的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的权利要求1-11的任一项所述的 复合物或权利要求12或13所述的组合物。16. -种在有需要的对象中治疗或防止病毒感染或自身免疫性疾病的方法，所述方法 包括向所述对象施用有效量的权利要求1 -11的任一项所述的复合物或权利要求12或13所 述的组合物，前提条件是所述抗原是自身免疫相关的自身抗原。17. 根据权利要求14-16的任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。18. 根据权利要求15或17所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自糖尿病、糖尿病前 期、多发性硬化或多发性硬化相关的疾病，前提条件是所述抗原与将要被治疗的自身免疫 性疾病相关。19. 一种试剂盒，其包括权利要求1-11的任一项所述的复合物或权利要求11或12所述 的组合物、以及使用说明。20. -种制造氧化铁纳米颗粒的方法，所述方法包括热分解乙酰丙酮铁。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述氧化铁纳米颗粒是可溶于水的。22. 根据权利要求20或21所述的方法，其中所述热分解包括单一步骤的反应。23. 根据权利要求20-22的任一项所述的方法，其中所述热分解在存在功能化的PEG分 子的情况下发生。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述热分解在存在苄基醚的情况下进行。25. 根据权利要求20或21所述的方法，其中用于所述热分解的温度为约80°C至约300 。(：、或约80°C至约200°C、或约80°C至约150°C、或约100°C至约250°C、或约100°C至约200°C、 或约150°C至约250°C、或约150°C至约250°C。26. 根据权利要求20-25的任一项所述的方法，其中所述热分解进行约1小时至约2小 时。27. 根据权利要求20-26的任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒在PBS中在约4°C下是 稳定的，没有任何可检测的降解或聚集。28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述纳米颗粒能够稳定至少6个月。29. 根据权利要求20-28的任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过磁性柱纯 化所述纳米颗粒。30. -种制造纳米颗粒复合物的方法，所述方法包括将pMHC与由权利要求20-29的任一 项所述的方法获得的氧化铁纳米颗粒接触，从而提供纳米颗粒复合物。31. 根据权利要求30所述的方法，所述方法进一步包括通过磁性柱纯化所述纳米颗粒。
【文档编号】C12N5/0781GK105899229SQ201480071440
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月3日
【发明人】佩德罗·圣塔马尼亚
【申请人】Uti有限合伙公司