L经磷酸铝吸附的失活EV71-E59病毒原液进 行肌肉内注射强化免疫。在强化免疫一周之后对免疫的动物进行采血，且收集血清以便分 析病毒中和能力。
[0050] 8.通过穿透式电子显微镜（TEM)检测EV71-E59病毒粒子
[0051] 将失活的EV71-E59病毒原液滴于涂布福尔瓦膜（formvar)且经碳蒸 (carbon-vaporized)的200网目铜网上。在室温下将样品（20 μ L)滴在铜网上保持15分 钟，且接着以一片滤纸移除过量样品。以CldH2O洗涤一次后，以2%钨磷酸溶液对铜网进行 染色2分钟且随后以一片滤纸移除溶液。染色的铜网经干燥3天以上。在Hitachi H-7650 电子显微镜下观察铜网。
[0052] 9.抗EV71-E59血清的中和试验
[0053] 在56°C下使自免疫小鼠收集的血清失活30分钟。将各血清样品添加至微管中且 使用新鲜VP-SFM培养基以两倍连续稀释度稀释。将 400 μL体积含 200TCID5(lEV71-E59 病毒的悬浮液添加至含有400 μ L连续稀释血清的各管中。在4°C下培育18-24小时后，将 100 μ L连续稀释样品添加至含Vero细胞的96孔盘中。在37°C下培育96孔盘中的培养物 七天，且通过计数受感染Vero细胞的细胞病变效应来获得TCID 5tl值。使用Reed-Muench法 获得50%中和抑制剂量（ID5tl)，其为使病毒效价减小50%的血清稀释度的几何倒数。
[0054] 10.合成肽的设计及合成
[0055] EV71病毒株TW/2086/98 VP1、VP2及VP3衣壳蛋白的重叠合成肽在科罗耐国际科 技公司（Kelowna International Scientific Inc.，台北县，台湾）合成，包括涵盖VPl衣 壳蛋白的完整序列的一组57种重叠合成肽、涵盖VP2衣壳蛋白之完整序列的一组49种重 叠合成肽，及涵盖VP3衣壳蛋白之完整序列的一组47种重叠合成肽。各肽含有15个氨基 酸残基，其中10个残基与相邻肽重叠。
[0056] 11.通过ELISA检测抗体
[0057] 通过酶联免疫吸附法（ELISA)测量抗体对各合成肽的亲和力。在4°C下以50 μ L 在涂布缓冲液（〇. IM NaHCO3, pH = 9. 5)中稀释至10 μ g/mL的个别合成肽或经纯化的病毒 涂布96孔盘（COSTAR)的各孔过夜。以0. 5微克/孔失活EV71-E59病毒原液用作阳性对 照组。各合成肽或纯化病毒有二重复孔。以IXPBST(含有0.05% Tween 20的磷酸盐缓 冲盐水）洗涤一次后，以200 μ L阻断缓冲液（5%脱脂奶的PBS溶液）阻断各孔且在室温 下培育2小时。将以1 : 200稀释于1% BSA/PBS中的一抗添加至各孔（每孔100 μ L)中 且培育2小时。在移除一抗溶液之后，以IXPBST洗涤各孔六次。向经洗涤的各孔中添加 100 μ L 以 1 : 5000 稀释于 1% BSA/PBS 中的辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase)标 记的二抗，且培育2小时。在移除二抗溶液之后，以IXPBST洗涤各孔六次。通过添加 TMB 底物溶液（KPL)使反应显色且在室温下培育15分钟。通过添加 H2SO4(IN)来停止反应且通 过ELISA读取器在450nm下量测吸光度。
[0058] 12.序列比对及结构同源性预测
[0059] 所有相关 EV71 病毒株均自 NCBI PubMed 网站（www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed) 搜寻。使用称为 ClustalW2 的计算机软件（www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index. html) 对EV71VP2蛋白的基因组序列进行比对。
[0060] 结果
[0061] 1.在旋转培养瓶中产生EV71-E59病毒原液
[0062] Vero细胞在37°C下于含200mL VP-SFM培养基的850cm2旋转培养瓶中培养。当细 胞密度达到1. 5-2 X IO8个细胞时，置换培养基且用EV71-E59病毒以10 _5的MOI感染Vero 细胞。如图1中所示，病毒效价在第3DPI达到2-4. 5X IO6TCID5ciAiL且病毒效价维持稳定 产量。当使用200mL或400mL培养基时，EV71-E59病毒的生成动力学为类似。
[0063] 2.在生物反应器中产生EV71-E59病毒原液
[0064] 使用VP-SFM培养基中的微载体细胞培养来产生EV71-E59病毒原液。在37°C下，在 批次、半批次或灌注生物反应器中，使Vero细胞于载体浓度为5g/L的Cytodex微载体上生 长。当细胞密度达到2-2. 5 X IO6个细胞/毫升时，用新鲜VP-SFM培养基置换70 %培养基，且 在生物反应器中在32°C下用EV71-E59病毒以KT5的MOI感染Vero细胞。发现在1. 4L批次 生物反应器培养物中最大病毒效价为在第6DPI达到2. 7X 105TCID5(l/mL。病毒效价在I. 4L 半批次生物反应器培养物中在第6至第12DPI在0. 8至7 X IO6TCID5ciAiL的范围内。病毒效 价在I. 4L灌注生物反应器培养物中在第6至第12DPI在0. 5至2X IO6TCID5tZmL的范围内 (图2)。在5L批次生物反应器培养物中最大病毒效价为在第6DPI达到I X 106TCID5Q/mL。 病毒效价在5L半批次生物反应器培养物中在第6至第12DPI在0. 7至13 X IO6TCID5ciAiL的 范围内。病毒效价在5L灌注生物反应器培养物中在第7至第13DPI在1至2X IO7TCID5tl/ mL的范围内（图3)。与批次培养法相比，半批次及灌注培养法可将收集产率提高3-5倍。
[0065] 3.通过液相层析纯化EV71-E59病毒原液
[0066] 将浓缩的EV71-E59病毒原液（20mL)装载至Sepharose Fast Flow 6凝胶管柱 或Sephacryl S-500,且进行液相层析。基于Western印迹分析，EV71-E59病毒主要收集 于分离液区段3及4中（图4A及4B)。或者，将浓缩的病毒原液（20mL)装载至S印hacryl S-500凝胶管柱。EV71-E59病毒的主要分离液区段见于分离液区段7及8中（图4C)。浓 缩汇集的分离液区段。透滤经纯化的病毒原液且以PBS再悬浮。
[0067] 4.通过连续蔗糖梯度超速离心来纯化EV71-E59病毒原液
[0068] 将浓缩的EV71-E59病毒原液装载至10-50 %连续蔗糖梯度以便在32, OOORPM下 超速离心3小时。当自培养基分离EV71-E59病毒时，通过Western印迹分析检测到两种 EV71-E59病毒粒子（图5)。在具有25至28%蔗糖的分离液区段中检测到EV71-E59次粒 子，而在具有35至38%蔗糖的分离液区段中检测到EV71-E59全粒子。EV71-E59全粒子比 EV71-E59次粒子更具感染性。分别透滤此两种EV71-E59病毒粒子且以PBS再悬浮。
[0069] 5. EV71病毒粒子的特征
[0070] 通过组合纯化与液相层析及蔗糖梯度超速离心来获得超纯EV71-E59病毒原 液。将样品装载于10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上且用考马斯蓝（Coomassie Blue)染色。 EV71-E59次粒子与全粒子显示不同蛋白质图谱（图6)。EV71-E59病毒抗原的预测分子量 及观测分子量列于表1A-1C中。
[0071] 表1A.完全切割的病毒抗原
[0078] 如图6中所示，EV71-E59次粒子具有较多抗原，主要包括VPO (VP2+VP4)、VPl及 VP3。EV71-E59全粒子具有基本病毒组成：VP1、VP2、VP3及VP4。
[0079] 6.制备失活的EV71-E59病毒原液
[0080] 将EV71-E59病毒原液（I X 107PFU/mL)与37%甲醛溶液以4000 : 1的体积比混 合，且在37°C、25°C或4°C下培育以使病毒失活。在37°C下，EV71-E59病毒在24小时内失 活，而EV71-E59病毒在25°C下失活需要3天（图7)。若使病毒在4°C下失活，则EV71-E59 病毒效价在3天内仍较高。发现升高温度显着提高失活速率。在37°C下，EV71-E59病毒效 价耗时2. 16天降至l(T12PFU/mL (表2) 〇
[0081] 表2.EV71-E59病毒的失活时间
[0082]
[0083] 为确保疫苗接种的安全性，在37°C下进行EV71-E59病毒的失活维持5-6天。
[0084] 7.通过TEM检测EV71-E59病毒粒子
[0085] 以2%钨磷酸溶液染色失活的EV71-E59原液且在穿透式电子显微镜下观测。发现 EV71-E59病毒在失活后仍保持为完整病毒粒子。EV71-E59病毒粒子的尺寸在直径30±5nm 的范围内（图8)。次粒子与全粒子样品均经检测具有完整病毒粒子。
[0086] 8.失活的EV71-E59病毒的免疫原性研宄
[0087] 为进一步测定EV71-E59病毒的免疫原性，以甲醛溶液处理来自液相层析及来自 连续蔗糖梯度超速离心的经纯化的病毒原液以使病毒失活。按照两周免疫时程，以吸附于 磷酸铝上的失活的EV71-E59病毒免疫小鼠、兔及猴。在小鼠模型中，结果显示自液相层析 或自连续蔗糖梯度超速离心制备的失活的EV71-E59病毒均引发中和抗体并具显着效价 (表 3)。
[0088] 表3.小鼠模型中失活的EV71-E59病毒的免疫原性。
[0090] 使用相同免疫时程时，EV71-E59全粒子引发高于次粒子的中和抗体效价。在兔及 猴模型中，从已用液相层析纯化的病毒原液制备的失活的EV71-E59病毒亦诱导较高中和 效价（表4及表5)。
[0091] 表4.兔模型中失活的EV71-E59病毒的免疫原性。
[0092]
[0096] 使用这些抗血清进行交叉中和检定，且结果展示这些抗血清亦能对抗EV71病毒 的C5及B5亚基因型（subgenotype)(表6)。
[0097] 表6.不同血清对抗EV71病毒的遗传组（genogroup)C5及B5的中和抗体效价。
[0098] 表 6
[0099]
[0100] 明显地，化学失活的EV71-E59病毒亦诱导出对抗其它EV71病毒株的中和抗体 (表 6)。
[0101] 9.使用对抗EV71疫苗候选物产生的抗血清来鉴别EV71的线性免疫显性抗原决定 基（linear immunodominant epi