tope)
[0102] 使用总共153种重叠合成肽来筛选对抗血清具有高亲和力的肽。在这些肽中，57 种涵盖VPl蛋白（VP1-1至VP1-57) ;49种涵盖VP2蛋白（VP2-1至VP2-49);且47种涵盖 VP3 蛋白（VP3-1 至 VP3-47)。
[0103] 在一实验中，以在磷酸铝中调配的EV71疫苗候选病毒原液免疫六只小鼠及三只 兔。在两个剂量后，收集小鼠抗血清且汇集在一起。小鼠抗血清对于VP1-42及VP1-43肽 显示高OD值。在高OD值下小鼠抗血清未检测到VP2及VP3肽。兔抗血清对于VP1-01、 VP2-27、VP2-28及VP2-29肽显示高OD值。在高OD值下兔抗血清未检测到VP3肽。对抗 血清具有高亲和力的肽列于表7中。
[0104] 表7.对抗血清具有高亲和力的合成肽的氨基酸序列
[0106] 10.不同亚基因型中EV71VP2抗原决定基序列的比对
[0107] 将EV71VP1序列与亚基因型树比对。为了解来自不同亚基因型（基于VP1)的VP2 抗原决定基序列，选择及比对十种EV71病毒株的VP2氨基酸序列（131-155)。VP2抗原决 定基序列比对显示此序列在EV71病毒株中高度保守（表8)。
[0108] 表8.来自不同亚基因型的VP2氨基酸（131-155)序列的比对
[0109]
[0110] *SEQ ID NO :4为基于SEQ ID NO :1-3预测的序列，其两个变异残基为D及Η。
[0111] 对上述VP1-43肽序列进行位点突变分析。更特定言之，其残基（除Α224外）各 自用丙氨酸残基置换以产生14种突变型肽。这些突变体的序列列于下文，其中丙氨酸残基 加下底线。接着进行ELISA检定以检验此14种突变型肽结合于El (特异性结合于VP1-43 的小鼠抗EV71抗体）的能力。发现215赖氨酸、217谷氨酸、218赖氨酸，及219天冬氨酸 为EV71VP1抗原性的必需氨基酸。
[0112] 类似地，对上述VP2-28肽序列进行位点突变分析。基于VP2-28肽序列产生一组 14种突变型肽，其中各氨基酸残基（除136Α外）用丙氨酸残基置换。这些突变体的序列 列于下文，其中丙氨酸加下底线。进行ELISA以检验突变体结合于MAB979 (特异性结合于 VP2-28肽的单克隆抗体）的能力。发现142谷氨酸、145组氨酸、148酪氨酸及149赖氨酸 为必需的。
[0113] AGEHKQEKDLEYGAC, SEQ ID NO ：11
[0114] FAEHKQEKDLEYGAC, SEQ ID NO ：12
[0115] FGAHKQEKDLEYGAC, SEQ ID NO ：13
[0116] FGEAKQEKDLEYGAC, SEQ ID NO ：14
[0117] FGEHAQEKDLEYGAC, SEQ ID NO ：15
[0118] FGEHKAEKDLEYGAC, SEQ ID NO ：16
[0119] FGEHKQAKDLEYGAC, SEQ ID NO ：17
[0120] FGEHKQEADLEYGAC, SEQ ID NO ：18
[0121] FGEHKQEKALEYGAC, SEQ ID NO ：19
[0122] FGEHKQEKDAEYGAC, SEQ ID NO ：20
[0123] FGEHKQEKDLAYGAC, SEQ ID NO ：21
[0124] FGEHKQEKDLEAGAC, SEQ ID NO ：22
[0125] FGEHKQEKDLEYAAC, SEQ ID NO ：23
[0126] FGEHKQEKDLEYGAA, SEQ ID NO ：24
[0127] AAGTGTEDSHPPYKQ, SEQ ID NO ：25
[0128] AGATGTEDSHPPYKQ, SEQ ID NO ：26
[0129] AGGAGTEDSHPPYKQ, SEQ ID NO ：27
[0130] AGGTATEDSHPPYKQ, SEQ ID NO ：28
[0131] AGGTGAEDSHPPYKQ, SEQ ID NO ：29
[0132] AGGTGTADSHPPYKQ, SEQ ID NO ：30
[0133] AGGTGTEASHPPYKQ, SEQ ID NO ：31
[0134] AGGTGTEDAHPPYKQ, SEQ ID NO ：32
[0135] AGGTGTEDSAPPYKQ, SEQ ID NO ：33
[0136] AGGTGTEDSHAPYKQ, SEQ ID NO ：34
[0137] AGGTGTEDSHPAYKQ, SEQ ID NO ：35
[0138] AGGTGTEDSHPPAKQ, SEQ ID NO ：36
[0139] AGGTGTEDSHPPYAQ, SEQ ID NO ：37
[0140] AGGTGTEDSHPPYKA, SEQ ID NO ：38
[0141] 在另一实验中，以0. 5mL磷酸铝吸附的失活的EV71-E59病毒原液肌肉内免疫10 只雄性及10只雌性CD? (SD) IGS品系大鼠（分别为第1组及第2组）且在3周后进行 强化免疫。结果总括于下表9中。如表中所示，该免疫诱发具有高中和效价的抗血清。
[0142] 表9.大鼠模型中失活EV71-E59病毒之免疫原性。
[0145] 通过酶联免疫吸附法（ELISA)以相同方式测量抗血清对各上述合成肽的亲和力。 发现VP1-25、VP1-42、VP1-49、VP1-50、VP2-20及VP3-22经检测具有高OD值，显示抗血清 以高亲和力结合于这些肽。下表10中列出这些肽的序列。
[0146] 表10.对抗血清具有高亲和力的合成肽的氨基酸序列
[0148] 进行序列比对以检验来自不同亚基因型的VP1-25氨基酸序列。结果展示于下表 11中。发现这些肽具有高度共同序列：RKVELFTDMRFDAEF(SEQ ID N0:44)。
[0149] 表11.来自不同亚基因型的P1-25氨基酸序列的比对
[0152] 对来自不同亚基因型的VP1-49及VP1-50氨基酸序列进行类似比对分析。结果展 示于下表12中。
[0153] 表12.来自不同亚基因型的VP1-49或50氨基酸序列的比对
[0156] 鉴别出两个共同序列：SKSKYPLVVRIYMRM(SEQ ID NO :45)及SKSEYSLVIRIYMRM(SEQ ID NO ：46)
[0157] 其灾实施例
[0158] 本说明书中揭示的所有特征均可以任何组合形式组合。本说明书中揭示的各特征 可经具有相同、等效或类似目的的替代性特征替换。因此，除非另外明确规定，否则所揭示 的各特征仅为通用系列的等效或类似特征的实例。
[0159] 已描述本发明的许多实施例。然而，应了解在不脱离本发明的精神及范畴的情况 下可进行各种修改。因此，其它实施例在以下权利要求书的范畴内。
【主权项】
1. 一种产生经纯化及定量EV71病毒抗原的方法，其包含 在培养基中培养产生EV71病毒的细胞， 自该细胞或该培养基纯化EV71病毒，及 使该经纯化EV71病毒失活以获得该经纯化EV71病毒抗原； 其中该纯化步骤通过液相层析纯化、连续蔗糖梯度超高速离心纯化或两者的组合来进 行；及 其中该经纯化EV71病毒系相当于由位于25-38%蔗糖梯度区间内的EV71病毒全粒子、 次粒子与其他高分子量蛋白质的蛋白质组成；且 其中该经纯化的EV71病毒抗原包含选自由SEQ ID N0:l-4、8-10、25-29、31-32、34-35、 38、42及43组成的群组的序列。2. 如权利要求1的方法，其中该培养基为无血清培养基。3. 如权利要求1的方法，其中该失活步骤藉由在含有甲醛的溶液中在20-45°C下培育 该EV71病毒2至20天来进行。4. 如权利要求3的方法，其中该失活步骤藉由在该含有甲醛的溶液中在约37°C下培育 该EV71病毒2至5天来进行。5. 如权利要求1的方法，其中该培养步骤是在旋转培养瓶或微载体生物反应器中进 行。6. 如权利要求1的方法，其中该方法进一步包含测定该经纯化EV71病毒抗原的量的步 骤。7. 如权利要求6的方法，其中该测定该经纯化EV71病毒抗原的量的步骤系藉由定量 EV71VP2抗原的ELISA进行。8. 如权利要求1的方法，其中该EV71病毒抗原为EV71病毒全粒子、EV71病毒次粒子 或EV71病毒蛋白。9. 一种免疫原性组合物，其包含： 经分离的EV71 病毒多肽，其包括选自由 SEQ ID NO: 1-4、8-10、25-29、31-32、34-35、38、 42及43组成的群组的序列。10. 如权利要求9的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含医药学上可 接受的佐剂。11. 如权利要求9的免疫原性组合物，其中该佐剂含有磷酸铝。12. 如权利要求9的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含医药学上可 接受的佐剂。13. 如权利要求12的免疫原性组合物，其中该佐剂含有磷酸铝。14. 如权利要求9的免疫原性组合物，其中该组合物另包含EV71病毒多肽，其包括选自 由 SEQ ID N0:5-7、ll-14、16、20-24、39-41 及 44-46 组成的群组的序列。15. -种如权利要求9的免疫原性组合物于制备诱导对肠病毒感染的免疫反应的药剂 的用途。16. 如权利要求15的用途，其中该组合物另包含EV71病毒多肽，其包括选自由SEQ ID N0:5-7、ll-14、16、20-24、39-41 及 44-46 组成的群组的序列。17. 如权利要求15的用途，其中该组合物包含经分离及抗原定量的EV71病毒全粒子及
【专利摘要】本发明揭示免疫原性组合物及其用途。本发明制备经纯化的EV71病毒抗原的方法，亦揭示相关的免疫原性组合物及免疫方法。
【IPC分类】C12N7/02, A61K39/125, C12N7/04, C12R1/93, A61P31/14
【公开号】CN104946604
【申请号】CN201510239613
【发明人】再成·庄, 刘家齐, 郭孟欣, 张瑞原
【申请人】财团法人卫生研究院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2011年8月17日
【公告号】CN102399757A, US9051361, US20120045468