基于投药模式及途径及标准医药实施来 选择载体。适合的医药载体及稀释剂、以及供其使用的医药必需品描述于Remington' s Pharmaceutical Sciences中。在一实例中，将抗原与佐剂混合以形成适用于免疫调节 的组合物。此组合物可制备成可注射剂、液体溶液或乳液。参看美国专利4, 601，903; 4, 599, 231 ;4, 599, 230 ;及 4, 596, 792。
[0028] 「佐剂」是指添加至免疫原性组合物（诸如疫苗）中的物质，其尽管本身不具有 任何特定抗原作用，但可刺激免疫系统且增强对免疫原性组合物的免疫反应。佐剂实例 包括（但不限于）巩沈淀物（alum-precipitate)、弗氏完全佐剂（Freund' s complete adjuvant)、弗氏不完全佐剂（Freund' s incomplete adjuvant)、单磷酰基-脂质A/海藻 糖二霉菌酸酯佐剂（monophosphoryl-lipid A/trehalose dicorynomycolate adjuvant)、 含有短棒状杆菌（Corynebacterium parvum)及tRNA的油包水乳液，及通过模拟特定组 的进化保守分子完成增强免疫反应任务的其它物质，该进化保守分子包括脂质体、脂多醣 (LPS)、抗原之分子笼（molecular cage)、细菌细胞壁的组分，及胞饮核酸，诸如双链RNA、单 链DNA及含非甲基化CpG二核苷酸的DNA。其它实例包括霍乱毒素 （cholera toxin)、大 肠杆菌（E.coli)热不稳定性肠毒素、脂质体、免疫刺激复合物（ISCOM)、免疫刺激序列寡脱 氧核苷酸及氢氧化铝。组合物亦可包括有助于活体内传递的聚合物。参看Audran等人， Vaccine 21 :1250-5,2003 ;及 Denis-Mize 等人，Cell Immunol.，225 :12-20,2003。或者， 本文所述的抗原可在无任何佐剂的情况下用于疫苗中。
[0029] 有效量的上述组合物可非经肠投予，例如皮下注射或肌肉内注射。或者，可能需要 包括栓剂及经口调配物的其它投药模式。对于栓剂，黏合剂及载体可包括例如聚伸烷二醇 或三酸甘油酯。经口调配物可包括常用赋形剂，诸如医药级糖精、纤维素、碳酸镁及其类似 物。这些组合物采用溶液、悬浮液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或散剂的形式。「有效 量」意味研宄者、兽医、医生或其它临床医师所寻求的在个体组织系统中或在个体体内引发 生物或医学反应的组合物的量。
[0030] 疫苗可经与剂量调配物兼容的方式，及在治疗上具有有效性、保护性及免疫原性 的量投予。所投予的量视所治疗的个体而定，包括，例如，个体免疫系统合成抗体及必要时 产生细胞介导的免疫反应的能力。需要投予的活性成分的确切量视从业者判断而定。然而， 适合剂量范围可由熟习此项技术者容易地决定且可为约数微克的本发明多肽。初次投药及 追加剂量的适合方案亦可变化，但可依次包括初次投药及后续投药。疫苗剂量亦可视投药 途径而定且根据宿主体型而变。
[0031] 易受病毒感染影响的个体（尤其为幼儿）可通过此项技术中已知之方法鉴别且投 予本发明的组合物。组合物剂量视例如特定抗原、是否共投予佐剂及所共投予佐剂的类型、 投药模式及频率而定，如可由熟习此项技术者决定。如可由熟习此项技术者决定，必要时重 复投药。举例而言，致敏剂量之后可接着三次的追加剂量，时间间隔为每周一次。可在首次 免疫后4至8周提供追加注射（booster shot)，且第二次追加可在8至12周给予相同调配 物。可自个体取血清或T-细胞用于测试由组合物引发的对抗病毒的免疫反应。此项技术 中熟知检定对抗蛋白质或感染的抗体或细胞毒性T细胞的方法。需要时可提供额外追加。 通过改变多肽/蛋白质的量、组合物的剂量及投药频率，免疫方案可经最佳化以便引发最 大免疫反应。在大规模投药之前，需要进行功效测试。在功效测试中，可经由口服或非经肠 途径投予非人类个体（例如小鼠、大鼠、兔、马、猪、牛或猴）本发明的组合物。在初次投药 后或在视需要追加投药后，可用病毒对测试个体与对照个体（接受模拟投药）进行攻毒以 测试组合物的功效。
[0032] 本发明的特征亦在于选择性结合于具有一种上述序列的肽的经分离的抗体。特征 亦在于产生抗体的方法，该方法通过用在动物体内引发免疫反应的上述免疫原性组合物免 疫动物以产生抗体；及自动物分离抗体或产生该抗体的细胞来达成。
[0033] 以下特定实例应视为仅用于说明，而非以任何方式限制本揭示案的其余部分。在 未进一步详述下，相信熟习此项技术者可基于本文中的描述最大程度地利用本发明。本文 中引用的所有公开案均以全文引用的方式并入本文中。此外，下文提出的任何机制均不以 任何方式限制所主张的本发明的范围。
[0034] 材料及方法
[0035] 1.细胞、培养基及病毒
[0036] Vero细胞（绿猴肾细胞）自美国菌种保存中心（American Type Culture Collection，ATCC)获得。Vero细胞以VP-SFM培养基（GIBCO)培养于组织培养瓶（T-flask) 中每周继代两次。EV71病毒株EV71-E59自台湾台北之疾病控制中心（Center of Disease Control，Taipei ,Taiwan)获得。在感染后第3天（第3DPI)，自受感染Vero细胞的培养基 收集EV71-E59病毒原液（EV71-E59viral stock)。病毒原液储存于-80°C下。
[0037] 2.在旋转培养瓶中产生EV71-E59病毒原液
[0038] 于旋转培养瓶中培养，使Vero细胞在含200mL VP-SFM培养基（37°C下，在滚筒 架（roller rack)中以0.33rpm的速率搅拌）的850cm2旋转培养瓶（CORNING)中继代。 旋转培养瓶培养的接种细胞密度为约1. 5-2 X IO7个细胞，且在培养6天后细胞密度达到 1. 5-2 X IO8个细胞。在100%培养基置换之后，EV71-E59病毒以10 -5的MOI感染Vero细胞。 在此研宄中，测试两百或四百毫升工作体积的培养基。在第OTPI自培养基收集EV71-E59 病毒原液。
[0039] 3.在生物反应器中产生EV71-E59病毒原液
[0040] 根据Wu等人，2004Vaccine 22(29-30) :3858-64中所述的微载体细胞培养方法进 tx EV71-E59病毒制备。
[0041] 在微载体培养方法中使用BI0FL0 310生物反应器（NBS，US)。在60rpm速率下在 PH 7下搅拌生物反应器培养物（1.4L及5L工作体积），且通过气体混合装置将溶解氧（DO) 含量控制在50%。首先自上述旋转培养瓶收集生物反应器中所用的Vero细胞。遵照制造 商的说明书制备Cytodex 1微载体（GE)。在设立各实验前先将Cytodex 1微载体浸于磷 酸盐缓冲盐水（PBS)中三小时以上且高压灭菌处理15分钟。以VP-SFM培养基洗涤经高压 灭菌处理的微载体两次。生物反应器培养物中的接种细胞密度约为2X IO5个细胞/毫升。 在第3天，70 %培养基经新鲜培养基置换，且在第6天，细胞密度达到2-2. 5 X IO6个细胞/ 毫升。在置换70%培养基之后，用EV71-E59病毒以KT5的MOI感染Vero细胞。在一实例 中，在第6DPI自微载体培养基收集EV71-E59病毒。在另一实例中，使用半批次培养法藉由 在第6、第8、第10及第12DPI每两天置换70%培养基来收集病毒。在又一实例中，使用灌 注培养法通过在第6至第13DPI每天置换50-70%培养基来收集病毒。
[0042] 4.通过液相层析纯化EV71-E59病毒原液
[0043] 以上述方式收集EV71-E59病毒原液后，通过0. 65 μ m过滤器（SARTORS)移除Vero 细胞碎片，且使用100K TFF卡匣（PALL)浓缩及透滤病毒原液。将浓缩病毒原液装载至 S印harose Fast Flow 6 凝胶管柱以便使用 FPLC 系统、AKTA pilot (GE HEALTHCARE)进行 液相层析。Sephacryl S-500凝胶管柱亦用于进行纯化方法。对此法所得分离液区段以 MAB979 抗体（MILLIP0RE)进行 SDS-PAGE 及 Western 印迹分析（Western analyses)来检测 EV71病毒。使用100K TFF卡匣（PALL)浓缩经纯化的EV71-E59病毒原液且再悬浮于PBS 中。使用BCA蛋白质检定组（PIERCE)测定再悬浮病毒原液的总蛋白质浓度。
[0044] 5.通过连续蔗糖梯度超速离心来纯化EV71-E59病毒原液
[0045] 以上述方式收集EV71-E59病毒原液后，通过0. 65 μ m过滤器（SARTORS)移除Vero 细胞碎片，且使用100K TFF卡匣（PALL)浓缩EV71-E59病毒原液。将浓缩的病毒原液装载 至10-50%连续蔗糖梯度以便在32, 000RPM下超速离心3小时。对这些所得分离液区段使 用 MAB979 抗体（MILLIP0RE)进行 SDS-PAGE 及 Western 印迹分析（Western analyses)以 检测经纯化的EV71病毒。使用Amicon100 K管（MILLIP0RE)通过在 3,000Xg下离心来 透滤经纯化的EV71-E59病毒原液。将浓缩原液再悬浮于PBS中。使用BCA蛋白质检定组 (PIERCE)测定再悬浮病毒原液的总蛋白质浓度。
[0046] 6.测定病毒效价
[0047] 据组织培养物感染剂量的50%细胞感染力价（TCID5tl)测定病毒效价。将连续稀 释的病毒样品（KT 1至KT8)添加至已长满Vero细胞的96孔盘中，且各稀释度以10重复 试验之。在37 °C下培育96孔盘六天，且通过计数受感染Vero细胞的细胞病变效应来获得 TCID5tl值。使用 Reed-Muench 法计算 TCID 5。值。
[0048] 7.制备失活EV71-E59病毒及动物免疫
[0049] 将EV71-E59病毒原液与37%甲醛溶液（MERCK)以4000 : 1比率的体积比混合， 且在37°C下培育3天以使EV71-E59病毒失活。在免疫之前，使失活病毒原液在室温下以磷 酸铝吸附3小时。以0. 2mL经磷酸铝吸附的失活EV71-E59病毒原液以肌肉内注射法（i. m) 免疫一组6只雌性BALB/c小鼠（18-25g，出生6-8周），且将相同剂量于首次免疫后两周再 对小鼠进行强化免疫。另免疫两只纽西兰白兔（New Zealand white rabbit)，且在2至3 周后用0. 5mL经磷酸铝吸附的失活EV71-E59病毒原液进行肌肉内注射强化免疫。同样地， 一恒河猴亦以肌肉免疫，且在1个月后用〇. 5m