一种外用敷料及其制备方法和应用

一种外用敷料及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种外用敷料及其制备方法和应用。本发明的外用敷料由复合纤维形成，所述复合纤维包含：A.合成聚合物、B.天然聚合物、和C.去铁胺。用于制备该外用敷料的方法包括将包含合成聚合物的溶液、包含天然聚合物的溶液和去铁胺混合形成纺丝原料液，然后对该纺丝原料液进行纺丝处理。本发明还提供了所述外用敷料在用于制备治疗皮肤外伤的制品中的应用。
【专利说明】
-种外用敷料及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明总体设及医疗领域，更具体来说，本发明设及一种能够促进创面修复的外 用敷料，该敷料不仅可W保持创面干洁，还能有效促进血管生成，加速愈合进程。本发明还 提供了该外用敷料的制备方法及其在皮肤外伤治疗方面的应用。
【背景技术】
[0002] 皮肤伤口愈合的关键步骤是新生血管长入创面及肉芽组织形成，对于一些普通的 外伤创口，使用敷料对其进行包裹和保护并同时口服或外用药物治疗便可W使得创口得W 康复。而对于一些慢性难愈合的创面，例如糖尿病患者的足部皮肤创面、长期邸床患者而引 起皮肤稱疮创面等，单纯通过换药及覆盖普通纱布敷料，难W达到伤口愈合的目的，并容易 导致溃瘍形成。对糖尿病患者的足部皮肤创面，最终需选择截肢手术W控制溃瘍扩大和溃 瘍面的反复感染。资料显示，全球每年因此失去一侧下肢的患者约为100万人，几乎每30秒 中就会有一名患者因为糖尿病而失去下肢，并且该数字还在因糖尿病发病率增加而逐年递 增。
[0003] 皮肤创伤后，损伤区血供进一步的损毁，是导致皮肤创面难W自然愈合的主要因 素之一，尤其表现在原就存在血供障碍(如糖尿病患者、高龄等)的患者;刺激皮肤损伤区血 管再生、重建皮肤真皮层血供，是促进皮肤难愈性愈合常选择的着力点。近些年来，众多专 家学者通过各种方法W促进损伤区域血管形成，包括在动物试验中尝试腹腔注射或局部滴 加成血管相关细胞外因子(生物制剂)和/或药物的方法。运些举措确实促进了血管生成增 多并在一定程度上发挥利于损伤部位伤口愈合的作用，但其缺点不足也是非常明显的。首 先，相关药物及细胞外生长因子(生物制剂）的利用率低，真正到达损伤部位的药物量未知； 其次，采用腹腔注射的方法可引起其它组织器官出现新的并发症，风险过高。而采用局部 滴加或注射的方法则会引起患处疼痛、刺激及潜在感染风险等。
[0004] 针对糖尿病患者，在系统性控制血糖水平的同时，越来越侧重于皮肤损伤局部的 治疗，伤口处负压吸引法(negative pressure wound therapy /NPWT)是现在常用的局部 治疗难愈性急、慢性创口的方法之一。负压吸引疗法通过减轻伤口区的渗液与组织水肿、抑 制细菌生长和机械力应急引发肉芽组织形成、血管新生等作用，促进伤口愈合，并显现出临 床疗效。但随着治疗适应证的增加，一些新的问题有待进一步研究，如最适负压值、敷料更 换时间、合理的治疗时间等。除此，也不断有新型敷料作为临时皮肤替代物用于覆盖创面的 研发产品问世，例如人工皮。由于糖尿病创面的高糖环境阻碍了微脉管系统的重建，仅仅通 过使用具有仿生结构的生物材料不能有效解决运一问题。随之，人们尝试将一些具有诱生 血管形成作用的细胞因子[如血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDG巧、基质 细胞衍生因子(SDF)-la，等]添加到生物材料的敷料中，重组PDGF-BB是现在仅有的一种经 过美国FDA认证，可用于临床的皮肤修复的生长因子，目前临床上的应用方法是将携载 PDGF-BB的凝胶涂抹在创面处来修复皮肤组织。但由于糖尿病等难愈性皮肤创面的病理机 制复杂，仅通过添加一到二种生长因子不能非常有效加速创面愈合;外源性生长外因子价 格昂贵。就重组PDGF-BB还处在W下几点不足：1、运种载药及治疗方式仍然属于传统局部用 药的范畴，患者活动、覆盖敷料（如纱布等）及局部摩擦可导致凝胶有效成分丢失，降低疗 效;2、凝胶所载药物无法缓释，因凝胶有丢失损耗，无法准确计算药物释放效果。3、近年来 多有关于其可能诱导癌症发生的报道。
[0005] 激活组织细胞低氧/低氧诱导因子化ypoxia-indudble factor,HIF)-a通路，启 动其下游与血管形成血管的直接祀基因（VEGF、SDF-化等），可明显刺激组织血管新生。基于 运一机制，探寻药用低氧模拟化合物W促进组织再生与修复，是当今相关研究领域的热点 内容。去铁胺(DF0)作为铁离子络合剂，于1970年代开始应用于临床，主要用于治疗血色素 沉着病和地中海贫血、镶状细胞贫血等由于输血引起的慢性铁负荷过重的疾病。近年来，申 请者及相关的研究发现，DF0可通过络合HIF-a代谢过程中所需的铁离子，而激活细胞低氧/ HIF-a通路，呈现低氧模拟化合物的功效，刺激骨与软组织的组织血管新生，进而发挥促进 组织再生与修复的作用。因此，应用负载DF0的生物材料作为创面敷料，具有明显的优点。第 一，DF0已在临床中作为内服药物使用多年，安全性高;第二，DF0提取自链球菌发酵液的天 然物，稳定性好，在与材料混合制备过程中不易分解失效;第S、DF0具有促进细胞募集、增 殖和生存的作用，可调节细胞与血管形成相关的多种细胞因子表达。
[0006] 皮肤创面愈合是连续的生物学级联反应过程，依据其不同时相的组织学优势表 现，可将皮肤愈合初期过程大致分为Ξ个阶段。第一阶段:创面形成后的第1~3天，主要表 现为皮肤伤口区的炎症反应，伴随浆液渗出、充血W及中性粒细胞为主的白细胞浸润;第二 阶段:创面形成后的第3~14天，肉芽组织增生明显，血管生成、微脉管系统重新构建，胶原 形成，新生结缔组织逐渐填充满创面;第Ξ阶段:创面形成后的第3~21天，基底细胞构成的 单层上皮覆盖肉芽组织表面，胶原重组等。因此，创面敷料应至少具备二个特征:促血管的 药物应在早期快速释放，W募集细胞及其成血管相关的细胞及因子到达损伤区域，为即将 开始的血管重建提供基础;材料支架可适时降解，否则将成为新生组织生长、爬行替代的障 碍。现有技术中需要开发能够满足上述要求的外用敷料。

【发明内容】

[0007] 鉴于难愈性皮肤损伤治疗时拟解决的关键问题，本发明开发了一种新型外用敷 料，将DK)渗入医用高分子材料的基质原料中，设计并利用纺丝技术、特别是静电纺丝技术， 制备了一种含DF0的亲水性纳米纤维薄膜多孔敷料，通过调节支架材料的组分参数，使该敷 料可快速释放其中的DF0( 24小时的总释放量达80 % ; 72小时的总释放量达100 % )，有效发 挥DF0募集细胞、诱生血管和促进肉芽组织生长的作用;支架材料具备与创面愈合速度相匹 配的降解速度，在皮肤创面修复的第二时段（肉芽组织增生明显，血管生成、微脉管系统重 新构建，胶原形成，新生结缔组织逐渐填充满创面)完全降解(第8天时，近80%降解；10天 时，几乎完全降解）；所述材料还具有亲水性、多孔的通透性等特征，有利于保持创面干燥清 洁。
[0008] 本发明的第一个方面提供了一种外用敷料，该外用敷料由复合纤维形成，所述复 合纤维包含：
[0009] A.合成聚合物，该合成聚合物选自聚乙締醇、聚已内醋、娃橡胶、聚氨醋、聚醋纤 维、聚乙締基化咯烧酬、聚酸酸酬、聚甲基丙締酸甲醋、聚乳酸、聚乙締、W及它们的组合；
[0010] B.天然聚合物，该天然聚合物选自壳聚糖、纤维素、透明质酸、胶原蛋白、明胶、海 藻酸钢、W及它们的组合；
[00川 C.去铁胺。
[0012] 根据本发明的一个实施方式，W所述复合纤维的总重量为基准计，所述去铁胺的 含量为0.8-1.05重量％，优选为0.9-1.03重量％，更优选0.95-1.02重量％，更优选为0.99- 1.01重量％，最优选为1重量％。
[0013] 根据本发明的另一个实施方式，W所述复合纤维的总重量为基准计，所述合成聚 合物的含量为1-98重量％，优选5-90重量％，更优选10-85重量％，更优选20-70重量％，更 优选30-60重量％，更优选40-55重量％ ;所述天然聚合物的含量为1-98重量％，优选5-90重 量％，更优选10-85重量％，更优选20-70重量％，更优选30-60重量％，更优选40-55重量％。
[0014] 根据本发明的另一个实施方式，所述合成聚合物是聚乙締醇，其聚合度为2400- 2500，水解度为98.0-99.8mol % ;所述天然聚合物是壳聚糖，其分子量为10，000-200，000， 优选为30，000-80，000，更优选为40，000-70，000，脱乙酷度为90-95%。
[0015] 根据本发明的一个实施方式，所述复合纤维的直径为50纳米至50微米，优选为100 纳米至1000微米，更优选为500-900纳米，更优选为600-800纳米;所述复合纤维的水接触角 为0-5度，优选为0-2.5度，更优选为0度。
[0016] 本发明的第二个方面提供了一种用来制造本发明的外用敷料的方法，其特征在 于，该方法包括W下步骤：
[0017] (i)提供包含所述合成聚合物的溶液；
[0018] (i i)提供包含所述天然聚合物的溶液；
[0019] (iii)将步骤(i)的溶液、步骤(ii)的溶液W及去铁胺混合，形成纺丝原料液；
[0020] (iv)对所述纺丝原料液进行纺丝操作，形成所述由复合纤维形成的敷料。
[0021] 根据本发明的一个实施方式，对于所述步骤（i)，使用选自W下的溶剂形成溶液： 水、甲醇、乙醇、丙醇、下醇、二甲酸、乙酸、W及它们的混合物；W该步骤(i)形成的溶液的总 重量为基准计，该溶液中合成聚合物的浓度为2-15重量％。
[0022] 根据本发明的另一个实施方式，对于所述步骤（ii)，使用选自W下的溶剂形成溶 液:水、甲醇、乙醇、丙醇、下醇、二甲酸、乙酸、W及它们的混合物；W所述步骤(ii)形成的溶 液的总重量为基准计，该溶液中天然聚合物的浓度为0.5-5重量％。
[0023] 根据本发明的另一个实施方式，任选地，在所述步骤（ii)形成的溶液中加入酸或 碱来促进溶解;所述酸选自：甲酸、乙酸、丙酸、下酸、戊酸、己酸、乙二酸、丙二酸、戊二酸、己 二酸、盐酸、硫酸、硝酸、W及它们的混合物。
[0024] 根据本发明的另一个实施方式，将去铁胺加入所述步骤（i)或步骤（ii)制得的溶 液，然后进行所述步骤(i i i)的混合；
[0025] 根据本发明的另一个实施方式，W所述步骤（iii)形成的纺丝原料液的总重量为 基准计，该纺丝原料液中合成聚合物的浓度为优选为5-12重量％，更优选为7-10重量％，最 优选为8.8重量％; W所述步骤（iii)形成的纺丝原料液的总重量为基准计，该纺丝原料液 中天然聚合物的浓度为1-4重量％，优选为1.5-3重量，更优选为2重量％。
[0026] 根据本发明的另一个实施方式，对于步骤（iv)，所述纺丝操作是通过选自W下的 技术进行的:静电纺丝、无纺布技术，Ξ维编织技术。
[0027] 根据本发明的另一个实施方式，所述外用敷料的厚度为10-1000微米，优选为50- 800微米，更优选为200-600微米，更优选为500 ± 20WI1。
[0028] 根据本发明的另一个实施方式，所述外用敷料的牵张拉力强度为0.8-5M化，优选 为 1.81±0.28MPa。
[0029] 本发明的第Ξ个方面提供了本发明的外用敷料在制备治疗皮肤外伤的制品中的 应用，所述外伤包括普通外伤创口、难愈性创口、烧伤创口和糖尿病性创口。
【附图说明】
[0030] 在本发明中结合附图对本发明的原理和实施方式进行描述。
[0031] 图1A显示了在本发明中用于进行纺丝操作的静电纺丝设备；
[0032] 图1B显示了根据本发明一个实施方式制造的大块织物；
[0033] 图1C显示了从图2B的大块织物上切下的小块织物，其可W用作本发明的外用敷 料；
[0034] 图2A是根据本发明一个实施方式的敷料20,000倍放大的扫描电镜图；
[0035] 图2B是根据本发明一个实施方式的敷料10,000倍放大的扫描电镜图；
[0036] 图3是根据本发明一个实施方式的敷料的去铁胺释放曲线图；
[0037] 图4显示根据本发明一个实施方式的敷料的体外降解性能
[0038] 图5是根据本发明一个实施方式体外细胞培养的实验结果；
[0039] 图6是体外细胞培养实验得到的细胞毒性检测结果W及成血管特性检测图；
[0040] 图7显示分别使用对照敷料和本发明的敷料覆盖的糖尿病大鼠背部创面的愈合进 程；
[0041] 图8显示糖尿病大鼠创面皮肤组织切片H&E染色结果；
[0042] 图9显示根据本发明一个实施方式的敷料对VEGF蛋白表达的影响；
[0043] 图10显示根据本发明一个实施方式的敷料中去铁胺浓度与细胞毒性的关系。
【具体实施方式】
[0044] 在W下内容中将会对本发明进行进一步的详细描述。但是需要指出的是，W下的
【具体实施方式】仅仅W示例性的方式给出本发明的具体操作实例，但是本发明的保护范围不 仅限于此。本发明的保护范围仅仅由权利要求书所限定。本领域技术人员能够显而易见地 想到，可W在本发明权利要求书限定的保护范围之内对本发明所述的实施方式进行各种其 它的改良和替换，并且仍然能够实现相同的技术效果，达到本发明的最终技术目的。
[0045] 在本发明中，除非有相反的说明，所有的比例均为重量比，所有的百分数均为重 量百分数，溫度的单位为°C，压力的单位为帕。室溫指实验室内常规的环境溫度，随季节和 位置变化，通常为25Γ。另外，本发明描述的所有数值范围均包括端值并且可W包括将公开 的范围的上限和下限互相任意组合得到的新的数值范围。例如，如果公开了某种组分的重 量百分含量为10~30重量％，优选15~25重量％，更优选20~23重量％，则相当于同时公开 了 W下的数值范围：10~15重量％、10~25重量％、10~20重量％、10~23重量％、15~30重 量％、15~20重量％、15~23重量％、20~25重量％、23~25重量％。
[0046] 本发明使用去铁胺作为治疗活性组分，将其结合入纺丝原料液中，通过纺丝工艺 制备了含有去铁胺活性成分的织物敷料。
[0047]去铁胺具有W下式（1)所示的结构。目前本领域中尚无将去铁胺(DF0)固定在复合 纤维当中W用作固体敷料的活性组分的报道。
[004引
[0049] 式(1)去铁胺
[0050] 本发明的敷料是由复合纤维构成的织物的形式，在本发明中，敷料可W看作活性 组分去铁胺的载体或支架，因此在W下的说明书中，术语"敷料"、"织物"、"支架"和"载体" 可W互换使用，均用来表示本发明所述的敷料。另外，术语"纤维"和"纺丝"可W互换使用。 在W下的实施例中W聚乙締醇和壳聚糖作为所述合成聚合物和天然聚合物的具体例子，但 是也可W采用具有类似性质的其它合成聚合物和天然聚合物。
[0051] 本发明的敷料通过纺丝工艺制备。具体来说，将本发明所选择的合成聚合物、天然 聚合物各自制成在水或其它合适溶剂中的溶液的形式，然后将运两种溶液与去铁胺混合， 形成用于纺丝工艺的原料液。在制备所述聚合物的溶液的时候，可W根据需要在该溶液中 另外加入其他的添加剂，运些添加剂的例子包括W下的一种或多种:抑调节剂、稳定剂、分 散剂、增粘剂。根据本发明的一个实施方式，在用于纺丝工艺的原料液中，除了上述去铁胺、 天然聚合物和合成聚合物W外，不包含其他的组分。
[0052] 根据本发明的一个实施方式，所述去铁胺可W作为单独的组分与所述天然聚合 物的溶液W及合成聚合物的溶液混合。根据本发明的另一种实施方式，可W首先将去铁胺 加入所述天然聚合物的溶液W及合成聚合物的溶液中的任意一种当中，然后将所得的溶液 与另一种聚合物溶液相混合。
[0053] 在制备纺丝原料液之后，通过纺丝法将原料液纺织成本发明的敷料。所述纺丝技 术可W采用静电纺丝法、无纺布技术，Ξ维编织技术等进行，通过选择合适的纺丝技术W及 纺丝原料液中各种原料的种类和浓度，使得制得的织物产品具有一定机械强度、生物相容 性优良、可有效负载药物并能够按照所需的要求对活性成分进行梯度释放。在W下的实施 例中使用静电纺丝法，图1显示了一种常规的静电纺丝设备，该设备包括注射累、高压电源 和旋转接收板。所述注射累下方具有注射针头，高压电源一端与所述针头相连，另一端连接 旋转接收板并接地。在纺丝操作的过程中，预先配制的纺丝原料液从针头射出，在电场作用 下，针头处的液滴会由球形变为圆锥形（即"泰勒锥"），并从圆锥尖端延展得到纤维细丝。下 端的旋转接收板与电脑控制的机械移动装置相连，可W按照需要进行任意频率和幅度的旋 转、振动、平移等运动，使得来自注射累针头的纤维细丝在该旋转接收板上形成织物敷料产 品D
[0054] 虽然本发明实施例中具体结合静电纺丝对本发明的方法进行了描述，但是本发明 的保护范围并不仅限于运一种特定的纺丝工艺。
[0055] 下面将结合实施例具体描述本发明的技术方案。
[0化6] 实施例
[0057] W下合成实施例中所使用的去铁胺、聚乙締醇和聚壳糖均购自Sigma公司，其中聚 乙締醇为医用级，其聚合度为2400-2500，水解度为98.0-99.8mol %，壳聚糖为医用级，其去 乙酷度为90-95%;其余的化学试剂均为购自希格玛-艾尔德里奇(Sigma-Aldrich)等公司 的分析级试剂;所使用的水为去离子双蒸馈水。反应在常溫常压条件下进行。反应使用的静 电纺丝设备具有本发明图1所示的结构，其中高压电源购自天津东文公司，注射累购自保定 精工累业。
[005引实施例1:敷料的制备
[0059] 在该实施例中，制备医用级聚乙締醇在去离子水中的8重量％的溶液。独立地将 医用壳聚糖W2重量％的浓度溶于1重量％的乙酸水溶液中，向该壳聚糖溶液中加入预先计 算量的去铁胺固体粉末，形成壳聚糖溶液，所述去铁胺的加入量使得最终敷料中的去铁胺 含量占敷料固体总重量的1%。将W上所述制备的聚乙締醇溶液和壳聚糖溶液W4:6的重量 比混合，并置于注射累中。使用本发明图1所示的静电纺丝机，选用0.6mm不诱钢针头作为纺 丝喷射头并连接高压正电极，在距离针头8cm处设置旋转接收板。电压控制在12kV并保持室 溫25度，W〇.4mlA的速度进行电纺，得到本发明的敷料。
[0060] 另外，
【申请人】还重复上述步骤，改变去铁胺的加入量，得到了去铁胺浓度为0.3重 量％、0.6重量、0.8重量％、0.9重量％、1.0重量％、1.1重量％、1.2重量％的敷料，上述含量 基于产品敷料的固体总重量计。
[0061] 图1B显示通过本发明实施例1制得的织物，其厚度为500±20μπι;该大块织物切割 成图1C所示的小块织物，用于随后的试验和表征。可W根据需要将上述大块织物或切割后 的小块织物用作敷料。图2Α和2Β分别显示了 20000倍和10000倍放大倍数之下本发明敷料的 扫描电镜（FEI，USA)图像，从图中可W看到，纤维直径较为统一，纤维的直径为716.5± 76. Inm，并随机连接成网状结构。DF0能够很好地溶于纳米纤维内，没有明显杂质及液滴出 现。经测量(光学接触角测量仪;Kruss，Germany)水接触角（WCA)为0°，显示出良好的亲水 性。支架的牵张拉力强度为1.81±0.28MPa，其力学性能可用于皮肤的缝合覆盖。
[0062] 实施例2:对照敷料(不含去铁胺的敷料）
[0063] 在本实施例中，重复实施例1的制备步骤形成敷料，但是区别在于，原料中未使用 去铁胺，制得的敷料记作对照敷料。
[0064] 实施例3:在此实施例中，使用W上实施例1制备的具有不同去铁胺含量的本发明 敷料进行了 VEGF蛋白表达性能的测试。
[0065] 样品培养
[0066] 将DF0含量为0.8、0.9、1.0重量％的敷料剪切成15x15毫米2大小的方块预置于6孔 板底，按2xl05细胞密度接种皮肤成纤维细胞，放置于37 °C、5 % C〇2培养箱中解育，隔天更换 培养基。于培养细胞生长的第3天提取细胞中的蛋白，每次每组至少3个样本，重复3次。
[0067] 蛋白提取
[0068] 提取蛋白的步骤如下：
[0069] (1)6孔板每孔细胞加入10化1 RIPA(B巧otime，化ina)和化1蛋白酶抑制剂PMSF (Beyotime，China))，放置于冰上。
[0070] (2)用细胞刮仔细刮取细胞，将细胞转移至0.5ml离屯、管中，冰上放置30分钟。
[0071] (3)使用12000g 转速高速离屯、机，（Allegra X-22R Centrifuge, Beckman Coulter, USA)在4°C离屯、15分钟，收集上清液、小屯、转移至无菌离屯、管中，-80°C保存备用， 此即为细胞总蛋白。
[007。蛋白浓度测试
[0073] 从上述细胞总蛋白中取出一部分，按如下步骤，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋 白浓度：
[0074] ①按试剂盒(B巧otime化ina)说明书将A液和B液W50:1的比例配制成工作液；
[0075] ②取2000μg/ml的BSA标准品，用PBS(抑 7.4)稀释成2000μg/ml、1500μg/ml、ΙΟΟΟμ g/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、25μg/ml、10μg/ml 共 9 个浓度梯度；
[0076] ③取蛋白提取液10μ1，用PBS稀释10倍；
[0077] ④每管中加10化1蛋白标准品或稀释后的组织蛋白提取液，再加上述工作液2ml， 37°C解育30分钟，562nm处测吸光度，记录0D值；
[0078] ⑤根据0D值及蛋白标准品浓度绘制标准曲线，计算样品总蛋白浓度。
[0079] 璧度
[0080] 蒸馈水清洗灌胶玻璃板，竖直惊干。配制10 %分离胶10ml，加 TEMED化1、10 % APS 15化1，混匀后立即灌胶，灌至齿梳下缘2~3mm(事先做好标记），用异丙醇封闭液面W去除 气泡并隔绝空气，室溫静置45分钟待胶完全聚合。待分离胶完全聚合后，倾去其顶部的去离 子水，用滤纸将水吸干。配制5 %浓缩胶6ml，加 TEMED化1、10 % APS 6化1，混匀立即灌胶，灌 至顶部，并垂直插入Teflon齿梳，室溫静置20分钟待胶聚合。待胶完全聚合后拔出梳子，将 凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，用电泳缓冲液冲洗上样孔W去除气泡。
[0081 ]里遂(电泳仪，Bio-Rad, USA)
[0082]取上述分离的各蛋白提取液，调整蛋白浓度，和等体积5 X上样缓冲液混合，即为 上样液。将上样液于100°C解育器中煮沸5分钟，使蛋白变性，冰上骤冷，3000转/分钟离屯、1 分钟。每孔加上样液20yg，留一孔加10μ1预染的Marker (Thermo，USA)。加满电泳缓冲液，盖 上槽盖，接通电源，先用70V恒压电泳，约30分钟，当指示剂漠芬兰进入分离胶后改用90V恒 压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。
[008引转印蛋白及免疫检测
[0084] 在电泳即将结束前，预先将PVDF膜(Millipore，Germany)浸泡在甲醇中15秒，然后 用双蒸馈水漂洗2分钟，浸泡于转移缓冲液中5分钟后开始后续操作。在水中擦胶，修胶后将 胶浸泡于转移缓冲液中平衡15分钟。按黑面(负极海绵^滤纸^胶^PVDF膜^滤纸^海 绵^红面(正极）的顺序制备转膜"Ξ明治"，每层铺好后先赶走气泡再铺另一层。在转移缓 冲液中制备Ξ明治可避免气泡的产生。接上正负极，按膜向正极的方向将转移盒(Bio-Rad， USA)放入电转仪中，加入转膜缓冲液。将电转仪置于冰水中，200mA恒流转膜90分钟。转膜结 束后，快速取出PVDF膜，放入5 %脱脂牛奶液室溫封闭1小时。取出膜，于摇床上用TBST洗膜5 分钟X3次。解育袋中加入封闭液稀释（1:1000)的VEGF抗体(Novus，USA)(-抗)和按1:5000 稀释的GAPDH抗体(康为世纪，中国），4°C解育过夜。TBST洗膜5分钟X 3次后，加入辣根过氧 化物酶化RP)标记的、按1:5000稀释的抗小鼠二抗(A化kine，USA)，室溫解育2小时。TBST洗 膜 15分钟 X3次。于Image Quant LAS 4000mini机器内显影，显影液(Millipore Germany) 为Mi 11 ipore A、B液按1:1比例配制，反应2分钟，取出膜，甩去多余的液体，滴加检测试剂， 感光、显影、定影。
[0085] VEGF蛋白表达的测试结果如图9所示。VEGF蛋白高表达是促进血管生成的必要条 件。从图9可W看到，随着DF0含量的增加，VEGF表达量逐渐增高，促进血管新生。
[0086] 实施例4:敷料中去铁胺的含量与敷料生物毒性的关系
[0087] 将不同DF0含量的敷料分别剪切成lOxlOmm2大小的方块并置于24孔培养板底，按 照5xl04皮肤成纤维细胞浓度接种细胞，放置于37°C、5%C02培养箱中解育，隔天更换培养 基。于第3天随机取出24孔板，去除原有培养基并加入含有CCK-8(Cell Counting Kit-8; Dojindo Kagaku Japan)的培养基(每1ml新鲜培养基内含有100ylCCK-8溶液）；恒溫培养箱 37°C、5%C02解育两小时后，使用酶标仪在450nm波长处检测吸光度值。每次取至少3个样本 进行检测并重复3次。结果如图10所示。
[008引从图10的结果可W看到，当敷料中DF0浓度在0.8wt %、0.9wt %、1. Owt %时，与空 白对照组相比，药物没有明显细胞毒性。然而，当DR)浓度继续增高时，细胞增殖明显受到抑 审IJ，提示药物浓度过高，抑制细胞生长、增殖。因此，选用l.Owt%的敷料，细胞毒性小并能够 有效刺激成纤维细胞分泌VEGF，促进血管生成。
[0089] 实施例5:去铁胺释放性能的表征
[0090] 在该实施例中使用W下步骤测试了去铁胺从敷料释放的性能：
[0091] 将10X10毫米2大小的敷料（纤维支架，去铁胺含量Iwt%)完全浸泡于10ml IX PBS溶液中（pH 7.4,室溫)并持续揽拌5天W确保支架所载药物能够最大限度释放。由于静 电纺丝支架特有的高孔隙率，在PBS中浸泡12小时后可吸收315.8 ± 59.3 %的1 xPBS溶液，显 示出较强的吸水性。
[0092] 吸取少许溶液并加入FeClsW便与溶液中的DF0结合。应用Evolution?300型 (Thermo Fisher，USA)紫外可见分光光度计，在485nm波长处测量0D值并与DF0标准曲线对 比得出溶液中DF0含量。与理论载药量进行对比，得出载药效率。用上述相同方法预处理支 架并在在预设时间点吸取少许量的溶液测量并换算得出不同时间点的DF0释放量，每次药 物释放实验取至少3个样本并重复3次，取平均值绘制药物缓释曲线。实验结果见图3。从图3 的释放曲线可W看到，本发明的敷料能够在72小时内近似实现100%的释放，而且前24小时 的释放量高达80% W上，由此满足伤口恢复所需的释放性能要求。
[0093] 实施例6:本发明敷料的体外降解性能检测：
[0094] 按照O.lcnfi面积/体积比将支架置于1XPBS(抑7.4,37°C)中，并在预设时间点收 取样本。每组Ξ份样品在4(TC环境中烘干并称重，随后放置在37Γ保溫箱内保存。每次测 量前，将样本从保溫箱取出并再次烘干(4(TC)。基于重量损失情况的降解指数(Di)通过W 下公式计算获得：
[0095]
[0096] 在该公式中，Wo代表支架原始重量，Wt代表不同浸泡时间点（t)的支架重量。每组每 次降解实验选用至少3个样本并重复3次，取平均值绘制图表。敷料降解速率及其变化状况 如图4所示。在体外，敷料置于PBS中6天后，其干重约为初始重量的60% (即在体外约有40% 的材料被降解），且在6天后表现有快速降解的趋势;敷料置于PBS中8天后，其干重约为初始 重量的30%(即在体外约有70%的材料被降解）；敷料置于PBS中10天后，其干重不足初始重 量的10% (即在体外90% W上的材料被降解）。由于该敷料内的亲水基团增强支架整体亲水 性，使其能够快速降解并预留出足够的空间为新生组织长入提供条件。
[0097] 实施例7:敷料对细胞生长的影响
[0098] 在该实施例中，通过W下步骤检测本发明的敷料对人原代表皮细胞株和人厮静脉 内皮细胞株生长的影响。
[0099] 24孔板内放置细胞爬片，冰上操作将不含生长因子的基质胶均匀铺于细胞爬片 上，恒溫培养箱37 °C、5 % C〇2解育1小时后，将24孔板取出，每孔6x 104HUVEC(人厮静脉内皮细 胞)铺于基质胶上，随后置入〇.4μηι的transwell，将本发明实施例1制备的包含Iwt%去铁胺 (DF0)的灭菌敷料(纤维支架)剪切成10X 10mm2大小的方块并置于上室。选用含有10%胎牛 血清和1 %双抗的DMEM高糖培养基进行细胞培养。在37 °C、5 % C〇2解育4小时、12小时后分别 取出24孔板，去除化answell及敷料(纤维支架），PBS清洗3次，每次10分钟，4%多聚甲醒固 定15分钟。ZEISS Imager MUGermany)光学显微镜拍摄照片，如图5所示。
[0100] 为检测敷料中的DF0能否有效释放并促进成血管，我们在体外利用皿VEC进行小管 成形试验并与对照组作对比。如图5所示，支架组的册VEC被干预4小时后细胞逐渐聚集成 团，并有细管状结构出现，而对照组的细胞仅聚集，未见明显大量细管结构出现;干预24小 时后，支架组细胞聚集形成大量增粗的小管并彼此汇聚成网，而对照组细胞由于缺乏有效 的成血管刺激物刺激，虽然在基质胶环境中也能聚集并有管状结构出现，但小管结构松散 且不能有效汇聚成网。该结果提示载药支架能够释放DF0有效刺激HUVEC体外成管。
[0101] 实施例8:本发明敷料的毒性和生物相容性检测
[0102] 在该实施例中，按照W下步骤检测本发明实施例1制备的包含Iwt%去铁胺的敷料 W及不含去铁胺的对照敷料的毒性和生物相容性。
[0103] 将敷料剪切成10 X 10mm2大小的方块并置于24孔板内，按照5x104WB细胞浓度铺 板，放置于37°C、5 % C〇2培养箱中解育，选用含有10 %胎牛血清和1 %双抗的DMM高糖培养 基进行细胞培养。隔天更换培养基(成分同上）。分别于第1、2、3天随机取出24孔板，去除原 有培养基并加入含有CCK-8化ojindo Kagaku，日本)的培养基(每1ml新鲜培养基内含有100 ylCCK-8溶液）。恒溫培养箱37°C、5%C02解育两小时后，使用酶标仪在450nm波长处检测吸 光度值。每次取至少3个样本进行检测并重复3次。结果如图6所示，从图6可W看到，与对照 样相比敷料无毒性且具有良好的生物相容性。
[0104] 实施例9:本发明敷料对糖尿病大鼠皮肤缺损的治疗效果
[0105] 在该实施例中，分别使用本发明实施例1制备的包含Iwt%去铁胺的敷料W及不含 去铁胺的对照敷料对糖尿病大鼠的治疗效果。
[0106] 本实验使用的8周龄斯普拉格-杜勒鼠（SD大鼠）由上海SLAC实验动物公司购得。大 鼠每3只一笼饲养，自由进食水;饲养室溫度控制在22±2°C。经过两周的适应后，随机选取 300-350g大鼠诱导I型糖尿病模型。按照70mg/kg腹腔注射预配好的STZ溶液(Sigma，美国）。 每周通过鼠尾采血检测血糖水平。连续六周血糖水平持续保持在300mg/dl的大鼠被认定为 诱导成功的I型糖尿病大鼠。
[0107] 大约24只I型糖尿病大鼠被随机选出。按照0.3ml/100g的液体量通过腹腔内注射 2.5%戊己比妥钢进行全身麻醉。固定大鼠，使用动物电动剌毛器剌除大鼠背部皮肤，并用 无刺激性脱毛膏进一步脱毛，充分暴露手术区域。70%消毒手术区，铺无菌巾，使用角膜环 钻(上海金钟)在背部中线两侧钻得15mm大小的圆形全皮层缺损，深度达到肌膜上。裁剪相 同直径大小的敷料，覆盖于一侧创面，并用4-0缝合丝线固定。随后使用无菌纱布覆盖背部 并固定，防止大鼠撕咬致其脱落。全部手术操作均在无菌条件下进行。术后大鼠进行单独饲 养，并使用1预先测量好直径的钥匙环作为对比环。动态观察创面愈合情况。术后大鼠伤口 1 周（1W)、2周（2W)和3周（3W)的照片如图7所示。一周后，敷料组创面较对照组愈合速度明显 加快，两组间差异明显；两周后，敷料组创面基本愈合，对照组直至实验最终时间点（Ξ周） 结束尚未完全愈合。
[0108]另外，于术后第1、2、3周收取创面及创面周围3mm正常皮肤组织在内的完整标本。 使用4 %多聚甲醒固定过夜。自动脱水机(0XIS LX120型;Lei ca，Germany)程序脱水，石蜡包 埋，切片(5μπι)。切片于60°C恒溫箱烤片过夜。按照W下步骤对该切片进行处理：
[0…9] H&E染色
[0110] (1)切片脱蜡:二甲苯I、二甲苯Π 脱蜡各30分钟。
[0111] (2)水化：纯酒精15分钟；纯酒精Π 5分钟；95 %酒精15分钟；95 %酒精Π 5分钟； 80 %酒精5分钟;70 %酒精5分钟；自来水中浸泡5分钟。
[0112] (3)浸入苏木素染液内6分钟。自来水洗净苏木素。
[0113] (4)1%盐酸酒精分化10秒。自来水浸泡6分钟（中间换水一次)至充分蓝化。
[0114] (5)伊红溶液染色2分钟，85 %、95%、95 %、100%、100 %乙醇中分别洗1分钟，去除 多余伊红。
[0115] (6)二甲苯透明1分钟，中性树胶封片。
[0116] (7)显微镜下观察并拍片，显微照片如图8所示。
[0117] 结果分析：
[0118] 我们选用新生表皮爬行距离运一客观的指标来了解创面愈合情况。选用包含3mm 正常皮肤组织的全层创面纵向石蜡切片进行H&E染色，观察固定时间点的愈合情况。如图8 所示，创面形成一周后，敷料组创面处肉芽组织增生明显，上皮化进程加快；同时，敷料已大 部降解，仅在创面中屯、有少量残留；二周后，敷料组创面肉芽组织较对照组明显增厚，质量 更好，新生上皮覆盖绝大部分创面;形态学切片上已无法有效观察到敷料结构，提示敷料已 完全降解。Ξ周后，敷料组创面已完全愈合，肉芽组织形态接近正常组织。而对照组上皮化 进程仍较缓慢且肉芽组织薄弱易碎，提示愈合质量较差。
【主权项】
1. 一种外用敷料，该外用敷料由复合纤维形成，所述复合纤维包含： A. 合成聚合物，该合成聚合物选自聚乙烯醇、聚已内酯、硅橡胶、聚氨酯、聚酯纤维、聚 乙烯基吡咯烷酮、聚醚醚酮、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸、聚乙烯、以及它们的组合； B. 天然聚合物，该天然聚合物选自壳聚糖、纤维素、透明质酸、胶原蛋白、明胶、海藻酸 钠、以及它们的组合； C. 去铁胺。2. 如权利要求1所述的外用敷料，其特征在于，以所述复合纤维的总重量为基准计，所 述去铁胺的含量为〇. 8-1.05重量％，优选为0.9-1.03重量％，更优选0.95-1.02重量％，更 优选为〇. 99-1.01重量％，最优选为1重量％。3. 如权利要求1所述的外用敷料，其特征在于，以所述复合纤维的总重量为基准计，所 述合成聚合物的含量为1-98重量％，优选5-90重量％，更优选10-85重量％，更优选20-70重 量％，更优选30-60重量％，更优选40-55重量％ ;所述天然聚合物的含量为1-98重量％，优 选5-90重量％，更优选10-85重量％，更优选20-70重量％，更优选30-60重量％，更优选40-55重量％; 所述合成聚合物是聚乙烯醇，其聚合度为2400-2500，水解度为98.0-99.8mol % ;所述 天然聚合物是壳聚糖，其分子量为10，000-200，000，优选为30，000-80，000，更优选为40， 000-70，000，脱乙酰度为90-95%。4. 如权利要求1所述的外用敷料，其特征在于，所述复合纤维的直径为50纳米至50微 米，优选为100纳米至1000微米，更优选为500-900纳米，更优选为600-800纳米;所述复合纤 维的水接触角为0-5度，优选为0-2.5度，更优选为0度。5. -种用来制造如权利要求1-4中任一项所述的外用敷料的方法，其特征在于，该方法 包括以下步骤： (i)提供包含所述合成聚合物的溶液； (i i)提供包含所述天然聚合物的溶液； (i i i)将步骤(i)的溶液、步骤(i i)的溶液以及去铁胺混合，形成纺丝原料液； (iv)对所述纺丝原料液进行纺丝操作，形成所述由复合纤维形成的敷料。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，对于所述步骤(i)，使用选自以下的溶剂形成 溶液:水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、二甲醚、乙醚、以及它们的混合物；以该步骤（i)形成的溶 液的总重量为基准计，该溶液中合成聚合物的浓度为2-15重量％ ; 对于所述步骤（ii)，使用选自以下的溶剂形成溶液：水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、二甲 醚、乙醚、以及它们的混合物；以所述步骤（ii)形成的溶液的总重量为基准计，该溶液中天 然聚合物的浓度为0.5-5重量％ ; 任选地，在所述步骤（ii)形成的溶液中加入酸或碱来促进溶解;所述酸选自：甲酸、乙 酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乙二酸、丙二酸、戊二酸、己二酸、盐酸、硫酸、硝酸、以及它们的 混合物； 将去铁胺加入所述步骤(i)或步骤(ii)制得的溶液，然后进行所述步骤(iii)的混合； 以所述步骤（iii)形成的纺丝原料液的总重量为基准计，该纺丝原料液中合成聚合物 的浓度为优选为5-12重量％，更优选为7-10重量％，最优选为8.8重量％ ;以所述步骤(iii) 形成的纺丝原料液的总重量为基准计，该纺丝原料液中天然聚合物的浓度为1-4重量％，优 选为1.5-3重量，更优选为2重量％。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，对于步骤（iv)，所述纺丝操作是通过选自以 下的技术进行的:静电纺丝、无纺布技术，三维编织技术。8. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述外用敷料的厚度为10-1000微米，优选为 50-800微米，更优选为200-600微米，更优选为500 ± 20μπι。9. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述外用敷料的牵张拉力强度为0.8-5MPa， 优选为 1.81 ±0.28MPa。10. 如权利要求1-4所述的外用敷料在制备治疗皮肤外伤的制品中的应用，所述外伤包 括普通外伤创口、烧伤创口、难愈性创口和糖尿病性创口。
【文档编号】A61L15/42GK105999359SQ201610393435
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】邓廉夫, 陈皓, 齐进, 崔文国
【申请人】上海市伤骨科研究所