用于光学层析成像的景深扩展的制作方法

专利名称：用于光学层析成像的景深扩展的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及光学层析成像系统，以及更具体地说，涉及光学投影层析成像，其 中，小的目标诸如生物细胞位于毛细管中，便于由显微镜成像。
背景技术：
已经由Nelson提出了在使用光学层析成像对生物细胞成像的方面的进展，如在 例如 2003 年 2 月 18 曰公布的题目为"Apparatus and methodfor imaging small objects in a flow stream using optical tomography" ^ US No. 6, 522, 775 ^Pfi7AJf ^i, 其全部内容在此引入以供参考。在Fauver et al.，2003年11月18日提交的US申请 号10/716，744，并在2004年4月22日公布为US公开No. US-2004-0076319-A1,题目为 "Methodand apparatus of shadowgram formation optical tomography，， (Fauver '744) 以及Fauver et al.，2006年9 月 18 日提交的，题目为“Focal planetracking for optical microtomograhy”的US专利申请号11/532，648 (Fauver ‘648)中教授了这一领域的进一步 发展，其全部内容在此引入以供参考。该光学层析成像系统中的处理以标本制备开始。典型地，从医院或诊所接收从病 人提取的标本并处理以便消除非诊断要素、定影然后染色。然后，将染色的标本与光学凝胶 混合，插入微毛细管中，以及使用光学层析成像系统来产生标本中的目标诸如细胞的图像。 最终图像包括来自于被称为“伪投影图像”的不同的视点的扩展景深图像集。使用背投影 和过滤技术，能重构伪投影图像集，以便产生感兴趣的细胞的3D重构。然后，3D重构可用于分析，以便实现构造、分子或感兴趣的分子探针的位置的量化 和确定。可以用至少一个染色剂或带标签的分子探针标记诸如生物细胞这样的目标，以及 该探针的测定量和位置可以产生与细胞的疾病状态有关的重要信息，包括但不限于各种癌 症，诸如肺、胸、前列腺、宫颈和卵巢癌。在所述的光学投影层析成像显微镜(OPTM)系统中，例如，在Fauver ‘648中，要求 180度旋转采集约250个样本来充分地采样在50微米毛细管内的流动流中随机分布的细胞 核的体积。本公开内容提供用于提供更高分辨率和改进信噪比以便在保持可接受分辨率的 情况下，能降低采样需求的新的和新颖的技术。在一种光学层析成像系统中，如在Fauver ‘744中描述并由VisionGate，Inc.构 造的，通过横跨物镜扫描容纳标本的毛细管而扩展成像光学元件的景深。压电换能器(PZT) 致动器每秒横向正弦地移动物镜若干次，以便通过标本扫描一系列焦平面。通过使用PZT 致动器来移动物镜，移动通过标本的焦平面具有被在通过标本，沿光轴快速移动物镜质量 中固有的惯性所限制的速度。通常，扫描率的上限为每秒约60周。通过良好同步的旋转和 物镜扫描，能在PZT致动器的上冲程和上冲程获取图像，允许获取每秒达120个图像。这是 有用的采集率，同时，通过在此公开的装置、系统和方法，能显著地提高。
用光源照射光学投影层析成像系统。目标容纳管，其一部分位于受光源照射的区 域内，容纳至少一个感兴趣的目标，该目标具有至少一个感兴趣的特征。放置至少一个检测 器以便从感兴趣的目标接收出现的辐射。透镜，包括光场扩展元件，位于目标区域与和检测 器之间的光路中，从而来自于目标容纳管中的多个物面的光线同时聚焦在该至少一个检测 器上。目标容纳管相对于至少一个检测器移动，并且透镜操作以提供目标区域的多个视图， 用于在每一视图产生至少一个感兴趣的特征的至少一个图像。


图1示意性地表示用于多色差光学透镜系统的设计的例子。图2A-图2D示意性地表示当在四个单独的像面上估算时，用于四种波长的每一个 的模拟单色调制传递函数(MTFs)的定性例子。图3A-图3D示意性地表示当在四个单独像面上估算时，在波长范围上的模拟多色 调制传递函数的定性例子。图4A示意性地表示在包含多色差光学透镜的光学层析成像系统中，一个视角的 目标空间的详情。图4B示意性地表示在图4A中示意性地描述的光学层析成像系统的操作。图4C示意性地表示在包含多色差光学透镜的光学层析成像系统中，第二视角的 目标空间的详情。图4D示意性地表示图4C中示意性地描述的光学层析成像系统的操作。图5示意性地表示用于彩色滤光器阵列的设计的例子。图6A示意性地示例说明与包含彩色滤光器阵列的多色差光学层析成像系统有关 的第一视角。图6B示意性地示例说明与包含彩色滤光器阵列的多色差光学层析成像系统有关 的第一视角。图7A示意性地示例说明与包含长景深的多色差光学层析成像系统有关的第一视 角的目标空间。图7B示意性地示例说明与包含长景深的多色差光学层析成像系统有关的第一视图7C示意性地示例说明与包含长景深的多色差光学层析成像系统有关的第二视 角的目标空间。图7D示意性地示例说明与包含长景深的多色差光学层析成像系统有关的第二视图8A示意性地示例说明与包含多检测路径的多色差光学层析成像系统有关的第 一视角。图8B示意性地示例说明与包含多检测路径的多色差光学层析成像系统有关的第 二视角。图9示例说明MTF范围中焦点不变的例子。图10表示用于查找焦点不变光学层析成像系统中的焦点不变区域的中点的方法的框图。图IlA表示用于查找焦点不变光学层析成像系统中的焦点不变区域的中点的另 一方法的框图。图IlB表示用于查找焦点不变光学层析成像系统中的焦点不变区域的中点的又 一方法的框图。图12示意性地描述使用色平衡的自动聚焦系统的实施例。图13表示使用具有空间频率过滤的两种光电二极管，查找焦点不变光学层析成 像系统中的焦点不变区域的中点的另一方法。图14示意性地表示用于焦点不变光学层析成像系统中的2. 5D成像的方法的框 图。图15示例说明允许在单一照相机上同时成像两个焦平面的折叠光学系统的例子。图16示意性地示例说明用于获取光学层析成像系统中的焦平面范围的多照相机 设备。图17示例说明包括波前编码光学元件的OPTM系统的示意图。在图中，相同的参考数字表示类似元件或部件。图中的元件的大小和相对位置不 一定按比例绘制。例如，各种元件的形状和角度不是按比例绘制，以及这些元件中的一些是 任意放大和放置以提高绘图清晰度。此外，如绘制的元件的特定形状不传达与特定元件的 实际形状有关的任何信息，仅为了图中便于识别而选择的。
具体实施例方式下述公开内容描述用于成像感兴趣的目标的几个实施例和系统。在图中提出和描 述了根据本发明的示例性实施例的方法和系统的若干特征。将意识到根据本发明的其他示 例性实施例的方法和系统能包括与图中所示不同的另外的过程或特征。在此参考生物细胞 描述示例性实施例。然而，将理解到这些例子仅是用于示例说明本发明的原理的目的，而不 是限制本发明。另外，根据本发明的许多示例性实施例的方法和系统可以不包括这些图中示出的 所有特征。在整个图中，相同的参考数字表示相似或相同的部件或过程。除非上下文要求，在整个说明书和权利要求书中，词“组成”将在开放、包括含义上 解释为“包括，但不限于”。在整个说明书中，参考“一个例子”或“示例性实施例”、“一个实施例”、“实施例”或 这些术语的各种组合是指结合实施例描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少 一个实施例中。因此，在整个说明书中的不同地方出现的短语“在一个实施例中”或“在实 施例中”不一定均参考同一实施例。此外，在一个或多个实施例中，可以用任何适当的方式 组合特定特征、结构或特性。定义一般如在此所使用的，当在光学显微镜过程的上下文内使用时，下述术语具有下 述含义“毛细管”具有其一般可接受含义并且意图包括透明微毛细管和具有100微米或更小内部直径的等效的产品。“景深”是在生成不可接受的图像模糊前，可以在其内平移焦平面的沿光轴的长度。“目标”是指单个细胞或其他实体。“伪投影”包括表示比光学元件的固有景深大的采样体积的单个图像。“标本”是指从单次测试获得的成品或来自单个病人的过程(例如提交用于分析的 唾液、活组织检查或鼻拭子)。标本可以由一个或多个目标组成。标准诊断的结果变为病例 诊断的一部分。“样本”是指为分析而准备的现成细胞制品，包括全部或部分等分试样或标本。色差景深扩展大多数简单的透镜将产生称为色焦点位移的波长相关焦点位置。色差在透镜中通 常是不期望的。然而，为生物样本中足够宽的吸收光谱，色差的色散实际上能扩展吸收目标 或特征的景深图像。波长相关透镜材料将产生具有色差的透镜。几乎所有的透镜材料均能具有波长 的正和负指数平移。透镜设计者通常选择透镜材料来补偿色焦平面位移，导致接近零的净 色焦点位移。例如见T Suzuki，1996年5月14日公布的US专利No. 5，517，360，题目为 "Immersion microscopeobjective (浸没显微镜物镜)”，浸没显微镜物镜用于校正球面和 轴向色差。改变设计参数来强调而不是最小化色焦点位移能在光路中产生大的色差或多色 差(hyperchromatic aberration)。这种多色差能同时将多个焦深聚焦在检测器上，在目标 内每一光波长在单独焦平面的检测器上形成图像。这加宽了有限所需波长范围上的焦点位 置的范围。对于染色或造影剂中具有窄的吸收峰值的标本，能将透镜设计成包括光场扩展 元件以便在很多微米上扩展色散来形成用于窄波长范围的扩展景深光学系统。选择光学部 件和材料来优化染色吸收范围内的色散。当利用色差时，可能有利的是，变更光谱分量的相对构成以补偿可能影响图像的 组成。这些可以包括但不限于造影剂或染色剂的波长相关性、照相机响应和光学材料的透 射。光谱分量可以通过例如在照明、聚光和/或成像光学元件中包含衰减一些波长大于其 他的波长的滤光器来被变更。例如，对容纳诸如苏木精系列的染色剂这样的现有染色剂吸收曲线的窄的波长范 围，能实现景深的有限扩展。苏木精系列中的染色剂显示出在从550至620纳米的波长范 围中的峰值吸收。例子 1在图1中描述了多色差物镜103的一个例子，适合于用在多色差系统中。该复合 透镜包括8个光学元件1-8，其中，光学元件1和2胶合在一起形成第一双合透镜，光学元件 3和4胶合在一起形成第二双合透镜，5和6胶合在一起形成第三双合透镜，以及7和8胶 合在一起形成第四双合透镜。1的第一表面是平的或稍微凸，以便当该表面与浸液诸如油或 水接触时，避免在空腔中吸入空气。用于物镜103的示例性规定如下。 可以选择孔径光阑的位置以提供远心，以及最小化横向色差(也称为放大率色 差)。部件材料商业上可从例如Schott North America, Inc. Elmsford, NY 10523获得。如参考图在下述例子中所示，当透镜系统103被放在具有180mm的焦距的管透镜 前时，假定第一元件1的前表面与位于透镜的视场中的盖片的顶部之间的空间充满水，透 镜系统103将在从550nm至620nm的波长范围上，以等于0. 9的数值孔径(NA)提供60X 放大率。盖片通常约130微米厚，而盖片和透镜之间的充满水的空间可以约为200微米厚。 在200微米直径视场上，以单独波长在15微米的范围上，目标被聚焦在照相机的成像面上。 在该示例性实施例中，第一平面中的目标部分由入射光的550nm部分聚焦，位于低于第一 平面下5微米的第二平面由入射光的573nm部分聚焦，位于第一平面下10微米的第三平面 由入射光的579nm部分聚焦，以及位于第一平面下15微米的第四平面由入射光的620nm部 分聚焦。系统MTF现在参考图2A至图2D，如在四个单独的像面上估算的，用于四个波长的每一个的 模拟单色调制传递函数(MTF)的定性例子。在图2A至图3D中，垂直轴表示系统MTF以及 水平轴表示从0到截止频率fc的频率，其中fc是具有非零MTF的最高频率。与图2中所 示类似的MTF原理上能通过如下所述来测量，即，将2D光学测试对象放在物空间中，用具有 约550nm的波长的窄带光照射，以及找出最佳焦点。将波长改变成约573nm并使焦点位置 移动5微米可以产生图2B中所示的MTF。对约597nm和另外对约620nm重复这一过程分别产生图2C和图2D中所示的MTF。对于达15微米的目标厚度，可以同时采集来自目标的整 个体积的焦点对准信息。 现在参考图3A至图3D，对其中照射由约550nm和620nm之间的波长带组成的光学 投影系统，示出了模拟多色差调制传递函数(MTF)的定性例子。与图3A中所示类似的MTF 原理上能通过如下所述来测量，即，将2D光学测试对象放在物空间中，用具有约550-620nm 的波长带宽的宽带光照射，以及找出最佳焦点，Δζ = 0ο将焦点位置移动5微米到焦点Δ ζ =0微米定性地产生图3Β中所示的MTF。使焦点位置移动10微米，Δ ζ = 10微米，以及移 动15微米，Δ ζ = 15微米分别定性地产生图3C和图3D中所示的MTF。应理解，在不脱离 该实施例的精神的情况下，可以采用其他规定和光学设计。多色差光学系统可以有利地包含在OPTM系统中。平移设备，诸如压电换能器 (PZT)可以被用来在360度扫描集的过程上应用物镜的单一、低速平移。透镜平移使感兴趣 的目标保持在约15微米的焦点间隔内，即使当管旋转使目标在360度扫描期间，沿光轴平 移差不多旋转毛细管的内部直径。与先前的实施例相比，不再需要在每一视点进行的高速 扫描。因此，图像采集速度不再受PZT平移设备的速度限制。另外，管旋转和透镜的平移运 动之间的同步不再需要精确，由此降低了 OPTM仪器控制系统的复杂度。现在参考图4Α，示意性地表示包含多色差光学透镜的光学层析成像系统中，以一 个视角的物空间的细节。细胞114位于微毛细管107内的第一物面Zl和第二物面Ζ2之间。 管107可以具有例如50微米的内直径以及第一物面和第二物面之间的间隔可以是例如15 微米。微毛细管107最好填充使固有指数与管的折射率匹配的光学匹配介质123。在一个示例性实施例中，组件121最好包括微毛细管107，该微毛细管107位于可 以包括标准载玻片的第一光学平面120和可以包括标准显微镜盖片的第二光学平面108之 间的可见区域中。管107和平面108，102之间的间隙填充光学油124或等效物，具有基本 上与管107、平面108，120和光学胶123匹配的折射率。组件121能安装在显微镜上，以及 由例如油、水或空气组成的光学浸液109位于组件121的面对多色差光学元件的一侧(如 图4Β所示)。管107的外直径可以是例如250微米，盖片108的厚度可以是约170微米，以 及浸液109的厚度可以在100和300微米之间。具有在第一波长λ 1 (例如λ =约550nm)和第二波长λ 2 (例如，λ 2 =约620nm) 之间的波长的宽带光130通过例如聚光透镜系统透射到管107中。具有波长λ 1的光的第 一射线路径集105从第一物面Zl传播并进入浸液109。具有波长λ 2的光的第二射线路径 集106从第二物面Ζ2传播并进入浸液109。尽管在图4Α中未描述，但应理解到，具有波长 λ η的光沿与105和106类似的射线路径，从位于第一物面和第二物面之间的中间物面Zn 传播，其中，λη是λ 和λ 2之间的波长。参考图4Β，可以更全面地理解该系统的操作。彩色滤光器110和聚光透镜115提 供具有所需上下波长限(λ 1，λ 2)的照明130F。入射光通过容纳例如生物细胞114的管组 件121。具有波长λ 1和λ 2并分别在物面Zl和Ζ2在细胞114附近开始的射线路径105 和106通过浸液109和多色差物镜系统103，并且当它们达到管透镜111时基本上被准直。 然后，它们通过例如具有约ISOnm的焦距的管透镜111，并在CXD照相机112的像面104上 实现焦点Α。物镜103被安装在PZT 113上，能使物镜103远离管透镜111和更靠近物面 Zl 禾口 Ζ2。
具有波长λ η的光沿与105和106类似的射线路径，从位于平面Zl和平面Ζ2之 间的中间物面Zn传播，还到达像面104上的焦点，其中λη是具有在λ 和λ2之间的值 的波长。相对于λ 1和λ 2，波长λ η确定相对于物面Zl和Ζ2中间物面所处的位置，以便 聚焦在像面104上。现在参考图4C，在微毛细管107旋转后，使细胞114改变其位置和方向，示出了图 4Α的系统。为补偿该运动，PZT 113 (例如图4Β所示)使物镜103移动足以使像面104上 的聚焦光源自第二物面集Ζ3和Ζ4，对波长λ 1的光，经源自物面Ζ3的射线路径118，以及 对波长λ 2的光，经源自物面Ζ4的射线路径119。本领域的技术人员受益于该公开内容将 理解到，具有在λ 和λ2之间的可变波长λ η的光将沿射线路径118和119之间的射线 路径，从位于物面Ζ3和Ζ4之间的中间物面Zn传播，还将到达像面104上的焦点。相对于 λ 1禾P λ 2，波长λ η确定相对于Ζ3和Ζ4物面Zn必须所处的位置，以便聚焦在像面104上。 图4D表示图4C中详述的系统，特别地，示例说明PZT 113已经移动物镜103，以便将聚焦图 像移向像面104上的焦点B。本领域的技术人员受益于本公开内容将意识到，图4Α至图4D中所述的系统允许 照相机112采集与通过在细胞114的整个厚度上，扫描良好校正的物镜而产生的规定的伪 投影类似的图像，并进一步准许从多个角度采集多个伪投影，而不必经PZT扫描机构113的 高频驱动，以高速移动物镜103。另一实施例采用先前所述、具有如下像差的多色差光学路径，该像差对于在通过 染色剂的恒定吸收的范围内的波长，在目标厚度(例如15微米)上产生焦点。该实施例进 一步包括光学路径中的彩色滤光器阵列(CFA)，最好正好位于像面104前。CFA可以由二 种或多种像素组成，每一像素具有与照相机112成像表面104的像素大小对应的大小。每 种像素使单独的波长范围通过。具有比作为本发明的一部分所述更宽的带通范围的CFA 的例子是Bayer滤光器，如在Brault等，1978年3月28日公布的“Method for making a solid-state color imagingdevice having an integral color filter and the device" 的U. S.专利No. 4，081，277中所述。现在参考图5，示意性地示出了用于彩色滤光器阵列的设计的例子。CFA 201在 胞单元(unit cell)202中包括多个像素类型。在一个例子中，多个像素类型包括包含在 胞单元202中的四个像素类型203，204，205，206。四个像素类型仅分别使550_567nm， 567-584nm，584-601nm和601-618nm的波长通过。CFA 201必须包括足够多个胞单元202 来覆盖大部分像面104。例如，如果像面104包括900X1600个像素，那么CFA 201可以有 利地包括450X800个胞单元202，每一胞单元202进而包括滤光器像素类型203，204，205 和206的每一个的2X2矩阵。由于对每一波长，仅使用像素的1/4，该设计可能使空间分辨 率限制加倍。然而，这实际上并不是问题，只要像素限制的可分辨大小(在包括CFA的情况 下，等效于4X [像素大小]/放大率)小于所需光学分辨率(在该例子中，500nm)。在照相 机像素大小=7. 4微米和放大率=60的典型条件下，实现该要求。由于四波长CFA，在该实 施例中，使到达每一 C⑶像素的光强度以4倍的因子减少。这一减少实际上也不是问题，因 为能增加源强度以便提供更高光能级，而不要求更长照相机曝光时间。共同参考图6A和图6B，示例说明包含CFA 201的多色差系统的操作的另一例子。 该系统与图4A和4C所述的系统类似，外加照相机201的像面104上的CFA 201。由于沿系统的光轴平移物镜103，焦点从图6A中的焦点A’移动到图6B中的焦点B’。包含CFA 201使得将信号与两个或更多个(在该例子中，为4个)焦点范围分开 成为可能，由此减少污染焦点对准信号的散焦量。通过单独地保存每一焦点范围，在后采集 处理期间，可以组合它们，允许组合图像的动态范围增加，最终提高组合图像的空间分辨率 和对比度。另外，将由每一波长产生的图像处理为两个或多个单独的数据集，而不组合直到 单独地层析成像重构每一个为止，由此提供空间分辨率和对比度的提高。现在共同参考图7A和图7B，示意性地示例说明用于包含长景深的多色差光学层 析成像系统的、用于第一视角θ 1的物空间。结合CFA201的扩展的焦点范围的限制使得透 镜换能器诸如PZT 113对该系统的操作不必要。另一对物面Ζ5和Ζ6分别对应于波长入1 和λ 2。物面位于微毛细管107的内部直径的极端。因为物面Ζ5和Ζ6位于微毛细管107 的内部直径的极端，所以即使当管107旋转时，物面Ζ5和Ζ6的位置相对于物镜保持不变， 使细胞114改变其相对于物镜的位置。对于具有50微米的内部直径的微毛细管107，物面 Ζ5和Ζ6之间的间隔最好应当至少50微米。分别包括波长λ 1和λ 2的光的射线路径405 和406分别传播通过物面Ζ5和Ζ6，并到达CFA 201，其中，λ 1仅透过例如第一类型的CFA 像素203，以及λ 2仅透过最后一类型的CFA像素206。由于在CFA的胞单元中存在多种像素类型，所以每一像素类型仅从物面Ζ5和Ζ6 之间的间隔部分收集光。对于图5中所示的四色CFA201，如上所述，每一间隔最好是不重叠 的，因此，仅总间隔的1/4透过任一像素类型并由照相机112收集。例如，如果焦平面间隔为50微米，以及波长范围为550至618nm，那么直接位于 像素类型203后的照相机像素将仅检测具有在550和567nm间的波长的光，与物面Z5和 Z5+12. 5之间的物面对应。用类似的方式，直接位于像素类型204后的照相机像素将仅检测 具有在567和584nm之间的波长的光，与位于Z5+12. 5微米和Z5+25微米之间的物面之间 的焦平面对应。直接位于像素类型205后的照相机像素将仅检测具有在584和eOlnm间的 波长的光，与Z5+25微米和Z5+37. 5微米之间的物面对应，以及直接位于像素类型206后的 照相机像素将仅检测具有在601和618nm间的波长的光，与Z5+37. 5微米和Z6 (即Z5+50 微米)之间的物面对应。现在参考图7B，示意性地示例说明用于包含长景深的多色差光学层析成像系统的 第一视角。包含该系统的部件与图6B的类似，除用于物镜的机械转换器诸如PZT不再是必 需的。射线路径405和406源自管205的相对端，并沿着类似的路径在焦点A”处到达图像 传感器104。也示出了 CFA 201，尽管在该实施例中它是可选的。现在参考图7C，示意性地示例说明用于包含长景深的多色差光学层析成像系统的 第二视角的物空间。这里，将细胞114旋转到第二视角θ 2。因为细胞114总是在扩展景深 的边界内(即，平面Ζ5和Ζ6之间)，所以不必采用PZT来移动物镜103。现在参考图7D，示意性地示例说明用于包含长景深的多色差光学层析成像系统的 第二视角，示出图7C中详述的系统。与图7Β相比，应注意到物镜103的焦点已经移动到像 面104上的焦点B”。还示出了 CFA 201，尽管在该实施例中是可选的。现在参考图8Α，示出了保持标本的毛细管位于第一旋转角的多照相机系统的例 子。多照相机系统包括彩色滤光器Iio和聚光透镜115，以及管组件121，该管组件121容纳 例如基本上如上参考图4Α和4Β所述的生物细胞114。分别在物面Zl和Ζ2处在细胞114附近开始的射线路径通过浸液109和多色差物镜系统103。偏离上述参考图4A和图4B所 述的系统，在此的多照相机系统包含分离第一多个射线路径502和503的双色分束器立方 体501。第一多个射线路径502和503在与物面Zl和Z2类似的物面中开始。可由彩色滤 光器阵列201，508可选地对每一照相机滤光。在另外的实施例中，可以用偏振滤光器阵列 代替每一彩色滤光器阵列。如果需要宽景深，那么与该实施例类似的另一实施例将采用CFA 201和508，同时消除用于移动物镜的平移机构113，与上述其他实施例类似。现在参考图8B，示出了图8A的多照相机系统的例子，其中，保持标本的毛细管位 于第二旋转角。在此，双色分束器立方体501分成第二多个射线路径504和505。第二多个 射线路径504和505源自与物面Z3和Z4类似的物面。现在共同参考图8A和图8B，相同波长的射线502和504传播通过第一管透镜111 至第一照相机112。具有与射线502和504不同的波长的射线503和505传播通过第二管 透镜506至第二照相机507的传感器区域509。可以很容易设想另外的双色分束器和照相 机。焦点评定(focusscore)包含扩展景深光学元件的OPTM系统的一个特征是不再能通过扩展景深光学路径 采集固定焦平面图像。在宽的焦点位置范围上保持平面目标的焦点质量。该属性有时称为 焦点不变。对不限制到单个焦平面的目标，仍然有必要找出感兴趣的目标的中点，以便在整 个数据采集中可以被保持在焦点间隔内。实现此的一种方法是在引入色差前分离光学路 径，以便可获得包含检测器的单独光学路径。无色差的该单独光学路径允许系统采集固定 焦平面图像。以能包含在多色差成像系统中的类似的方法，能分离光学路径以及一个分支 滤色成近单色，因此，能由单个照相机成像单一焦平面，而另一分支提供伪投影。另一方法 包括在开始扫描前，使物镜在宽范围上摇摄，在每一位置采集图像，以及将焦点评定分配给 每一图像。焦点评定方法可以采用自相关、熵和/或其他等效方法。现在参考图9，示例说明MTF范围中的焦点不变的例子。用于一个空间频率的 MTF( S卩，MTF(fl))601的焦点不变范围由上焦平面602和下焦平面603限制在光轴上。在 这些边界内，MTF 601在下降到更低水平前，保持在约不变的平稳值。使用这种方法，如下 所述，能识别MTF (fl) 601中的稳定期间的两个端点602，603，以及由例如端点602，603之间 的中点604选择最佳焦点。假定焦点不变区域的上下边界602，603不通过微毛细管的内部，对于具有超出微 毛细管的内部直径的景深的系统，重复焦点评定是不必要的。当首次构造该仪器时，能由初 始焦点评定验证该条件。现在参考图10，示意性地示出了用于找出焦点不变光学层析成像系统中的焦点不 变区域的中点的示例性方法的框图。根据示例性方法，找出中点并被用来通过下述计算目 标的3D重构1.摇摄通过光轴，并在摇摄的同时采集微毛细管中的目标的多个图像(701)；2.估算沿光轴每一位置的焦点质量(702)；3.确定焦点质量开始下降的光轴上的两个断点(703)，其中，两个断点对应于焦 点不变区域的上下边界602，603 ；
4.采集伪投影图像(704)，伪投影扫描范围的中心在焦点不变区域的上下边界 602，603之间的中心；5.将微毛细管旋转到下一投影角度；6.重复步骤1-5直到以多个投影角度采集多个伪投影为止(705)；7.使用所采集的伪投影，计算3D重构(706)。现在参考图11A，示出了用于找出焦点不变光学层析成像系统中的焦点不变区域 的中点的另一方法的框图。根据该另外的示例性方法，找出中点并被用来通过下述计算目 标的3D重构1.对第一视角，通过步进焦点(即，通过移动物镜由η = η+1表示的短距离，其中 η是递增步长)并在每一焦平面813采集伪投影数据而在多个焦平面采集伪投影801 ；2.移动到下一视角并重复采集伪投影801，直到通过如上步进焦点而覆盖目标体 积为止802 ；3.求和对于每一视角的所有伪投影803以便产生求和的伪投影的集；以及4.使用求和的伪投影的集，计算3D重构804。在一个例子中，采集伪投影直到在802满足或超出下述公式ε nD =管直径，其中，0 < ε <1。现在参考图11Β，示出用于找出焦点不变光学层析成像系统中的焦点不变区的中 点的又一方法的框图。根据该另外的示例性方法，找出中点并被用来通过下述计算目标的 3D重构1.对第一视角，通过步进焦点(即，通过移动物镜由η = η+1表示的短距离，其中 η是递增步长)并在每一焦平面813采集伪投影数据而在多个焦平面采集伪投影801 ；2.移动到下一视角并重复采集伪投影801，直到通过如上步进焦点而覆盖目标体 积为止802 ；4.执行2. 5D焦点估算805以便为每一视角确定最佳焦点伪投影；以及5.使用在用于每一角度的最佳焦点采集的最佳焦点伪投影的集，计算3D重构。上述方法与图IlA类似，除2. 5D焦点估算外。现在参考图12，示意性地示出了使用色平衡的自动聚焦系统的实施例。这里，两个 自动聚焦照相机2002,2004向图像比较器2006提供数字化输入，图像比较器2006进而向 换能器驱动2010诸如PZT控制器提供反馈信号2008。当感兴趣的目标2001在微毛细管内 旋转时(如上所述)，由自动聚焦照相机2002，2004捕捉来自上目标体积2012和下目标体 积2014的单独图像。由比较器2006比较和分析图像。来自比较器2006的反馈信号2008 驱动换能器驱动2010，换能器驱动2010进而控制物镜聚焦驱动2016，以便物镜2103的焦 点范围更移近更差焦点质量的区域。当两个图像之间的焦点质量差异变得足够小时，不再 需要换能器驱动用于位移焦点范围。对每一投影角度，能重复该过程，随着管旋转，当包含 感兴趣的目标的平面上移和下移光轴时，这可能是必要的。由图像照相机2020采集图像。在一个实施例中，由主分束器2028、次分束器2030和反射镜2032引导光线。由 第一滤光器2022过滤被导向图像照相机2020的光线，其中，第一滤光器使具有在550nm和 620nm之间的波长的光通过，并通过第一成像透镜2023。由第二滤光器2024过滤被导向第 一自动聚焦照相机2002的光线，其中，第二滤光器使具有在585nm和620nm之间的波长的光通过，并通过第二成像透镜2025。在由第三滤光器2026过滤后，撞击反射镜2032的光线 被导向第二自动聚焦照相机2004，其中，第三滤光器使具有在550nm和585nm之间的波长的 光通过，并通过第三成像透镜2027。现在参考图13，示意性地示出了使用色平衡的自动聚焦系统的另一实施例。光谱 均勻光照射源2060照射由图像照相机2020成像的感兴趣目标2001。与上述自动聚焦系统 类似，由主分束器2028、次分束器2030和反射镜2032引导光线。由第一滤光器2022过滤 被导向图像照相机2020的光线，其中，第一滤光器使具有在550nm和620nm之间的波长的 光通过，并且通过第一成像透镜2023。由第二滤光器2024过滤通过次分束器2028的部分 光线，其中，第二滤光器使具有在585nm和620nm之间的波长的光通过。由第三滤光器2026 过滤撞击反射镜2032的光线，其中，第三滤光器使具有在550nm和585nm之间的波长的光 通过。第一傅立叶面形成透镜2050透射来自第二滤光器2024的光，通过第一傅立叶面空 间滤光器2052，至第一光电传感器2054。第二傅立叶面形成透镜2056透射来自第三滤光 器2026的光，通过第二傅立叶面空间滤光器2058，至第二光电传感器2054。傅立叶空间滤光器2052,2058在两个焦点路径上操作以便经光电二极管2054，将 模拟反馈提供给焦点控制器2042。空间滤波确保光电二极管仅接收焦平面的高空间频率分 量。高空间频率内容与良好聚焦的目标有关。在信号调节和差分放大处理器2062中，比较 焦点范围的上下半部分2012,2014的高频内容。差分放大处理器2062将如上使用的输出 2040提供给控制驱动2042以便使换能器2016定位该物镜2103，直到两个焦点区域的高频 强度非常类似为止。在连续照射下，该方法具有在使目标始终保持焦点平衡的同时跟踪目 标的运动的优点。用于3D成像的偏振相关光学元件(双折射性)焦平面的位置与光的偏振相关。该系统能使用双折射光学元件实现，其中，折射率 根据光学波前的电场偏振改变。双折射光学材料的例子是方解石(CaCO3)，其在590nm的折 射率为1. 658或1. 486，由偏振而定。可以采用与上述多色差系统类似的实施例。通过这些技术，成像光的偏振由产生 它的目标焦平面而定。例如，光的水平偏振(0度的电场矢量)分量可以为物面ZH提供焦 点对准图像，而光的垂直偏振(90度的电场矢量)分量可以为例如位于比平面Zh更接近检 测器15微米的物面Zv提供焦点对准图像。具有0和90度之间的偏振的光将为Zh和Zv之 间的物面提供焦点对准图像。通过使用自转偏振滤光器，可以随时间改变照射光的偏振，聚集的(未偏振的)光 在其到达图像传感器前通过偏振滤光器，或整个焦点范围被同时聚集。在一个实施例中，焦点范围可与目标的厚度，例如15微米相比。在该实施例中，在 与图6A和图6B中所述的类似的系统中，能包含PZT以便补偿细胞的由旋转引起的平移。在另一实施例中，与图7A-图7D中所述类似，焦平面范围能等于微毛细管的直径 (例如50微米)，以及偏振滤光器阵列(PFA ；在图5中示例说明的彩色滤光器阵列的偏振 类似物)包含在系统中，代替图7A-图7D中所示的CFA。在又一实施例中，焦平面范围能等于微毛细管的直径，以及光的偏振随时间改变， 同时，一系列同步照相机曝光当在检测器上形成焦点时采集物面。2. 5D 成像
在包含扩展景深光学元件的OPTM系统中，可以包含后采集处理，以便执行逐个像 素分析来计算视场中的焦点对准特征的镶嵌。在RJPkpei^PA Korpel,"Image processing for extended depth of field”，Applied Optics 22,1449(1983)中能找到一种 2. 5D 成 像的例子。在利用彩色或偏振滤光器阵列(CFA或PFA)并覆盖宽的焦点范围的那些实施例 中，以及在利用多照相机曝光的实施例中，可以最有利地使用2. 5D成像方法。在这些系统 中，当目标旋过不同焦平面区域时，赋予元件类型的加权可以从一个伪投影到下一伪投影 改变。为实现此，在形成图像栈的短焦平面图像的聚集中，识别各个特征。相同的特征可 以出现在栈内的多个图像中，但仅那些图像的子集将包含那一特征的良好聚焦的表示。现在参考图14，示意性地示出了 2. 5D聚焦方法的框图。识别图像栈Sk中的特征& = G1^--GfiIlOl0对图像栈Sk中的每一特征Gi，识别其Gi最佳对准的图像1102。生成空白 合成图像PPk1103。组成那一最佳对准特征的像素(XpY^Zi)被添加到合成图像PPk1104。 对所有特征(G1, G2, ... GJ，重复这一过程，直到所有特征包含在PPk中为止。由于单个特 征可以跨越Sk中的两个或更多个图像，所以，PPk中的单个像素可以累加两个或更多个强度 值，分别用于包含Gi的良好聚焦的表示的Sk中的每一图像。此外，两个或更多个特征可以 共享相同的X-Y坐标(但不同的Z坐标)，可能导致PPk中的一些像素累加来自两个或更多 个特征的强度值。注意下标字母1，k等等表示指数。对所有图像栈重复该过程，直到分析所有图像栈(S1, S2, . . . Sk最大)并计算它们相 关的合成图像(PP1,PP2，...PPki大)为止1105。然后将PPk集用作输入图像，能计算层析成 像重构1106。在使用该方法的一个例子中，通过选择包含最佳焦点的单个像素，能处理4色 CFA或PFA的每2X2块，或作为两个或更多个像素的加权和。分束多焦平面对OPTM性能，存在几个较短集成伪投影(shorter integrated pseudoprojection)的基本优点。首先，更小的伪投影(集成光轴扫描)减少在空间谱中占 首要地位的低频信息的效应。其次，增加采样相同体积的更多图像与所使用的图像数的平 方根成比例地提高了信噪比。第三，由于折射率对比，多个图像实现图像中异常热点的检测 和补偿。将景深分成段允许许多其他景深扩展器工作，以便提供更高级的解决方案，通过 更低复杂度而工作更好。通过直接物镜扫描和多个照相机焦平面，减少运动范围或扩展深度是可能的。创建多个焦点范围不一定要求多个照相机。通过足够的照相机传感器区，可以合 并图像并在单个传感器上捕捉它们。这能通过使用将传感器分成区域的光纤面板，或将多 个图像合并到单个CCD上的折叠光学系统来完成。现在参考图15，描述了折叠系统的例子。由第一双色分束立方体1206划分离开物 镜1205的基本校准光。一个分支1202具有波长λ 1并在第一焦平面1201产生。它通过 第一管透镜，通过第二分束器立方体1207，并到达照相机传感器的有效区1211的右半部分 上。另一分支1204具有波长λ 2并在第二焦平面1203产生。它反射过两个反射镜1208， 1209，通过管透镜1210，在第二双色分束器立方体1207内反射，并到达照相机传感器的有 效区1211的左半部分。照相机的两个半部分将采集具有基本上相同放大率，但源自物空间中的不同焦平面1201,1203的聚焦图像。通过横向位移第二双色分束器立方体1207，能实 现图像中的相对横向位移，从而，相对于第一分支1202和管透镜1210，横向位移第二分支 1204的反射光。两级放大对于100X透镜，采集物空间中按10微米分隔的图像将要求与平方的放大率成比 例的图像空间路径长度的差值(即100mm)。如果管透镜具有相同的焦距，但不同的后焦平 面，那么照相机的两个半部分将采集具有基本上相同的放大率，但源自物空间中的不同焦 平面的聚焦图像。例如，与第一管透镜相比，将照相机100放置在更靠近第二管透镜IOOmm 将产生100/M2微米的焦平面差值，其中，M是横向放大率。如果M= 100，那么100/M2 = 10 微米。然而，使用两个IOX放大率级和仅稍微改变次物镜的焦平面，能实现光轴的更适 度改变。通过中间图像平面的1毫米位移，实现IOX放大率图像的标本平面中的10微米 位移。使用分离焦平面方法允许两个或更多个照相机(图16的例子中，示出了 4个)分 别收集标本的焦深的范围。在极限情况下，实际上由能用来照射标本的光量和光路的成本 和复杂度来限制照相机的数量。假定照相机的良好性能能十分接近完美，并降低每一图像 在景深中必须传递的范围，包含更多照相机的系统改进信噪比。较短景深有助于在最终伪 投影中产生高空间频率的更好表示。在本实施例的例子中，如图16所示，光学系统包括主物镜1302、第一和第二反射 镜1304A，1304B、三个分束器1303A-1303C、四个主管透镜1310、四个次物镜1312、四个次管 透镜1308以及四个CXD照相机1309。主物镜1302和主管透镜1310提供至少IOX放大 率，以及次物镜和管透镜提供至少另外的IOX放大率，总共至少100X放大率。每一射线路径通过两个分束器厚度，以及每一射线路径经过两次或零次反射，或 通过分束器或绕过反射镜。通过分束器的射线路径长度的等值是指由于通过玻璃而引起的 像差是相等的。反射的次数总是偶数(或总是奇数)是指在四个照相机1309的像面中所有 四个图像保持相同的方向。对每一射线路径，第一管透镜和第二物镜之间的空间是不同的， 因此，不同物面被聚焦在每一照相机上。通过物镜后的焦平面扫描和多个照相机焦平面，减 少运动范围或扩展深度是可能的。理论上，使多个照相机光学元件扩展到大于20个焦平面能每500nm采样10微米 景深。多个照相机的布置允许两个同时的体积采样模式，能分别用来使它们的相对强度用 于更准确的体积重构。具体地，可以从纯吸收效应挑出在采样介质界面中由反射和衍射效 应生成的对比度，并且快速地捕捉所有数据，同时没有焦平面运动或旋转模糊。波前编码光学元件现在参考图17，示出了包括波前编码光学元件的OPTM系统的示意图。如上，微毛 细管1707保持感兴趣的目标1701并如由物镜1703所观察到的，旋过不同视角。透过物 镜1703的光撞击位于物镜1703和成像照相机1707之间的波前编码光学元件1705。使用 波前编码光学元件提供预失真光学波前以便感兴趣的目标包含在扩展景深内，在整个体积 内，产生低但一致的频率响应的方法。由此，同等地散焦沿光轴有限范围内的所有焦平面。 这有助于波前编码。波前编码元件可以从CDM Optics, Inc. (BOULDER, CO)获得，以及在例如 ER Dowski, "ffavefront coding optics”，US 专利 No. 6，842，297 (2005)中描述过。在景深中，波前编码的限度为约12 1改进。对光学层析成像应用，这种改进将 提供所需深度的约一半。由此，波前编码可以有利地与在此所述的许多其他实施例的一个 结合，以便提供完整的解决方案。对匹配的聚光器和物镜NA，在散焦的0. 64波第一对比度反转点(低于O的MTF) 出现，如在 VN Mahajan, "Aberration Theory MadeSimple，，(Bellingham，WA :SPIE Press, 1991)中所述。根据光学深度的变化Δ Z，很容易表示这一点，如Δ Z = 士 1 · 28 λ n/ (NAobj)2其中，λ是聚集的光的波长，η是物镜和目标间的区域的折射率，以及NA。W是物镜 的数值孔径。对λ = 550nm,n = 1和NA。bj = 0. 9，该距离为ΔΖ = 士0. 87微米。而对12 微米深的目标，要求至少景深的5X改进，以避免6微米散焦(约散焦的4.4波)的对比度 反转。通过波前编码成像的另一实施例包含通过互补传递函数的图像的数字增强，提高 抑制的高频分量以便恢复清楚聚焦的图像同时保持扩展的深度。另一实施例使用多个照相机，诸如上文所示，通过利用透镜传递函数来编码每一 光路，利用波前编码光学元件方法来扩展景深，由此使景深从一段扩展到另一段。这一机制 允许单次简短曝光，诸如选通照明器来快速地采样宽的景深而没有机械运动。在此已经相当详细地描述了本发明，以便遵守专利法和为本领域的技术人员提供 应用本发明的新颖原理所需的信息，以及当要求时，解释和使用这些示例性和专用的部件。 然而，应理解到，通过具体不同的设备和装置可以实施本发明，以及可以实现与设备细节和 操作过程相关的各种改进，而不背离本发明的真实精神和范围。
权利要求
一种光学投影层析成像系统，用于成像感兴趣的目标，该光学投影层析成像系统包括(a)光源(130)；(b)目标容纳管(107)，其一部分位于由所述光源(130)照射的区域内，其中，所述感兴趣的目标(114)具有位于所述目标容纳管(107)内的至少一个感兴趣的特征；(c)至少一个检测器(104)，其中，所述至少一个检测器(104)被设置为从所述感兴趣的目标(114)接收出现的辐射；以及(d)位于目标区域和所述至少一个检测器(104)之间的光路中的至少一个透镜(103)，其中，所述至少一个透镜(103)包括至少一个光场扩展元件(1)以便来自所述目标容纳管(107)中的多个物面(Zn)的光线(105)同时聚焦在所述至少一个检测器(104)上。
2.如权利要求1所述的系统，其中，所述目标(114)相对于所述至少一个检测器(104) 移动，并且所述至少一个透镜(103)操作以提供所述目标区域的多个视野，用于在每一视 野产生所述至少一个感兴趣的特征的至少一个图像。
3.如权利要求1所述的系统，其中，所述感兴趣的目标包括生物细胞(114)。
4.如权利要求1所述的系统，其中，到达所述至少一个检测器(104)的至少一个上的焦 点的所述多个物面(Zl)的每一个将不同的光学波长(λ η)的光(130)记录在所述至少一 个检测器(104)上。
5.如权利要求1所述的系统，其中，由所述多个物面(Zn)跨越的间隔包括跨越所述感 兴趣的目标(114)的厚度的间隔。
6.如权利要求1所述的系统，其中，染色所述感兴趣的目标(114)以便告知在所述至少 一个检测器(104)上记录的至少一个波长的吸收系数。
7.如权利要求1所述的系统，其中，由所述多个物面(Zn)跨越的间隔包括跨越所述目 标容纳管(107)的直径的厚度的间隔。
8.如权利要求1所述的系统，其中，所述系统进一步包括位于所述至少一个透镜(103) 和所述至少一个检测器之间的彩色滤光器阵列(201)。
9.如权利要求1所述的系统，其中，所述系统进一步包括耦合到所述至少一个透镜 (103)的压电换能器(113)，用于沿所述目标区域的多个视野的每一个之间的光路，移动所 述至少一个透镜(103)，以便所述感兴趣的目标(114)保持在由所述多个物面(Zn)跨越的 间隔内。
10.如权利要求1所述的系统，进一步包括位于所述至少一个透镜(1703)和所述至少 一个检测器(1707)之间的波前编码光学元件(1705)。
11.如权利要求1所述的系统，其中，所述至少一个检测器(104)包括从由电荷耦合器 件(112)、互补金属氧化物半导体器件、固态图像传感器和固态图像传感器检测器阵列组成 的组中选择的检测器。
12.如权利要求6所述的系统，其中，所述感兴趣的目标(114)用苏木精染色。
13.如权利要求1所述的系统，其中，来自多个物面(Zn)的光(130)包括具有跨越达 50微米的焦点间隔的550nm至620nm的波长范围的光。
14.如权利要求1所述的系统，其中，所述目标容纳管(107)具有至少50微米的直径。
15.如权利要求2所述的系统，其中，所述系统进一步包括附接到所述至少一个透镜2(103)的压电换能器(113)，用于沿所述目标区域的所述多个视野的每一个之间的光路移 动所述至少一个透镜(103)，以便所述感兴趣的目标(114)保持在焦点间隔内。
16.如权利要求1所述的系统，其中，所述系统进一步包括位于所述至少一个透镜(103)和所述至少一个检测器(104)之间的彩色滤光器阵列(201)。
17.如权利要求1所述的系统，其中，由所述多个物面(Zn)跨越的间隔包括至少12微 米的焦点间隔。
18.如权利要求1所述的系统，其中，来自多个物面(Zn)的光包括550nm至620nm的波长范围。
19.如权利要求1所述的系统，进一步包括带通滤光器(201)，用于使在550nm至620nm 的范围中的光通过，所述带通滤光器(201)被设置以带限到达所述至少一个检测器(104) 的光。
20.如权利要求1所述的系统，其中，所述光源包括彩色滤光器(110)，所述彩色滤光器 (110)被设置为过滤到达所述目标容纳管(107)的光(130)。
21.如权利要求1所述的系统，其中，所述至少一个透镜包括多色差透镜(103)。
22.一种光学层析成像系统，用于观察感兴趣的目标(114)，所述光学层析成像系统包括微毛细管(107)观察区，用于放置所述感兴趣的目标(114)； 至少一个检测器(104)；设置为附接到微毛细管(107)并旋转所述微毛细管(107)的马达； 用于将具有在550nm和620nm之间的波长的宽带光(130)透射到所述微毛细管(107) 观察区的装置；多色差透镜(103)，设置为接收透过所述微毛细管(107)观察区的光(130)；以及 管透镜(111)，设置为聚焦透过所述多色差透镜(103)的光线(130)，以便来自所述微 毛细管(107)观察区中的多个物面(Zn)的光线同时聚焦在所述至少一个检测器(104)上。
23.如权利要求22所述的系统，其中，所述感兴趣的目标包括生物细胞(114)。
24.如权利要求22所述的系统，其中，所述多色差透镜(103)和所述管透镜(111)操 作以同时将来自所述微毛细管(107)观察区的多个物面(Zn)聚焦在所述至少一个检测器(104)上。
25.如权利要求24所述的系统，其中，由所述多个物面(Zn)跨越的间隔包括跨越所述 生物细胞(114)的厚度的间隔。
26.如权利要求23所述的系统，其中，染色所述生物细胞(114)以便告知在所述至少一 个检测器(104)上记录的至少一个波长的吸收系数。
27.如权利要求23所述的系统，其中，由所述多个物面(Zn)跨越的间隔包括跨越所述 微毛细管(107)观察区的厚度的间隔。
28.如权利要求22所述的系统，其中，所述系统进一步包括位于所述多色差透镜(103) 和所述至少一个检测器(104)之间的彩色滤光器阵列(201)。
29.如权利要求22所述的系统，其中，来自所述多个物面(Zn)的光(130)包括具有跨 越达50微米的焦点间隔的550nm至620nm的波长范围的光。
30.如权利要求22所述的系统，进一步包括位于所述多色差透镜(103)和所述至少一个检测器(104)之间的彩色滤光器阵列(201)，以便到达所述检测器(104)上的焦点(A’ ) 的光(130)被分成两个或多个波长带(λ η)，每一波长带(λ 1)透过所述彩色滤光器阵列 (201)到达所述至少一个检测器(104)上的像素(203)的单独集。
31.一种光学层析成像系统，用于观察感兴趣的目标(114)，包括 微毛细管(107)，容纳所述感兴趣的目标(114)；马达，附接到所述微毛细管(107)并用于旋转所述微毛细管(107)； 光源，设置为照射所述微毛细管(107)；多色差透镜(103)，设置为接收透过所述微毛细管(107)的光(130)； 双色分束器(501)，设置为当透过所述多色差透镜(103)时，分离在所述微毛细管 (107)中的多个物面(Zn)产生的多个射线路径(502)；以及至少两个检测器(104)，其中，所述至少两个检测器(104)中的第一检测器(104)设置 为接收沿着所述多个射线路径的一个(502)传输的光，以及所述至少两个检测器(104)中 的第二检测器(509)设置为接收沿着所述多个射线路径的另一个(503)传输的光，其中，来 自所述多个物面(Zn)的光线(130)同时聚焦在所述至少两个检测器(104)的至少一个上 (C)。
32.如权利要求31所述的系统，其中，所述系统进一步包括耦合到所述多色差透镜(103)的压电换能器(113)。
33.如权利要求31所述的系统，其中，所述感兴趣的目标包括生物细胞(114)。
34.如权利要求31所述的系统，其中，到达焦点的所述多个物面(Zn)的每一个将不同 光学波长的光(130)记录在所述至少两个检测器(104)的至少一个上。
35.如权利要求31所述的系统，其中，由所述多个物面(Zn)跨越的间隔包括跨越所述 感兴趣的目标(114)的厚度的间隔。
36.如权利要求31所述的系统，其中，染色所述生物细胞(114)以便告知至少一个波长 的吸收系数。
37.如权利要求31所述的系统，其中，由所述多个物面(Zn)跨越的间隔包括跨越所述 微毛细管(107)的厚度的间隔。
38.如权利要求31所述的系统，其中，所述系统进一步包括位于所述多色差透镜(103) 和所述至少两个检测器(104)的每一个之间的彩色滤光器阵列(201)。
39.如权利要求36所述的系统，其中，所述感兴趣的目标(114)用苏木精染色。
40.如权利要求31所述的系统，其中，来自多个物面(Zn)的光(130)包括具有覆盖达 50微米的焦点间隔的550nm至620nm的波长范围的光。
41.如权利要求40所述的系统，其中，所述目标容纳管(107)具有至少50微米的直径。
42.如权利要求40所述的系统，其中，由所述多个物面(Zn)跨越的间隔包括至少12微 米的焦点间隔。
43.如权利要求31所述的系统，其中，来自多个物面(Zn)的光包括550nm至620nm的波长范围。
44.如权利要求31所述的系统，进一步包括带通滤光器(201)，用于使在550nm至 620nm的范围中的光通过，所述带通滤光器(201)被设置以带限到达所述至少两个检测器(104)的光。
45.如权利要求31所述的系统，其中，所述光源包括彩色滤光器(110)，设置为过滤到 达所述目标容纳管(107)的光。
46.一种找出焦点不变光学层析成像系统中的焦点不变区域的中点的方法，其中，所 述光学层析成像系统包括具有光轴的物镜(103)和容纳感兴趣的目标(114)的旋转的管 (107)，所述方法包括沿所述光轴摇摄物镜，以采集感兴趣的目标的多个图像(701)； 估算每一图像的焦点质量(702)； 确定焦点不变区域的上下边界(703)；采集伪投影图像(704)，其中，所述伪投影的扫描范围在所述上边界(602)和下边界 (603)之间居中；以及旋转所述管并重复上述摇摄、估算和采集步骤，直到以多个投影角度采集到多个伪投 影为止(705)。
47.一种用于通过找出焦点不变光学层析成像系统中的焦点不变区域的中点而计算 3D重构的方法，其中，所述光学层析成像系统包括具有光轴的物镜(103)和容纳感兴趣的 目标的微毛细管(107)，所述方法包括递增步进所述物镜以便在多个焦平面上聚焦，以及在所述微毛细管中的多个焦平面 (813)上采集所述感兴趣的目标的多个伪投影(801)； 重复直到满足焦平面范围上的限制条件为止(802)；旋转所述管通过多个视角并且重复上述步进步骤和重复步骤，直到对每一视角满足所 述焦平面范围上的限制条件为止；对每一视角，求和在那一视角采集的采集伪投影以便生成求和伪投影的集(803)；以 及使用所述求和伪投影计算3D重构(804)。
48.如权利要求47所述的方法，其中，所述限制条件包括满足或超过由公式enD=管 直径所产生的限制，其中，0< ε <1以及η是递增步进值(802)。
49.一种用于应用焦点评定来识别具有最佳焦点的伪投影的方法，包括递增步进物镜以在多个焦平面上聚焦，并且在微毛细管中的多个焦平面(813)上采集 感兴趣的目标的多个伪投影(801)；重复直到满足焦平面范围上的限制条件为止(802)； 执行2. 5D焦点估算以确定映射到当前视角的最佳焦点(805)； 旋转所述管通过多个视角并且对每一视角重复上述步进步骤(801)和重复步骤 (802)；对每一视角，求和在对那一视角的最佳焦点采集的采集伪投影以生成求和伪投影的 集；以及使用所述求和伪投影计算3D重构(806)。
50.如权利要求49所述的方法，其中，所述限制条件包括满足或超过由公式enD=管 直径产生的限制，其中，0< ε <1以及η是递增步进值(802)。
51.一种自动聚焦系统，包括 第一自动聚焦照相机(2002)； 第二自动聚焦照相机(2004)；图像比较器(2006)，耦合以从所述第一自动聚焦照相机(2002)和第二自动聚焦照相 机(2004)接收数字化输入，其中，所述图像比较器提供反馈信号(2008)； 换能器驱动(2010)，耦合以接收所述反馈信号(2008)；位于所述第一自动聚焦照相机(2002)和所述第二自动聚焦照相机(2004)的视场内的 微毛细管(107)，所述微毛细管(107)容纳感兴趣的目标(2001)，其中，所述微毛细管(107) 耦合到旋转马达，并且，由所述第一自动聚焦照相机(2002)和所述第二自动聚焦照相机 (2004)捕捉来自上光谱目标体积(2012)和下光谱目标体积(2014)的单独图像；其中，由所述比较器(2006)比较和分析所述单独图像，所述比较器(2006)提供所述反 馈信号(2008)以驱动所述换能器驱动(2010)，进而，所述换能器驱动(2010)控制物镜聚焦 驱动(2016)以便使物镜(2103)的焦点范围移动更靠近不良焦点质量的区域，并且当两个 图像之间的焦点质量的差异变得足够小时，所述换能器驱动停止位移所述焦点范围；以及 图像照相机(2020)，设置为从所述微毛细管(107)接收图像。
52.如权利要求51所述的自动聚焦系统，进一步包括 主分束器(2028)；次分束器(2030)；反射镜(2032)，设置为将光线导向所述第二自动聚焦照相机(2004)； 第一滤光器(2022)，设置为使来自所述主分束器(2028)的光线通过，经由第一成像透 镜(2023)到达所述图像照相机(2020)；第二滤光器(2024)，设置为使来自所述次分束器(2030)的光线通过，经由第二成像透 镜(2025)导向所述第一自动聚焦照相机(2002)；以及第三滤光器(2026)，设置为引导来自所述反射镜(2032)的光线经由第三成像透镜 (2027)到达所述第二自动聚焦照相机(2004)。
53.如权利要求52所述的自动聚焦系统，其中，所述第一滤光器(2022)使具有在 550nm和620nm之间的波长的光通过。
54.如权利要求52所述的自动聚焦系统，其中，所述第二滤光器(2024)使具有在 585nm和620nm之间的波长的光通过。
55.如权利要求52所述的自动聚焦系统，其中，所述第三滤光器(2026)使具有在 550nm和585nm之间的波长的光通过。
56.一种自动聚焦系统，包括光谱均勻光照射源(2060)，设置为照射在图像照相机(2020)的视场内的感兴趣的目 标(2001)，所述图像照相机(2020)与为观察感兴趣的目标(2001)而设置的物镜(2103)成 一直线；主分束器(2028)； 次分束器(2030)； 反射镜(2032)；第一滤光器(2022)，设置为使来自所述主分束器(2028)的光线通过，经由第一成像透 镜(2023)到达所述图像照相机(2020)；第二滤光器(2024)，与所述次分束器(2030)光学对齐； 第三滤光器(2026)，与所述反射镜(2032)光学对齐；第一傅立叶面形成透镜(2050)，设置为透射来自所述第二滤光器(2024)的光，通过第 一傅立叶面空间滤光器(2052)，至第一光电传感器(2054)；第二傅立叶面形成透镜(2056)，设置为透射来自所述第三滤光器(2026)的光，通过第 二傅立叶面空间滤光器(2058)，到第二光电传感器(2054)；其中，所述第一傅立叶空间滤光器(2052)和所述第二傅立叶空间滤光器(2058)通过 所述第一和第二光电二极管(2054)，向焦点控制器(2042)提供模拟反馈，另外，其中，在信 号调节和差分放大处理器(2062)中，比较分别在焦范围的上部分(2012)和下部分(2014) 中的高频内容，以及所述信号调节和差分放大处理器提供输出(2040)，所述输出(2040)用 于被连接以控制所述物镜(2103)位置的驱动(2016)。
57.如权利要求56所述的自动聚焦系统，其中，所述第一滤光器(2022)使具有在 550nm和620nm之间的波长的光通过。
58.如权利要求56所述的自动聚焦系统，其中，所述第二滤光器(2024)使具有在 585nm和620nm之间的波长的光通过。
59.如权利要求56所述的自动聚焦系统，其中，所述第三滤光器(2026)使具有在 550nm和585nm之间的波长的光通过。
60.一种使用焦点不变光学元件的用于光学层析成像的2. 5维图像分析方法，包括 识别图像栈Sk中的特征，Gi = G1, . . . Gfi (1101)；对每一特征Gi,识别Sk中最佳焦点的像素Xi, Yi, Zi (1102)； 生成空白合成图像PPk(1103)；在PPk中将Xi, Yi, Zi的强度值增加到像素Xi, Yi的强度值上(1104)； 对所有特征(G1, G2. · · Gfi)重复直到所有特征包含在PPk中为止(1105)；以及 对多个视点重复(1106)。
61.如权利要求60所述的方法，其中，所述焦点不变光学元件包括4色CFA，所述方法 进一步包括通过选择包含最佳焦点的像素而处理4色CFA的每一 2X2块。
62.如权利要求60所述的方法，其中，所述焦点不变光学元件包括4色CFA，所述4色 CFA包括多个2X2块，所述方法进一步包括使用两个或更多个像素的加权和处理4色CFA 的每一 2X2块。
63.如权利要求60所述的方法，其中，所述焦点不变光学元件包括PFA，所述PFA包括 多个2X2块，所述方法进一步包括通过选择包含最佳焦点的像素而处理PFA的每一 2X2 块。
64.如权利要求60所述的方法，其中，所述焦点不变光学元件包括PFA，所述PFA包括 多个2 X 2块，所述方法进一步包括使用两个或更多个像素的加权和处理PFA的每一 2 X 2 块。
65.一种用于光学层析成像的折叠系统，包括 物镜(1205)，用于透过准直光；第一双色分束立方体(1206)，位于所述物镜(1205)的下游，将由所述物镜(1205)透过 的准直光分成第一分支(1202)和第二分支(1204)；第一分支(1202)具有波长λ 1并在第一焦平面(1201)中产生； 放置第一管透镜，以通过第二分束器立方体(1207)，透过所述第一分支(1202)，到照相机传感器的有效区的第一区域(1211)上；第二分支(1204)具有波长λ 2并在第二焦平面(1203)中产生； 第一反射镜(1208)和第二反射镜(1209)，被放置使得第二分支在第二双色分束器 立方体(1207)内反射后，经过所述第一反射镜(1208)和第二反射镜(1209)，通过管透 镜(1210)，到照相机传感器的有效区的第二区域(1211)上，由此照相机的所述第一区域 (1211)和所述第二区域(1211)采集来自目标空间中的不同焦平面(1201)的聚焦图像。
66.如权利要求65所述的系统，其中，通过横向位移所述第二双色分束器立方体 (1207)而实现图像的相对横向位移，以便相对于所述第一分支(1202)和所述第一管透镜， 横向位移所述第二分支(1204)的反射光。
67.一种用于光学层析成像的多照相机系统，包括 主物镜(1302)；第一反射镜(1304Α)和第二反射镜(1304Β)，设置为接收透过所述主物镜(1302)的光；至少三个分束器(1303Α)，设置为沿不同射线路径引导光； 至少四个主管透镜(1310)，分别沿所述射线路径的一个放置； 至少四个次物镜(1312)，分别沿所述射线路径的一个放置； 至少四个次管透镜(1308)，分别沿所述射线路径的一个放置；以及 至少四个照相机(1309)，分别沿所述射线路径的一个放置，其中，对每一射线路径，所 述至少四个主管透镜(1310)的一个与所述至少四个次物镜(1312)的一个之间的空间不 同，从而不同物面被聚焦在所述至少四个照相机(1309)的每一个上。
68.如权利要求67所述的系统，其中，由所述至少四个照相机(1309)采集的图像在所 述至少四个照相机(1309)的图像平面上保持相同的方向。
69.如权利要求67所述的系统，其中，所述主物镜(1302)和所述至少四个主管透镜 (1310)提供至少IOX放大率，并且所述次物镜(1312)和管透镜(1308)提供至少另外的 IOX放大率。
70.一种用于光学层析成像的多照相机系统，包括 主物镜(1302)；第一反射镜(1304Α)和第二反射镜(1304Β)，设置为接收透过所述主物镜(1302)的光；至少三个分束器(1303Α)，设置为沿不同射线路径引导光； 至少四个主管透镜(1310)，分别沿所述射线路径的一个放置； 至少四个次物镜(1312)，分别沿所述射线路径的一个放置； 至少四个次管透镜(1308)，分别沿所述射线路径的一个放置； 至少四个照相机(1309)，分别沿所述射线路径的一个放置；以及 波前编码光学元件(1705)，位于所述主物镜(1302)和所述至少四个照相机(1309)之 间，从而不同物面被聚焦在所述至少四个照相机(1309)的每一个上。
71.如权利要求1所述的系统，其中，所述至少一个光场扩展元件(1)包括位于所述至 少一个透镜(103)和所述至少一个检测器(104)之间的偏振滤光器阵列。
72.如权利要求1所述的系统，其中，所述至少一个光场扩展元件(1)包括位于所述多色差透镜(103)和所述至少两个检测器(104)的每一个之间的波前编码元件(1705)。
73.如权利要求1所述的系统，其中，由具有不同偏振的光形成到达所述至少一个检测 器(104)上的焦点的所述多个物面(Zn)的每一个。
74.一种用于成像感兴趣的目标(114)的光学投影层析成像方法，所述光学投影层析 成像方法包括(a)照射感兴趣的目标(114)；以及(b)对多个不同视野，将来自所述感兴趣的目标(114)中的多个物面(Zn)的光线同时 聚焦在至少一个检测器(104)上。
75.如权利要求74所述的方法，进一步包括过滤所述光线(130)以仅使具有在550nm 至620nm的范围内的波长的光线通过。
76.如权利要求75所述的方法，其中，所述过滤进一步包括使所述光通过带通滤光器 (201)，所述带通滤光器(201)设置为限制到达至少一个检测器(104)的光。
77.如权利要求74所述的方法，进一步包括从目标容纳管(107)递送用于成像的所述 感兴趣的目标(114)，其中，所述目标容纳管(107)包括从由毛细管、微毛细管、微毛细管束 和微毛细管盒组成的组中选择的管(107)。
78.如权利要求77所述的方法，其中，所述目标容纳管(107)具有至少50微米的直径。
79.如权利要求74所述的方法，其中，同时聚焦包括相对于至少一个检测器(104)移动 多色差透镜系统(103)的至少一个透镜。
80.如权利要求74所述的方法，进一步包括经分束器(501)分离第一多个光线路径。
81.如权利要求74所述的方法，其中，所述同时聚焦包括聚焦多色差透镜(103)。
82.如权利要求79所述的方法，其中，所述同时聚焦进一步包括通过使光透过至少一 个彩色滤光器阵列(201)而过滤光。
83.如权利要求74所述的方法，其中，所述至少一个检测器(104)包括从由电荷耦合器 件(112)、互补金属氧化物半导体器件、固态图像传感器和固态图像传感器检测器阵列组成 的组中选择的检测器(104)。
84.如权利要求82所述的方法，进一步包括将所述至少一个彩色滤光器阵列(201)放 置在所述多色差透镜(103)和所述至少一个检测器(104)之间，从而将到达所述检测器 (104)上的焦点的光分成两个或更多个波长带(λ η)，每一波长带透过所述彩色滤光器阵 列(201)至所述至少一个检测器(104)上的像素的单独集。
85.如权利要求82所述的方法，其中，所述至少一个彩色滤光器阵列(201)用至少一个 偏振滤光器阵列代替。
86.如权利要求74所述的方法，其中，同时聚焦所述多个物面(Zn)包括扩展聚焦通过 跨越所述感兴趣的目标(114)的厚度的焦点间隔。
87.如权利要求74所述的方法，其中，同时聚焦所述多个物面(Zn)包括扩展聚焦通过 至少12微米的焦点间隔。
88.如权利要求74所述的方法，其中，同时聚焦所述多个物面(Zn)包括扩展聚焦通过 达50微米的焦点间隔。
89.如权利要求74所述的方法，进一步包括使光线(130)撞击在波前编码光学元件 (1705)上。
90.如权利要求74所述的方法，进一步包括染色所述感兴趣的目标(114)以便告知至 少一个波长(λ η)的吸收系数。
91.如权利要求90所述的方法，其中，用苏木精执行所述感兴趣的目标(114)的染色。
92.如权利要求74所述的方法，其中，同时聚焦所述多个物面(Zn)包括通过自动聚焦 系统同时聚焦。
93.如权利要求89所述的方法，其中，通过自动聚焦系统同时聚焦包括使用色平衡聚焦ο
94.如权利要求74所述的方法，其中，同时聚焦光线包括使所述光线(130)透过偏振滤 光器阵列。
95.如权利要求74所述的方法，其中，同时聚焦光线包括使所述光线(130)透过波前编 码元件(1705)。
96.如权利要求74所述的方法，其中，同时聚焦光线包括通过具有不同偏振的光使所 述多个物面(Zn)的每一个聚焦在所述至少一个检测器(104)上。
97.如权利要求74所述的方法，其中，同时聚焦光线包括执行2.5D焦点估算(805)以便确定最佳焦点。
98.如权利要求74所述的方法，其中，所述感兴趣的目标包括生物细胞(114)。
全文摘要
用光源(130)照射光学投影层析成像系统。目标容纳管(107)，其部分位于由光源(130)照射的区域内，目标容纳管(107)容纳具有感兴趣的特征的感兴趣的目标(114)。检测器(112)用来从感兴趣的目标(114)接收出现的辐射。包括光场扩展元件(1)的透镜(103)位于目标区域和检测器(104)之间的光路中，从而来自目标容纳管(107)中的多个物面(Zn)的光线(130)同时聚焦在检测(104)上。目标容纳管(107)相对于检测器(104)移动，并且透镜(103)操作以提供目标区域的多个视野，用于在每一视野产生感兴趣的特征的图像。
文档编号G02F1/01GK101896856SQ200880120077
公开日2010年11月24日 申请日期2008年10月22日 优先权日2007年10月22日
发明者理查德·J·拉恩, 约·W·哈延加 申请人:维森盖特有限公司