免疫原性组合物及其用图
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2011年8月17日，申请号为201110242398. 6,发明名称为"免 疫原性组合物及其用途"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明是关于制备经纯化EV71病毒抗原的方法。本发明亦相关于利用本发明的 经纯化EV71病毒以制备免疫原性组合物及其免疫方法。
【背景技术】
[0003] 病毒感染引起各种病症。举例而言，肠病毒71 (Enterovirus 71/EV-71)为引起手 足口病（hand，foot and mouth disease)的主要病原体之一，且与严重神经疾病相关。由 于对宿主的EV71感染反应的分子机制了解极少，所以尚无对抗EV71感染的有效抗病毒制 剂。故仍有需要发展有效对抗EV71感染的疫苗。
【发明内容】
[0004] 本发明系关于对抗EV71感染的免疫原性组合物（例如疫苗）及相关方法。
[0005] 因此，本发明一方面的特征在于一种制备经纯化EV71病毒抗原的方法，该EV71病 毒抗原可用以制备对抗EV71感染的免疫原性组合物（例如疫苗）。该方法包括在培养基 中培养产生EV71病毒的细胞、自细胞或培养基中纯化EV71病毒（全粒子或次粒子），及使 经纯化的EV71病毒失活以获得经纯化的EV71病毒抗原。培养基优选为无血清培养基。纯 化步骤可通过液相层析纯化、蔗糖梯度超速离心纯化或两者来进行。失活步骤可如下进行： 在含有甲醛的溶液中在20-45°C下培养EV71病毒2至20天，例如在20-40°C下培养2至10 天，或在约37°C下培养2至5天。培养步骤可在旋转培养瓶或微载体生物反应器中进行。 在一实施例中，该方法进一步包括测定经纯化的EV71病毒抗原量的步骤。此测定步骤可通 过定量ELISA来进行。在以上方法中，EV71病毒抗原可为经分离的EV71病毒全粒子、经分 离的EV71病毒次粒子，或经分离的EV71病毒蛋白。此等抗原可用于免疫原性组合物中。因 此，在另一方面，本发明的特征为一种含有经纯化的EV71病毒抗原的免疫原性组合物。
[0006] 经分离的病毒粒子、蛋白质、多肽或肽是指实质上不含天然结合分子的病毒粒子、 蛋白质、多肽或肽，亦即以干重计为至少75% (亦即包括75%至100%在内的任何数值） 纯度。纯度可通过任何适当标准方法（例如通过管柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分 析）量测。经分离的肽、多肽或蛋白质可纯化自天然来源、通过重组DNA技术或化学方法产 生。术语「蛋白质」与「多肽」可互换使用以描述任何氨基酸链，而不论长度或转译后修饰 (例如糖基化或磷酸化）如何。因此，术语「本发明的多肽」包括：本发明的全长、天然产生 的蛋白质；对应于本发明的全长天然产生的蛋白质的重组或合成产生的多肽；或天然产生 的蛋白质的特定域或部分。该术语亦包涵具有附加的氨基端甲硫胺酸（适用于在原核细胞 中表现）的成熟多肽。肽是指足够短而能由氨基酸组成成分人工制备的链。一般而言，肽 为50个氨基酸残基长或更短（例如50、40、30、20、15、10或5个残基长）。病毒全粒子或 完整病毒粒子是指由核酸（其基因组）经蛋白质保护壳（亦即衣壳）包围组成的病毒粒子 (virion)。次粒子系指含有衣壳，但含有不完整基因组或不含核酸的粒子。例如参看Kinpe DM.及 Howley PM. (2001)Fundamental Virology，第 4 版，第 18 章。
[0007] EV71病毒蛋白的实例包括第一 EV71病毒多肽，其包括EV71VP1蛋白的片段或肽， 该EV71VP1蛋白具有选自下列组成的群的序列或由该序列组成：SEQ ID N0:5-7、ll-14、 16、20-24、39-41及44-46 (列于下文）；及第二EV71病毒多肽，其包括EV71VP2或VP3蛋 白的片段或肽。免疫原性组合物可进一步包括医药学上可接受的佐剂，诸如磷酸铝。该第 一或第二EV71病毒多肽为至少15个氨基酸残基长。该第二EV71病毒多肽可包括选自由 以下组成的群的序列或由该序列组成：SEQ ID勵：1-4、8-10、25-29、31-32、34-35、38、42及 43 (列于下文）。
[0008] 上述抗原或组合物可用于诱发对肠病毒感染的免疫反应。因此，可投予有效量的 抗原或组合物至有需要的个体。「个体」是指人类及非人类动物。非人类动物的实例包括所 有脊椎动物，例如哺乳类动物，诸如非人类的灵长类动物（尤其为较高等的灵长类动物）、 犬、啮齿动物（例如小鼠或大鼠）、天竺鼠、猫，及非哺乳动物，诸如鸟类。在一较佳实施例 中，个体为人类，尤其为幼儿。在另一实施例中，个体为实验动物或适用作疾病模型的动物。
[0009] 本发明的一个或多个实施将于附图及下文的说明中详述。本发明的其它特征、目 标及优势可由说明书、附图及权利要求书而显而易见。
【附图说明】
[0010] 图1为展示在旋转培养瓶中产生EV71-E59病毒原液的图。
[0011] 图2为展示在I. 4L生物反应器中产生EV71-E59病毒原液的图。
[0012] 图3为展示在5. OL生物反应器中产生EV71-E59病毒原液的图。
[0013] 图4A-4C为展示通过液相层析对EV71-E59病毒原液进行纯化的图及相片。
[0014] 图5为一组展示通过连续蔗糖梯度超速离心对EV71-E59病毒原液进行纯化的图 及相片。
[0015] 图6为一组展示EV71-E59病毒粒子的特征的相片。
[0016] 图7为展示EV71-E59病毒的失活动力学的图。
[0017] 图8为展示通过TEM检测EV71-E59病毒粒子的相片。
【具体实施方式】
[0018] 本发明，至少部分，是基于EV71抗原可引发免疫反应的意外发现及相关方法。 EV71为小核酿核酸病毒科（family Picornaviridae)肠病毒属（genus Enterovirus)的不 具外套的RNA病毒。此科的特征包括这些病毒不具外套、具二十面对称性、直径30±5nm、含 有单分子正义ssRNA (7. 5-8. 5kb)，且其在细胞质中复制。病毒衣壳为对称的二十面体（T = 1)且由60个相同单元构成，各单元由以下四种结构蛋白组成：VP1、VP2、VP3及VP4。EV71 病毒在1969年于美国首次分离。已测定EV71原型病毒株BrCr的完整核苷酸序列。
[0019] 如本文所述，本发明的特征在于一种制备经纯化的EV71病毒抗原的方法。该方法 包括培养产生EV71病毒的宿主细胞。可使用各种培养方法。实例包括基于旋转培养瓶、微 载体-生物反应器、旋转器及细胞于微载体珠粒间转移（Beads-to-Beads transfer)的方 法。
[0020] 可使用各种细胞作为产生上述EV71抗原的宿主。在一实例中，使用Vero细胞。 Vero细胞为人类疫苗制备的官方认可细胞株且已用来制备人类小儿麻痹疫苗（polio) 及狂犬病疫苗。因为Vero细胞具固着依赖性，所以可使用微载体技术来建立用于疫苗 制备的大规模细胞培养方法。为此，可使用微载体技术及无血清培养来克服使用高血清 蛋白质含量进行培养的缺点，包括复杂的下游纯化过程及普里昂蛋白（prion)污染之风 险。在一较佳实施例中，VP-SFM培养基（GIBCO)为较佳。亦可使用其它培养基，诸如Plus Vero(CESCO)、Excell(SAFC)及 HyQ(HYCL0NE)。
[0021] 为产生病毒抗原，一般可以10_2至10 _6(例如约10_5)的MOI感染宿主细胞。对于 收集，可使用批次、半批次或灌注技术。为纯化病毒抗原，可使用液相层析（LC)或蔗糖梯度 超速离心纯化。可在25°C至37°C下使用例如4000 :137%福尔马林（formalin)进行病毒 失活。为评估由此获得的抗原及含有该抗原的疫苗的效能，可使用VP2抗原中的交叉中和 抗原决定基（例如SEQIDN0 :l-4、8-10、25-29、31-32、34-35及38之一）作为疫苗效能测 试的生物标记。
[0022] 本发明的特征在于一种对抗病毒感染及/或其它相关病症（包括手足口病，及相 关神经疾病）的免疫原性组合物，诸如疫苗。如上所述，该免疫原性组合物含有抗原，例如 EV71病毒全粒子、EV71病毒次粒子或多肽。
[0023] 「抗原」是指含有一个或多个将刺激宿主的免疫系统产生体液反应和/或细胞抗 原特异性反应的抗原决定基的粒子或分子。术语「抗原」可与「免疫原」互换使用。由于与 适当细胞进行接触，因此抗原诱导敏感状态或免疫反应且在活体内或活体外以可呈现方式 与致敏个体的抗体或免疫细胞反应。抗原可被生物体中的抗体特异性识别及结合。与主要 组织相容性复合体（MHC)结合的抗原亦可被T淋巴细胞（T-细胞）表面上的受体识别及结 合，导致T-细胞活化。如本文中所用，术语「抗原决定基」是指抗原上由特定抗体分子或 T-细胞受体所结合的位点。在本文中，该术语可与「抗原决定簇」或「抗原决定簇位点」互 换使用。
[0024] 术语「免疫反应」或「免疫原性反应」是指个体中免疫系统响应于抗原的任何反 应。脊椎动物免疫反应的实例包括（但不限于）抗体产生、诱导细胞介导的免疫性及补体 活化。对相同抗原后续刺激的免疫反应（亦称为二次免疫反应）快于初次免疫所产生之反 应。术语「免疫原性」系指在宿主动物中针对抗原产生免疫反应的能力。此免疫反应形成 疫苗引发的针对特定感染生物体的保护性免疫力的基础。
[0025] 「抗体」是指具有特定氨基酸序列且仅结合于一种抗原或密切相关的一组抗原的 免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的至少一个免疫活性部分。抗体实例包括IgG、IgM、IgA、 IgD及IgE。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括Fab及F(abV 2片段，其可通过用 诸如胃蛋白酶的酶处理抗体来产生。抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。「单克隆抗体」是 指仅含有一个抗原结合位点且能够与特定抗原决定基发生免疫反应的一群抗体分子。「多 克隆抗体」是指含有一个以上抗原结合位点且能够与多肽上一个以上抗原决定基发生免疫 反应的一群抗体分子。
[0026] 抗原优选可自宿主细胞或其培养基表达及分离。其一致性及纯度可经由此项技术 中已知之方法（例如利用抗体的免疫印迹或质谱分析）确定。由此制备的抗原可用以制备 免疫原性组合物（例如疫苗）以便在易染病毒的个体（例如人类个体）体内产生针对EV71 病毒的抗体及免疫反应。例如可用下文所述的方式或通过此项技术中已知的任何其它等效 方法制备这样的组合物。
[0027] 此抗原可与医药学上可接受的载体（诸如磷酸盐缓冲盐水、碳酸氢盐溶液）或 佐剂混合以制备医药组合物。载体在其与组合物的活性成分兼容且较佳能够稳定活性成 分且对待治疗的个体无害的意义上须"可接受"。