串行飞行时间质谱仪及其使用方法

专利名称：串行飞行时间质谱仪及其使用方法
技术领域：
本发明涉及质谱学领域，更具体地，与含有两个飞行时间质谱仪的设备中的一种高吞吐量、综合的串行质谱测量方法有关。
背景技术：
质谱仪是这样的装置，其使得样本蒸发和离子化，然后使用静态或动态的电场来测量所形成的离子的质荷比。串行质谱仪被用于对复杂的混合物中的化合物进行结构分析和识别。在每个应用之中，MS-MS程序具有相同的操作顺序·单个质荷比(m/z)的母离子的质量选择；·这些离子的分裂；·这些碎片的质谱分析。尽管存在着各种具有其自身利弊的串行MS-MS仪器，但是它们都具有一个共同特征——它们都每次使用一个母离子。其余的离子核素从原离子束中被去除和丢弃。
三重四极仪器是最常用的MS-MS仪器。持续的离子源，比如电喷雾(ESI)，将离子引入到被调谐的第一四极滤质器，从而只有感兴趣的离子穿过滤质器。其余的原离子束成分被拒绝和丢弃。所选离子被传送到所谓的“碰撞引致裂解”(CID)单元中，该单元填充有m托压力的气体和配备有射频(RF)四极导向。注入的离子的动能由滤质器的静电偏压控制，并且被调节为经由气体碰撞来促使离子分裂。碎片离子在CID单元中碰撞受阻，然后被引入到第二四极中用于质量分析。由于第二四极中的质量扫描需要时间，并且造成c.a.1000因子的额外离子损失，所以三重四极仪器最多地用于检测具有已知母离子和碎片离子质量的已知核素。
四极飞行时间串行质谱仪(QTOF)的引入极大增强了MS-MS仪器的吞吐量(参见Morris等人的Rapid Commun.Mass Spectrom，v.10，pp.889-896，1996)。三重四极被改型为，第二四极滤质器被替代为正交TOF MS(oaTOFMS)。该替代可提供对所有碎片一次进行并行分析的优点，因此在第二MS中提供更高的灵敏度和更快的采集、以及提供第二MS增强的分辨率和质量准确性。然而，四极仍然被用于母离子选择，伴随着拒绝一种核素之外的所有离子核素。这种并行分析的理念尚未扩展到母离子上。
另一常用的MS-MS装置使用保罗(Paul)离子阱质谱仪(ITMS)，在March，R.E.，Hughes R.J.的“四极存储质谱测量”(Willey-Interscience，NewYork 1989)中有所详述。离子源中产生的离子被周期性注入到ITMS中，并且在射频(RF)场的ITMS之内被诱捕。例如通过应用宽带共振AC信号，来去除“不需要的”核素，从而只有感兴趣的离子驻留于阱中。然后通过分离的AC场，来激励所选的母离子，以与前体(precursor)的长期运动共振。母离子在与缓冲气体的能量碰撞中获得动能和碎片。利用共振喷射技术，对碎片进行质量分析。RF场的幅度被这样倾斜，即离子按照它们的m/z值依次地离开阱。
还公知的是，将3-D保罗(Paul)阱与TOF分析器相连接，用于对碎片离子进行更为准确的质量分析，参见Quin和D.Lubman，Rap.Commun.Mass.Spectrom.10，1079，1996和Shimadzu的WO099/39368。在D.Douglas的美国专利5,847,486中、在Sciex的美国专利6,111,250、在Analytica的美国专利6,020,586中、在U of New Hampshire的WO 01/15201中，线性离子阱(LIT)已被连接到TOF分析器。所有离子阱串行主要被导向于多级MS-MS分析上。通过丢弃其他离子成分来选择母离子。
通过所用硬件的相似性，新近引入的串行飞行时间质谱仪(TOF-TOF)是如下所述发明的最接近的原型。TOF-TOF的实例在Schlag等人的美国专利5,032,722、T.J.Komish等人的美国专利5,464,985、T.Bergmann的美国专利5,854,485、M.L.Vestal的美国专利#WO99/40610和C.Hop.的WO99/01889中有所描述。在所有TOF-TOF串行中，脉冲离子束在第一高能TOF中被时间分离，并且通过定时离子选择器来过滤，从而只有感兴趣的离子进入CID单元中。该CID单元填充有低气压(通常在1毫托以下)的气体，以引入与缓冲气体的几乎单一的高能碰撞，充分用于离子碎片，但是仍然保持离子包的短暂持续时间。在第二高能TOF中分析碎片离子的脉冲束。为了处理较大能量扩展的碎片离子，第二TOF要么利用二次场电势，要么利用附加的脉冲加速度。
在A.Verentchikov的WO 00/77823中，TOF-TOF串行的变形采用将母离子缓慢注入到带有碎片碰撞阻尼的CID单元中，随后注入到正交的TOF中。从所用组件来考虑，该仪器是本发明的最接近的原型。分裂单元中的碰撞阻尼改善了在第二TOF前面的离子束特性，并且允许对碎片离子质量进行高分辨率和准确的测量。第一TOF在1kV能量和短暂时标下工作。CID单元前面的时闸每次仅容许一个母离子质量。
在所有描述的串行中，第一质量分析器(四极、离子阱或TOF)每次选择一个母体质量和拒绝所有其他成分。在某些应用中，比如在药物新陈代谢研究中，可接受的是跟随单一的感兴趣的化合物。然而，在复杂的混合物情况下(比如凝胶体外的蛋白质表征)，需要分析多个母离子。利用现有技术，对多个前体进行依次的MS-MS分析是冗长和迟钝的。
新近引入的串行IMS-CID-TOF利用时间嵌套采集的原理，其可能在没有离子损失的情况下来实施(D.Clemmer的WO 00/70335)。由于离子流动光谱仪(IMS)中的分离是在毫秒时标下发生的并且TOF质谱仪是在微秒时标下发生的，所以变得能够为每个离子流动碎片，采集碎片光谱。该技术的缺点是不良的IMS分离，其流动分辨率在R＝50以下，这对应于大约为10的质量分辨率。由于IMS-TOF串行利用了具有时间嵌套采集的综合串行质谱测量的原理，所以它可选作为本发明的原型。
在没有母离子损失的情况下进行MS-MS分析的想法还被用于B.Reinhold和A.Verentchikov的WO 01/15201中。离子通过共振激励被选择，并且在离子阱之间移动，而不拒绝其他离子成分。该过程是单调和耗时的，同时丢弃了来自离子源的离子。所谓的并行离子处理在Kirchner的WO92/14259中的多个离子阱中被使用，这里离子束在多个离子阱之间被分裂。通过降低灵敏度来节省时间。
仍然存在对于这样一种仪器的需要，该仪器并行地提供对多个母离子的快速和灵敏的MS-MS分析，而不拒绝来自离子源的离子。这样的仪器将进一步改善MS-MS分析的吞吐量，这是复杂混合物的分析中所需要的。

发明内容
本发明人已经意识到，利用两个飞行时间(TOF)质谱仪，能够实施嵌套时间分离的原理，即慢速TOF1用于母离子分离，快速TOF2用于碎片质量分析。因此，本发明的串行质谱仪的一般方法利用了两次飞行时间分离，其中对于相同的质荷比，第一分离步骤中的飞行时间比第二分离步骤中的飞行时间长得多，并且母离子的多样性在来自离子源的每单个来自注入时被分离、分裂和质量分析。
本发明的串行质谱仪包括脉冲离子源；飞行时间质谱仪(TOF1)，用于母离子的时间分离；分裂单元；第二飞行时间质谱仪(TOF2)，用于碎片离子的质量分析；以及数据采集系统。与原型的TOF-TOF系统相反，TOF1中的飞行时间实质上大于经过分裂单元的穿过时间和TOF2中的飞行时间。通过在低得多的动能(一般约为1至100eV)下操作更长时间的TOF1，同时在3至10keV能量下利用较短时间的TOF2，能够实现TOF1中延长的分离(一般在毫秒范围中)。对于对碎片进行分裂和质量分析而言，相邻母离子核素到达之间的时间变得充分。因此，本发明允许对多个母离子实时地进行快速的MS-MS分析，而不拒绝母离子。MS-MS采集周期持续数毫秒，并且能够被多次地重复，以改善灵敏度和信号质量。
为了避免离子损失，在大约100Hz的重复率下以脉冲模式操作离子源，其与MS-MS周期的毫秒时间兼容。矩阵辅助激光解吸/电离(MALDI)离子源是可用的脉冲离子源的一个实例。本发明还与广泛多样的连续离子源兼容，比如ESI、带有气体冷却的MALDI、化学电离和气体填充式光电离离子源。离子流在存储射频(RF)装置之内连续积累，并且周期性地脉冲喷射到TOF1中。所述存储装置可以是保罗(Paul)阱或存储多极，优选为四极。
根据作者的理解，新颖的时间嵌套TOF-TOF方法在不严重牺牲性能的情况下是无法在现有的TOF-TFO仪器上来实施的。本发明公开了五种新颖的TOF1分离器，它们在低离子能(1至100eV)下操作，以扩展分离时间。
这些新颖的TOF1分析器中的两种利用了约束射频(RF)场与DC二次场的组合，其以相对大的能量扩展度，提供了离子束的时间聚焦。这些分析器能够在从1至10eV的极低的离子能下操作。在一个优选实施例中，该新颖的TOF1分析器包括被DC镜包围的线性多极离子导向(优选为四极)。DC镜在两端被打开和关闭，以提供来自一个TOF1端的离子注入；多次离子反射；以及随后从另一端的离子释放。在另一优选实施例中，新颖的TOF1分析器包括穿过TOF1轴而定向的外部两行DC电极和内部两行的仅RF的杆。该结构形成了与沿着TOF轴的二次电势分布相结合的二维RF隧道。离子相对于该轴以小角度被注入到TOF1之中，沿着该轴经历多次反射，穿过该轴缓慢移位，并且在数次反射之后离开TOF1。
另外三种新颖的分析器是在大约100eV的中等能量下工作的静电装置。其中之一的“旋束管”包括一对在其间作用有DC电压的共轴圆柱形电极。离子相对于它们的轴以小角度被注入于所述电极之间。中等能量(100eV)离子在中央电极周围转向，同时沿着该轴缓慢漂移。在多次转向之后，离子经过切面边界离开TOF1，该边界由双面印刷电路板形成，以避免DC场的干扰。其他两种静电分离器是平面和圆柱形多路分析器，它们利用了同时像透镜一样作用的多个筛(griddle)镜。通过利用多路模式，来延伸有效飞行路径，从而不管能量有多高(与RF辅助TOF1相比)，仍可实现10ms的时标。
本发明与各种分裂方法相兼容，比如气体碰撞、与表面碰撞和通过光的作用。分裂单元的设计可被调整为减少传送时间和时间扩展。CID单元被选择为较短(大约1cm)、填充有相对高压(0.1毫巴以上)的气体、且补充有轴向DC场，以加速传送和调制与TOF2同步的离子束。表面引致裂解(SID)单元使用脉冲透镜，以便一起提供空间聚焦与时间聚焦(聚束)。与聚束透镜和TOF2脉冲同步(尽管有时间偏移)，脉冲探测电势将离子从SID单元中喷射出。
尽管第二飞行时间分析器的选择不是关键的，但是具有正交离子注入的TOF(o-TOF)在多数串行实例中更为合适。为了改善正交注入的效率(所谓的占空因数)，优选地，同步于和略微超前于正交注入脉冲，从分裂单元中喷射离子。
TOF-TOF串行被期望用以在适度的分辨率下分离母离子，其主要受制于第二TOF MS的速度，例如10μs。300阶次的估计TOF1分辨率(参见具体的描述)对于分离一组母离子同位素群来说仍然是足够的，并且比离子流动光谱仪(本发明的原型)中的母离子分离分辨率高得多。更高的分离分辨率可在更长的TOF1中实现，或者通过在CID单元前面的时闸对于离子的周期选择来实现。
本发明允许数据采集的多种策略。在最简单和强健的方式下，MS-MS数据被连续采集，并且多个母离子的MS-MS光谱随后被重构。但是，在两个阶段中进行MS-MS分析是更为明智的。在第一仅MS的阶段中，母离子被连续允许进入到TOF2之中，用于对母离子进行质量分析。关于母离子质量的信息被用于第二MS-MS阶段。时闸只在感兴趣的多个母体到达时才打开，以改善母离子分离的分辨率和避免来自化学背景的信号。还获取TOF2信号用于所选的时间窗口，以仅仅拒绝无意义的数据流。关于母离子的相似信息可利用位于TOF1之后任何地方的可选联机检测器来获得。
除了高灵敏和快速的MS-MS分析之外，本发明提供多种仅MS的分析。为了及时扩展峰值，TOF1可单独用于仅MS的分析，避免了检测器饱和，并且利用并不昂贵和缓慢的瞬态记录器。在利用通路(pass)模式下的TOF1的同时，可在TOF2中获得更佳质量的母离子光谱。从多个源注入中均分的MS-MS数据中，可重构所谓的“母体扫描”，即具有特定碎片集的母离子的光谱。最后存储该数据仅用于母体(parent)质量。
由于在单个离子注入中为感兴趣的所有前体离子获得MS/MS光谱，所以本发明提供杰出的MS/MS分析速度，其估计为每秒10至30个全周期。MS-MS分析的速度与色谱分离的时标相兼容，由此，当没有在离子阱和Q-TOF中当前所用的任何预先限制(比如“基于数据的采集”)时，实时的LC-MS-MS分析是可能的。本发明的MS-MS串行的高采集速度和灵敏度还预先为利用嵌套LC-LC分析开放了机会。


本发明在所附权利要求中被具体地指明。参考与附图相结合的如下描述，本发明的以上和其他优点可得到更好地理解，在附图中图1是示出本发明的方法的方框图；图2是串行TOF-TOF质谱仪的操作时序图；图3是新颖的串连TOF1的示意图；图4是新颖的W形TOF1的示意图；图5是真空脉冲MALDI离子源的示意图；
图6是具有碰撞阻尼的脉冲MALDI离子源的示意图；图7是具有脉冲存储四极的连续离子源的示意图；图8是CID单元的示意图；图9是SID单元的示意图；图10是正交TOF2的示意图；图11是共轴TOF2的示意图；图12是具有串连TOF1和CID单元的TOF-TOF示意图；图13是具有W形TOF1和SID单元的TOF-TOF的示意图；图14是具有静态共轴TOF1的TOF-TOF的示意图；图15是平面静电多路TOF1的示意图；以及图16是圆柱形静电多路TOF1的示意图。
具体实施例方式
本发明的串行质谱测量分析方法包括如下步骤1.在离子源中产生离子脉冲，该离子脉冲含有不同解析离子的混合物；2.在工作于低能下的第一飞行时间质谱仪中实时地分离解析离子，由此在其质量的序列下产生离子包的串；3.依次地分裂解析离子，而不混合所分离的离子包；4.以比第一分离步骤的时标短得多的时标，在第二飞行时间质谱仪之内，对碎片离子进行快速质量分析；5.在来自于离子源的单一离子脉冲下，对于多个解析离子质荷比，获取碎片质谱；6.可选地，在多个源脉冲上将每个解析离子的碎片光谱相加；7.该方法的关键在于，对于相同的质荷比，将第一TOF中的分离时间安排得比分裂时间和碎片质谱分析时间长得多。对于来自离子源的每单个离子注入的母离子的多样性，时标上的实质差异被用来分离、分裂和质量分析这些碎片。时标中的实质差异是通过在第一TOF中选择更长的飞行路径和/或更低的离子能来实现的。
方框图参考图1，该方法通过主要的串行MS-MS组件的方框图来示出。利用时间嵌套采集的通用TOF-TOF仪器(11)包括顺序通信的脉冲离子源(12)；第一飞行时间质谱仪TOF1(13)；分裂单元CID/SID(14)；第二飞行时间质谱仪TOF2(15)；用于数据嵌套采集的数据系统(16)。该脉冲离子源由电压源(17)以小的电势差相较于TOF1光谱仪而偏压，TOF1由电压源(18)以一电势差相较于CID单元而偏压。可选的定时闸(19)可插入于TOF1(13)和CID单元(14)之间以增强TOF1分离。
操作简而言之，在操作上，脉冲离子源产生解析(母)离子的离子脉冲，并且在电压源(17)的控制之下，在1至10eV之间的较小能量下，将离子注入到TOF1中。这是本发明和现有技术之间的关键区别，因为TOF光谱仪通常在3至30keV之间的能量下工作。TOF1中的分离在数毫秒下发生。作为指导实例，让我们考虑TOF1的有效长度＝8m，离子能E＝3eV，离子质量m＝1000a.u。在该实例中，离子速度是V＝800m/s，飞行时间是10ms。时间分离的母离子在增加的能量(由TOF1和CID单元之间的DC偏压来控制)下被顺序地从TOF1喷射到CID单元之中。与气体分子的能量碰撞将母离子转换成碎片。随后的气体碰撞造成碎片离子的碰撞阻尼。碎片快速地穿过该单元，并且被注入到TOF2光谱仪之中。TOF2在10和100μs之间的短得多时标下分离碎片离子。TOF1和TOF2时标的大幅度差异允许多个碎片光谱的数据采集，其对应于源脉冲之间的不同母离子。专用数据采集系统(16)以时间嵌套的方式，采集多个碎片光谱，这里单独的光谱并不混合在一起。每个母离子的碎片光谱在多个离子源脉冲上被整合。由此，离子源中产生的离子脉冲被用来为多个母体采集整套的MS-MS数据，而不是在所有阶段都拒绝离子。
时序图参见图2，典型的时序图说明了本发明的方法、单独装置的同步和时间嵌套数据采集的原理。顶部的图(21)表示采集周期，其中每10ms发生离子注入，即每秒100次。母离子在10ms时间之内在TOF1中被分离，CID单元接收离子包的串，这些离子包按照母离子质量来排列(图(22))。母离子在单元中被部分地分裂，因为单元中短暂的传送时间，所以碎片与其母体几乎同时地到达TOF2(图(23))。每个新的离子族(即母体和子体)每10μs被正交地跳动(pulse)到高能TOF2之中，为每个母体质量产生TOF2光谱(图(24))。每个TOF2光谱得到了TOF2脉冲相对于源脉冲的时间标记，即TOF1时间标记。具有相同TOF1时间标记的光谱在多个离子源脉冲上被相加，如虚线所示，以相同TOF1时间标记来连接两个TOF2光谱。
强健模式在上述操作模式中，时间嵌套采集是以直截了当的方式来进行的。不考虑来自离子源的离子束成分，仪器操作参数保持相同，并且始终采集数据。所有这些信息，比如各种母体的母离子光谱和碎片光谱，在随后的数据分析中被提取。
基于数据的采集-DDA在被称为“基于数据的采集”的另一操作模式下，MS-MS分析在两个步骤中发生。在第一步骤中，母体的质谱在TOF2中被采集，同时，TOF1和CID单元连续地传递离子而无分裂。在第二步骤中，该仪器被操作为MS-MS，即TOF1分离母离子，分裂单元形成碎片，TOF2以时间嵌套数据的方式采集碎片质谱。当没有母体进入时，时间嵌套采集是通过利用关于母离子质量的信息和避免在消隐时间下的数据采集来加强的。可选的定时闸(19)可用来增强TOF1分离以及抑制化学噪声。自然而然地期望，从TOF1中出来的离子包比在CID单元出口处的相同离子包要更短。该定时闸仅在与母离子的到达相对应的多个狭窄时间窗口处容许离子。这样的选通抑制了来自化学背景的离子信号，并且改善了检测极限。闸操作还可用于通过牺牲灵敏度来增强质量相近的母离子对的分离。几组MS-MS数据被采集，同时，该定时闸每次仅容许一对之中的一个母体质量。
已经描述了一般方法，为了清楚起见，具体的实施例将首先在单独组件的层次上被讨论，然后仅作为集成的TOF-TOF设备实例来说明。尽管某些所用组件在本领域中是公知的，但是它们的结构和参数被加以变化以适合本发明的目的。为了理解所选的折衷，让我们先看看TOF-TOF方法和设备中的主要挑战。
一般异议本发明的方法是高度违反直觉的，因为它会因为多种原因而被认为是不可实现的。本领域的技术人员可能提出如下异议
1.由于该源中的离子能扩展度可与TOF1中的离子能相比，所以TOF1分辨率将极低；2.由于弱的加速场中大的回转时间(初始速度扩展所造成的时间扩展)，TOF1分辨率也将受到影响；3.由于TOF1的预期大的长度，和由于TOF1中的慢速离子束的高度发散，经过TOF1的离子损失被预期为破坏性的；4.由于真空阶段的TOF1和气体填充的CID单元应当被小的孔隙隔离开，离子损失被预期为甚至更高；5.同时，似乎不可能具有10至100μs的时标下经过CID单元的快速传送。大多数现有CID单元具有200至10,000μs的时间扩展；6.TOF技术中当前使用的商用数据采集系统都不能够处理预期的数据流速。
上述异议通常集中于TOF1上，并且是从关于在高能下工作的现有TOF质谱仪的知识中产生的。本发明人已经意识到，TOF1的多个方案能够以适中的分辨率进行慢速分离。TOF1分辨率的改善是通过利用具有四极电势分布的离子镜来进行的，该离子镜公知地用以补偿能量扩展度。该现象与弹性振动相似，其中周期不依赖于振动幅度。二次场在TOF领域中被很好地探究。参见Int.J.中的Makarov等人的“质谱和离子处理(Mass Spectrom and IonProcesses)”，v.146/147，1995，pp.165-182。遗憾的是，这样的分析器还引入大的束发散。本发明人还意识到，低能TOF可通过在至少一个方向上引入离子束的射频约束来改善。RF约束消除了离子束发散，还消除了表面带电，这对于低能量设备是至关重要的。已经发现一种新型TOF，其将RF约束与轴向DC二次电势一起组合。
串连TOF参见图3，新颖的低能量飞行时间分离器31的优选实施例包括仅RF的多极(32)；两个静电镜(33)；以及脉冲发生器(34)。静电镜由与一连串分流电阻器(35)互连的多个电极构成。静电镜(33)的外部电极连接于脉冲发生器(34)，静电镜(33)的中间电极接地。末端场被孔隙(36)终止，且电势被调整为脉冲发生器(34)上的全电势的一部分。
在操作中，RF场提供了径向约束，如图3的箭头(37)所示。径向RF约束不影响沿轴的离子运动。轴向抛物线电场是由多极杆之间的场穿透所形成的。抛物线场提供了具有这样的周期的离子轴向反射，其总的取决于离子能，与离子m/z的平方根成比例。静电镜末端上的脉冲电势允许在离子注入到TOF1中、离子在TOF1中反射(39)、随后离子在TOF1的另一端上释放之间的切换。有效的飞行路径LEFF比TOF1长度L高N+1倍，其中N是全转向(turn)的次数。总的来说，RF约束和多次反射允许延长的时间分离，而没有离子损失，同时，二次电势增强了TOF1分辨率，并允许以相对高的能量扩展度来分离慢速离子束。
理想的二次方案由于自由飞行段出现在TOF1的路径之中和之外而被改变。按照Makarov等人的上述公开物，即使在基本场自由飞行的情况下，这里是c.a.30％的LEFF，2000的质量分辨率对于具有多至50％的相对能量扩展度的离子脉冲来说是可实现的。为了保持0.3LEFF以下的自由飞行路径，该方案需要至少5次反射，其对应于2次全回转。这有助于将LEFF增加到7.3L，但是将母离子的质量范围减少到2个因子，即MMAX/MMIN＜2。
W-TOF参见图4，新颖的低能飞行时间分离器(41)的另一优选实施例包括RF通道(42)，被一组静电电极(43)包围；终止电极(44)；以及偏转器(45)。RF通道由多个杆(46)形成，这些杆具有交替的RF相位，并沿着Y轴排列。静电镜(43)的电极也沿着Y轴排列，并且经由一连串分流电阻器(47)来连接。
在操作中，具有交替RF电势的杆(46)形成RF隧道，在Z方向上约束离子。电极(43，44)上的电势是由电阻器链来分布的，以沿着X轴形成二次电势，且最小值位于TOF的中央平面处。外部DC电极的场穿透到RF通道之中，提供较弱但是仍然是二次的电势分布。不考虑边缘场，在Y方向上没有场。离子以小角度被注入到X轴，并且被偏转板(45)加以偏转，以利用平均能量使离子的偏转角加倍。该偏转减少了X能量扩展所造成的Y空间扩展。离子运动是由沿着Y方向的缓慢漂移和沿着X方向的多次反射组合的。总的来说，离子轨道具有波浪形状，其在RF隧道的边界处结束。离子在TOF的出口处获得一些空间扩展，该空间扩展可通过离子后加速和透镜聚焦来部分地补偿。
按照发明人的SIMION仿真，即使在50％能量扩展度处，该50×30cm装置仍然允许N＝4至5对的反射而不混合相邻转向的离子。该装置的有效飞行路径等于L*π*N，并且达到LEFF＝7.5cm。RF场并不将TOF1分辨率限制为上至R＝1000。显然地，第二类型的TOF1，其可被称为RF约束的W形TOF，提供了TOF1中更简单的操作和更长的飞行路径，由此改善了通常受到两个TOF分析器之间飞行时间比的限制的TOF1中的分离。TOF1的复杂性可通过利用印刷电路板(PCB)装配来降低。
答复异议在这两种新颖的TOF质量分离器中，每次反射的周期大体上独立于离子能，并且与离子m/z的平方根成比例。离子通过RF场来约束，并且离子损失实际上被消除。引入新颖的低能TOF分析器使得本发明切实可行，解决了上述异议1.相对高的能量扩展度通过离子镜中电势的二次分布来补偿，该分布是通过DC电场穿透到多极导向或隧道中来建立的；2.由于TOF1在相对高的能量扩展度下工作的能力，与常规TOF相比，它能够在低得多的离子能下和在长得多的时标下工作。结果，该设备可忍受来自离子源的长得多的离子脉冲，并且回转时间不再是障碍；3.TOF1和TOF2的时标的大幅度差异允许时间嵌套数据采集；4.离子损失可通过在射频导向或隧道中引导离子实际上被避免；5.RF场的离子约束和CID单元前面的离子后加速允许将离子束完全传送到CID单元中；6.CID单元中的时间扩展是通过利用具有附加轴向DC场的短的高压单元来减少的；以及7.具有既大又快的均分化(averaging)存储器的瞬态记录器近来被瑞士公司Acquiris(www.acquiris.com)引入。
在单独组件的层次上继续具体的描述脉冲离子源、分裂单元和TOF2，其专门为了本发明的方法和设备的目的而加以适配。将对于时间扩展方面给予特别的关注。
真空MALDI源参见图5，本发明的TOF-TOF方法和设备利用脉冲MALDI离子源(51)，其包括源外壳(52)、具有分析样本(54)的样本板(53)、脉冲激光(55)、低压电源(54)和出口孔隙(56)。
在操作中，分析样本在现有技术所公知的矩阵之内来制备，并且被沉积在样本板(53)上。脉冲激光(55)照射样本，并产生解析离子的短暂脉冲。公知地，离子将以300至600m/s速度来喷射，该速度与用于1kD离子的在0.5和1.5eV之间的初始离子能相对应。离子被数个伏特的电势偏压加速。可估计，1kD离子以数微秒的时间扩展和少于1eV的能量扩展，离开离子源。真空MALDI离子源的主要缺陷是离子时间不稳定性，在常规的高能MALDI中有所详述。本发明可应用于更软(softer)的MALDI离子源，其利用软矩阵或红外线激光。离子的时间稳定性可通过碰撞冷却来改善，如下所述。
填充气体的脉冲MALDI参见图6，本发明的TOF-TOF方法和设备利用了填充气体的脉冲MALDI离子源(61)。源(61)包括真空MALDI源的特征，比如源外壳(62)、具有分析样本(64)的样本板(63)、脉冲激光(65)、低压电源(66)和孔隙(67A)。源(61)还包括气体入口(68)，将气体馈送到外壳(62)之中；附加的泵级(69)，终止于出口孔隙(67B)，以减少TOF1泵上的气体负载。
在操作中，经由气体入口(67)以缓冲气体填充源外壳(62)。源外壳中的气压被维持在0.01至1托之间，以提供离子碰撞冷却(参见www.asms.org中的Verentchikov等人的ASMS会议1999)。具有两个1mm孔隙(67A、B)和两个常规250l/s涡轮泵(一个泵动式TOF1)的差动泵系统在超过1E-6托的TOF1中维持真空。激光脉冲从样本中产生快速(1至3ns)离子喷射。激光(65)是高能激光，用以提高离子产量。与缓冲气体的碰撞放松了离子内部能量。与气体的碰撞还将离子动能几乎抑制为热能——0.01至0.1eV，仍然保持离子束的脉冲性质。在样本板上的c.a.1V DC偏压的辅助之下，通过经过孔隙的气流，对离子进行采样。然后，在孔隙(67A、B)之间的DC偏压控制之下，离子被加速到动能，并且离开离子源。内部冷却的离子是稳定的，并且幸免于TOF1中的长期分离，而没有离子分解。总的来说，MALDI源中的气体阻尼有助于本发明的TOF-TOF方法，同时使得时间和能量扩展度在界线10μs和1eV之内，对于缓慢的TOF1分离是可行的。
连续离子源参见图7，本发明的TOF-TOF方法和设备利用脉冲离子源(71)，其包括具有软电离的连续离子源(72)，带有出口孔隙(73)；填充气体的RF诱捕装置(74)，装入附加的泵级(75)中。连续离子源选自于如下列表电喷射(ESI)、APCI、填充气体的MALDI、PI或CI。该诱捕装置选自于如下列表3-D保罗(Paul)阱、具有轴向喷射的线性的仅RF的多极、具有径向喷射的弯曲RF多极。优选地，具有轴向喷射的线性四极离子阱。四极(74)被DC电极(76)和孔隙(73，77)包围。
在操作中，该四极填充有1至100毫托压力下的缓冲气体。差动泵系统(75)减少了TOF1泵上的气体负载。离子在离子源(72)中产生，并且持续填充仅RF的四极离子导向(74)。气体碰撞抑制离子动能，在四极轴上和在电极(76)和孔隙(77)所建立的DC阱(well)的底部上约束离子。周期性地，电极(76)和出口孔隙(77)上的电势被调整为将轴向上的存储离子喷射到TOF1中。可估计，离子脉冲具有小于1eV的能量扩展度和小于10μs的时间扩展。
在所有上面的实例中，脉冲离子源能够产生具有小于1eV的能量扩展度和小于10μs时间扩展的离子脉冲。期望的300至500的TOF1质量分辨率(足以分离同位素群)需要600至1000时间分辨率。由于10μs的初始时间扩展，1kD离子的飞行时间需要至少为10ms，这在数个电子伏特离子能和5至10m的有效飞行路径下是可实现的。上述的多转向TOF1分析器提供了0.5tolm装置之内的10m有效路径。下一逻辑问题是离子是否能够在10μs之内分裂，从而不会破坏基本的分离。
CID单元参见图8，TOF-TOF方法利用了短暂、高气压CID单元(81)用于离子分裂。CID单元(81)包括真空外壳(82)；入口透镜(83)、CID室(84)，连接于气体入口(85)；具有可选DC电极(87)的RF聚焦装置(86)，封闭于CID室中；以及出口离子透镜(88)。CID单元还包括可选的定时离子选择闸(89)。气体入口将缓冲气体馈送到CID室中。CID室(83)包括孔隙(83A、B)。真空外壳(82)包括孔隙(82A、B)和真空泵(82C)。RF聚焦装置优选为仅RF的四极。
常规的CID单元，一般长为10至20cm，在c.a.10毫托气压下工作。为了提供快速离子传送，本发明中所用的CID单元短得多，一般为5至10mm，并且在高得多的气压(300毫托以上)下工作。高压区域在室84中聚集，并且被差动泵的附加层包围。孔隙84A、B，一般直径为1.5mm，将流入真空外壳之中的总气体限制为c.a.0.1Torr*L/s。泵速为300L/s的泵82C将真空外壳抽空至c.a.3E-4Torr。孔隙82A、B，一般直径为1.5mm，进一步减少流入TOF1和TOF2中的气体，其在3E-7Torr以下的气压下工作。为了避免气体放电，RF幅度被减少到300V以下，伴随着频率下降到1MHz以下。
在操作中，离子在该单元的前面被加速到足够用于离子分裂的能量，一般为50eV/kDa。在透镜83的聚焦下，离子包经过孔隙82A和84A进入该单元。在300毫托气压下，气体密度等于n＝1E+22m-3，横截面为σ＝100的1kD质量的离子具有平均自由路径λ＝1/nσ＝0.1mm。对于L＝1cm的一般四极长度，离子经历c.a.100次碰撞。比离子/气体质量比高3倍的碰撞次数足以保证具有后续阻尼的分裂。第一能量碰撞将离子动能转换成离子加热，造成离子分裂。一旦离子释放动能，后续的气体碰撞稳定了碎片离子，进而抑制它们的动能，并且由于RF场聚焦，将离子约束在轴上。CID单元中的碰撞阻尼现象在Don Douglas的美国专利中有所详述。
离子束在CID单元中的时间扩展是本发明中所主要关注的。在调整TOF1的同时，假设高压区域之前的行进时间，并且该行进时间仅造成时间延迟，而不是时间扩展。即使在短的CID单元中，气体碰撞可能造成很大的时间扩展。为了减少该扩展，通过孔隙84A、B的DC电势所建立的静电轴向场，来辅助离子穿过该单元。在内接直径D＝1cm和长度L＝1cm的一般的四极处，边缘场在被小于2的因子的抑制之下穿透到RF四极之中。20V的加速电势经过速度为c.a.500m/s下的气体来提供离子阻力，将全通过时间限制于20μs以下，将时间扩展限制于10μs以下。控制通过时间，有助于在离子注入到TOF2中之前，使离子成束聚集(即，压缩离子脉冲持续时间)。CID单元中的加速场在同步(具有时间偏移)于TOF2注入脉冲的同时被调制。
SID单元参见图9，本发明的TOF-TOF方法和设备利用了分裂单元(91)，其具有用于离子分裂的表面引致裂解(SID)。SID单元(91)包括聚束(时间聚焦)、空间聚焦和转向透镜(92)；探测器(93)，涂布有碳氟化合物单层；脉冲发生器(94)，附着于探测器；DC加速列(95)，被接地屏蔽(96)包围。DC加速列包括网格(97)，其连接于脉冲发生器(98)。
在操作中，时间分离的母离子的离子包被脉冲加速到c.a.50eV/kDa的特定能量，被透镜(92)聚集成束。磁体部分(TOF串行)中先前所用的聚束是公知的用以将离子包持续时间压缩至dT＜1μs以下。透镜(92)将母离子包(99)聚焦和调整到探测器(93)的中央上。离子束以一定角度(比如45度)撞击其表面。与碳氟化合物单层表面的中等能量撞击是公知的用以引致缩氨酸和小分子离子的分裂。碎片离子以c.a.500至2000m/s的速度，跳离表面，在原离子包持续时间的dT＜1μs之内，行进不到2mm。在撞击期间，小的延迟电势被作用于网格97，防止碎片离子泄漏到TOF2分析器之中。在适当的延迟之后，对应于整个原离子包的撞击，脉冲发生器94和98被触发，并且电脉冲被作用于探测器93和网格97。碎片离子被脉冲加速到TOF2分析器之中。
与CID单元相比，SID单元具有如下优点1.在低压下工作，由此降低对泵系统的要求；2.在分裂步骤中去除时间扩展；3.接受更宽的原离子束；4.SID的缺点是5中等质量离子的分裂图案较差的特征；6.碎片离子的较高能量扩展，降低了TOF2分辨率；7.TOF2分析器中碎片离子的亚稳态衰减。
CID单元更适用于串连TOF1，而SID单元更适用于W-TOF1。
参见图10，本发明的TOF-TOF方法和设备利用了常规的正交TOF(101)，用于碎片离子的质量分析，其优选地与CID单元相结合。o-TOF(101)包括正交脉冲加速器(102)、离子镜(103)、漂移自由飞行区域(104)、TOF检测器(105)和串连检测器(106)。两个检测器连接于数据采集系统，其包括快速均分化瞬态记录器(107)。TOF分析器(101)被封闭于真空室(108)中，并且被泵(109)抽空。
o-TOF的操作在现有技术中有所描述。加速到c.a.10eV的连续或脉冲离子束进入加速区域。周期脉冲将离子正交加速到c.a.3keV，并且将离子注入到TOF分析器之中。离子在离子镜中得以反射，并且撞击TOF检测器105。初始离子束的一部分在串连检测器106上被采集。为了适应碎片离子的快速分析，o-TOF的参数被稍加改变。该分析器比较小(L＝10至20cm)，在较高的TOF能量(5至15kV)下工作，以适应较高的重复率(c.a.100kHz)。小型分析器允许在略微低于1E-5Torr的气压下进行操作。还通过利用高电流的辅助电子倍增器(SEM)或混合型MCP/PEM用于检测器，以及通过利用快速均分化瞬态记录器用于数据采集系统，来改型常规的TOF分析器。小的长度和短的飞行时间对TOF2分辨率施加了限制。为了改善TOF2的分辨率，可增加TOF2中的飞行时间，同时通过如下任一方式来限制容许离子的时间窗口1.IMS扫描之间插入10μs时闸，利用TOF2的较慢脉冲速率；2.在100KHz速率下使TOF2搏动，将TOF2之内的离子转移到数个检测器上；3.在100kHz速率下使TOF2搏动，在TOF2中利用位置灵敏检测器。
当没有离子从TOF1中进入时，TOF2可选地配备有串连检测器，以避免在消隐时间中采集信号。
常规TOF2参见图11，TOF-TOF方法还利用常规的反射TOF(111)用于碎片离子的质量分析，其优选地与SID单元相结合。TOF(111)包括内置SID单元(91)、电漂移自由飞行区域(112)、具有检测器屏蔽(113)的检测器(114)、离子镜(115)、真空外壳(116)、泵(117)和用于数据采集的瞬态记录器(118)。
在操作中，碎片离子的脉冲在SID单元91中被加速，飞过场自由区域112，在离子镜115中得以反射，并且撞击检测器114。离子轨道如线条119所示。来自检测器的信号在瞬态记录器118上被采集。再次为了快速数据采集的目的，该分析器较短(L＝10至20cm)，在高的加速电势下工作，以适应100KHz的高重复速率。
具有上述的单独组件，变得更容易掌握集成的TOF-TOF方法和设备的概念和细节。在下面可发现本发明的TOF-TOF串行的具体实例，但是并不限制可行组合的多样性。
具有串连TOF-CID-o-TOF的MS-MS参见图12，TOF-TOF仪器(121)的一个优选实施例包括顺序连接的脉冲源(71)(具有连续离子源(72)、存储四极(74)和电极(76，77))、串连飞行时间质谱仪TOF1(31)(具有被两个脉冲离子镜(33A、B)包围的仅RF四极导向(32))、短的填充气体的碰撞CID单元(81)(具有被孔隙(84A、B)包围的RF四极(86))和第二正交飞行时间质谱仪o-TOF2(101)(具有脉冲加速器(102)，配备有模拟数据采集系统(107))。各组件已经在上文中有所描述，并且在图3、7、8和10中示出，并且在进一步的讨论中保持它们的先前编号。
在操作中，连续离子源71将母离子馈入存储四极74之中。通过DC电极76和出口孔隙77的脉冲电势，离子每10至20ms从存储四极中喷射出一次。含有各种母离子的喷射离子包不到10μs长，并且具有不到1eV的能量扩展度。喷射离子脉冲的平均能量通过选择电极76、77的脉冲电势而调整为c.a.2eV。通过降低第一镜33A的电势，容许离子进入到TOF1分离器之中。离子被四极RF场径向诱捕，但是沿着四极轴自由行进。一旦所有质量的母离子(限于比率Mmax/Mmin＝2)穿过第一镜，第一镜33A被打开。第二镜33B在前一周期之内已被打开。离子沿着TOF1轴，在具有二次电势分布的两个镜之间，经历多次反射，优选为5次反射。振动周期总的独立于离子能，并且与母离子质量的平方根成比例。分析器的有效飞行路径最多达到比TOF1物理长度长2π+1α＝7.3倍。在优选的5次反射之后，通过降低第二镜33B的电势，从TOF1中释放出离子。时间分离的离子包的串进入CID单元。时间分离的一般时标是10ms，其作为1kDa离子的飞行时间来测量，并且与母离子质量相对应的每个包的持续时间近似为10μs。对应于500质量分辨率，以c.a.1000时间分辨率来分离母离子。
在离开TOF1之后，每个离子包被加速到特定能量50eV/kDa，足以引致气体碰撞中的分裂。离子通过透镜系统来聚焦，并且经由孔隙82A和84A，被注入到高压CID单元之中。离子在该单元中分裂，并且碎片离子被RF场碰撞阻尼和约束。该单元通过两个CID孔隙84A、B的脉冲电势来有效地清空，其同步于TOF2脉冲，并且相对于TOF2脉冲有时间偏移。离子进入正交加速区域102，在时间上相分离地注入到TOF2分析器之中，由此在TOF2中进行质量分析。同步注入到TOF2中，消除了时间差距，即在TOF2脉冲之间几乎不损失碎片。同步的注入还改善了TOF的占空因数。大多数碎片离子在TOF2脉冲时间被包含于加速区域102之内。
TOF2光谱为每次分离出的母离子质量呈现碎片光谱。具有相同TOF1标记的光谱(即与相同m/z的母离子相对应)在多次源注入上被相加。在1秒采集之内，该数据将包含1000个碎片光谱，其在100次源注入上均分化。
在上述设备中，有三种几乎相等(c.a.10μs)的时间扩展源，恶化了TOF1分离的分辨率离子源中获得的时间扩展；CID单元中的时间扩展；由于TOF2数字化(即离散时间下采集频谱)。假定这三个源之间无相关性，整个时间扩展被估计为17μs(比每个扩展高3的平方根)。TOF1分离的结果分辨率变得等于300，其仍然被认为是用于母离子分离的合理分辨率。为了比较，商用MALDI TOF-TOF中的TOF1分辨率是c.a.100，高灵敏模式下的Q-TOF中的四极分辨率是c.a.300。本发明的TOF1的分辨率可能通过下述方式之一来改善将TOF1的长度增加到1m以上；优化TOF1之内的离子能；应用具有多个狭窄质量窗口的定时闸，这些定时闸被插入于扫描之间；更快地搏动TOF2，将离子转移到数个检测器上；在TOF2中使用位置灵敏检测器。
具有W-TOF-SID-共轴TOF的MS-MS参见图13，本发明的TOF-TOF设备的另一优选实施例包括填充气体的脉冲MALDI离子源(61)；新颖的W形TOF1(41)；SID单元(91)；以及共轴TOF2(111)。源(61)包括填充气体的室(62)；样本板(63)；激光(65)；以及低压偏压电源(66)，连接于样本板63。TOF1 41包括偏转板(45)；具有终止板(44)的两个静态反射器(43)；以及二维RF隧道(42)。静态反射器(43)围绕RF通道42，以形成二次电势分布。SID单元9包括聚束和聚焦透镜(92)；和探测器(93)，涂布有碳氟化合物单层。TOF1 111包括辅助电子倍增器SEM(113)，连接于瞬态记录器(114)。源61和SID单元91被放置为离线(off-line)，以允许TOF1 41之内的多次离子反射。上述所选的元件组合主要被选用来示范说明元件之间的交互(在先前的TOF-TOF实施例中未描述)。
在操作中，激光65脉冲以50至100Hz的重复速率，从样本板63产生原离子的短暂脉冲。源室62填充有气体，以放松离子内部能量，并且防止离子分解。经过电场的薄气体层和气流，对离子进行采样，从而使离子包保持在10μs以下，并且具有不到1eV的能量扩展度。离子包被低压偏压电源66再次加速数个伏特电势，并且相对于Y轴以较小的角度被注入到多反射TOF1 41之中。转向板45使得该角度加倍，以减少与Y轴能量扩展有关的X方向上的空间扩展。TOF1之内的离子运动具有三个独立分量在Z方向上，约束RF场中的振动；以几乎独立于离子能的周期，沿着Y轴多次反射；以及沿着正交X轴的缓慢漂移。在数次Y反射之后，离子离开TOF1，并且按照它们的m/z比来排列、在时间上被分离为离子包的串，进入SID单元91的聚束透镜92。小的离子能下的多次反射允许在10ms阶次下的延长的时间分离。由于TOF1中的二次DC场补偿了离子能扩展，所以TOF1中的分离并不增加离子包的所述10μs时间扩展。因此，在离开TOF1之后，母离子以c.a.300至500的质量分辨率被分离。
周期性地，比如每10μs一次，离子被脉冲透镜92时间聚束成c.a.1μs的包和空间聚焦成c.a.1mm。脉冲聚焦的离子包撞击涂布有碳氟化合物单层的SID探测器93的表面。与表面的撞击引致离子分裂。从表面缓慢移动的碎片在1μs时间之内扩展c.a.1mm。应用于探测器93的延迟电脉冲加速了碎片离子，并且将它们注入到第二TOF2 111分析器之中。碎片离子的初始参数(即探测脉冲之前的参数)良好得足够用于以两千的分辨率在TOF2中进行质量分析。以高的动态范围在SEM114上检测信号。信号被传递到瞬态记录器113，并且数据以时间嵌套的方式来采集。表示各种母离子的碎片光谱的TOF2瞬态并不被混合在一起。每个碎片质谱获得TOF1分离的时间标记，其作为源脉冲和聚束透镜脉冲之间的时间来测量。TOF1时间标记携带有关于母离子m/z比率的信息。具有相同TOF1时间标记的TOF2光谱在多个激光脉冲上被均分化，以改善信噪比。
发明人强调这一点，本发明的综合TOF-TOF方法可利用更简单的静态TOF1来实现。在下文中可发现静态分离器的数个实例。离子束保持为静态场，需要在大约100eV的相对更高能量下操作。毫秒分离时间是通过延伸飞行路径和利用专门设计的静电场的聚焦性质来实现的。
旋束管参见图14，低能飞行时间分离器(121)的另一优选实施例包括静态透镜(122)、偏转器(123)和分析器，由入口单元(124)、两个共轴电极(125)和(126)(其间作用有DC电压)、以及出口单元(127)(跟随有偏转器(128)和透镜(129))构成。上述装置被公知为旋束管，并且在如下文献中有所描述Bakker I.M.B，The Spiratron-InAdv.In MassSpectrom.，London，1971，v.5，pp.278-280。通过利用该装置作为串行TOF系统中的低能分离器，可引入新颖性。
在操作中，来自脉冲离子源(71)的离子束通过透镜(122)被变换到宽得多的束(具有成比例较小的角度扩展)中(“准平行的束”)。该束被偏转器(123)偏转，以向电极(125)和(126)的轴提供受控倾斜角α。对于本领域技术人员显而易见的是，相同的效果例如可通过将电极(125)和(126)定位于固定角来实现。离子束经由入口单元(124)中的孔隙，进入电极(125)和(126)之间的静电径向场。入口单元(124)的一个优选实施例由3个双面印刷电路板(PCB)构成。这些板的外表面面向偏转器(123)，并且在其上具有镀金属，以建立等电势的表面。这些板的内表面面向电极(125)和(126)之间的间隙，并且含有一组镀金属条带。这些条带连接于电阻电压分压器，该分压器提供电压分布，该电压分布与电极(125)和(126)之间的理想对数电压分布相匹配，由此最小化该场沿着离子轨道的扰动。出口单元(127)可具有相似的构造。
在离子穿过入口单元(124)之后，它们沿着缠绕在电极(125)周围的螺旋轨道开始移动，并且按照它们的质荷比，在飞行时间上分离。为了最小化离子束大小，该螺旋需要是圆环形的。这可在电极(125)和(126)之间的电压U对应于平均离子能V1时实现U=2V1ln(r2r1)]]>其中r1和r2相应地是电极(125)和(126)的半径。在多次旋转之后，离子在沿着轴具有漂移距离H后，经过出口单元(127)退出场。出口单元(127)的构造与注入单元(124)的构造相似。旋转的最大次数主要由离子束的全角扩展Δα(Δα＜＜1)来限制，Δα依次由初始离子束kT的有效温度来限制▿α≈PMkTV1]]>其中M是透镜(122)的放大率，系数p取决于所需的置信水平(对于95％的离子，p≈4；对于99％的离子，p≈5；对于99.9％的离子，p≈6.6)。在本实例中，我们选择M＝5和p＝5，这将Δα限制为1/45，即近似1度。然后，轨道的最大总长度是L1≈H▿α·cos(α)≈H·MpV1kT]]>例如，对于长度H＝0.5m，kT＝0.05eV，V1＝100V，M＝5，则总的飞行路径是L1≈22m。我们将TOF1和TOF2之间时标的比率定义为 该值限定了对于由TOF2的脉冲本性所造成的TOF1的最大质量分辨能力的限制。对于上面的参数，TOF2的有效路径长度L2＝0.5m，平均加速电压V2＝5000V，比率≈150，其对应于TOF1分离的质量分辨率R～75。由于分辨率还被离子束的相对能量扩展度限制为c.a.R＝100，所以不值得利用更长的装置。尽管分辨率较差，与上述TOF1光谱仪相比，该旋束管装置具有简单、更高工作能量的优点，并且它无需TOF2之前的频闪技术即可工作。分辨率75在分离原离子的复杂混合物中仍然是有用的。为了比较，PSDMALDI中的分离具有从50到100的分辨率，并且一般的三重四极实验中的分离一般在300左右。
螺旋的平均半径r0可基于实际约束来选择，主要基于板124A-124C上镀金属条带的周期d。例如，对于r0＝80mm，螺旋的阶距(step)是15mm。如果d＝3mm，则即使对于透镜(122)之后的初始束大小3至4mm，束和板(124C)之间所产生的间隙仍然确保边缘场的充分衰减(对于M＝5，这对应于来自源(71)的在出口上的0.6至0.8mm的离子束直径)。
新颖的静态低能TOF可被连接于上述的任一分裂装置和用于碎片分析的TOF2光谱仪中的任一个。参见图14，TOF1 121被连接于CID单元81和正交TOF101。这种组合中的主要问题是将原束聚焦到CID单元的入口上。尽管离子束具有较高的100eV能量，并且束在出口变宽，但是束仍然是大概平行的，并且通过常规的透镜，能够被很好地聚焦到小的孔隙上。
多路TOF1参见图15，本发明的第一(TOF1)飞行时间分离器(151)的另一优选实施例(也称为“静电多路分离器”)包括自由分行通道(152)和两个静电镜(153)(由聚焦电极(154)和反射体电极(155)组成)。自由飞行通道(152)具有入口和出口窗口(156)。所有电极沿着Y轴这样延伸，即静电场在离子路径的区域中是二维的。脉冲离子束经由空间聚焦透镜(157)和一组转向板(158)，被引入到多转向静电TOF151。离子的离子路径如线条(159)所示。一般的轴电势分布U(x)如图160所示。
在操作中，离子脉冲被透镜158聚焦成平行束，并且被板(159)转向。该束以相对于X轴的较小角度，经由入口窗口156，被引入到分离器151之中。离子沿着X轴经历多次反射，同时沿着Y轴缓慢漂移。在多次全转向(每次全转向由一对反射形成)之后，按照它们的m/z比、在时间上被分离，离子经过出口窗口157离开分离器。全转向的次数取决于注入角度，二者均可由转向板上的电势来调整。
静电镜被设计为与筛(griddle)TOF中的镜相似，这是本领域中所公知的。作用于镜电极的静电电势被调节为满足空间聚焦和飞行时间聚焦的条件。图160示出了轴电势分布U(x)的类型，其满足这些要求。为了提供沿着Z方向的空间聚焦，每个静电镜153形成具有焦点的透镜，该透镜位于靠近自由飞行区域的中央平面(如虚线所示)。离子束(线条159)在入口窗口156开始作为平行束。在右侧镜中的第一反射之后，光束被聚焦到中间平面的某点之中。注意，所有离子的聚焦在附图上被表示为与轴交叉的单个离子轨道。在左手侧镜中的反射之后，该束被再次转换成平行束。
按照本发明人利用SIMION程序所进行的离子光学仿真，特定TOF1 151中的空间聚焦在至少第一阶次中与飞行时间聚焦相兼容，即飞行时间对于初始能量和对于正交位移的第一导数是等于零的。如果仅初始空间扩展在TOF1宽度的5％之下，并且角度扩展在2度以下，则离子束保持受限。对于3％之下的能量扩展度，TOF1的飞行时间分辨率超过10,000。在脉冲从线性存储四极中喷射出之后，这样的初始条件对于被加速到近似30电子伏特的离子束来说是现实的。
与其他实施例相比，在相对较高能量(30至100eV)下的操作在TOF1中需要更长的离子路径(30至100m)，以在TOF1中实现毫秒时标的分离。离子路径可易于延伸，因为TOF1设计及其静态操作的复杂性较低。具有近似20次全离子转向的1m长的仪器对应于至少50m的有效飞行路径。
圆柱形多路TOF1参见图16，本发明的另一优选实施例呈现了一改型的静电多路分离器，其通过将二维场折成圆柱形场来形成。在该实施例中，为了紧凑设计的目的，对于所谓的圆柱形多路分离器(161)，每个拉长的电极被转换成一对共轴圆柱体(内部和外部的)。分离器161包括由圆柱体(162，163)形成的自由飞行通道；和两个静电镜，由聚焦圆柱体(164)和反射体圆柱体(165)组成。自由飞行通道162的外部圆柱体162具有入口和出口窗口(166)，其配备有偏转器(170)。脉冲离子束经由空间聚焦透镜(167)，经由一组转向板(168)，经过入口窗口166和偏转器170，被引入到分离器161之中。离子路径如线条(169)所示。
在操作中，圆柱体分离器与上述的二维静电多路分离器很相似。离子被强制在镜之间进行多次反射，同时被透镜电极空间聚焦。为了在轨道的相同半径附近保持离子，附加电势被作用于外部和内部圆柱体162和163之间。径向偏转电势还可作用于电极164和165的外部和内部圆柱体之间。
离子的入口和出口可以多种方式来构成。图16B示出了利用后续的水平偏转经过裂缝形窗口166B引入离子的实例，其沿着X轴对准离子束。为了减少边缘场，偏转器170B被网格包围。图16C示出了在整个圆柱形分析器中经过分割切面沿着X轴引入离子的实例。离子束在被板170C水平偏转之后被注入到分析器之中。场变形通过利用双面PCB来最小化，其在切面之内是等电势的，并且在朝向圆柱形分析器的一侧上具有分布电势。建议将上述的慢速静电多例分离器与前述的脉冲离子源、分裂单元和快速第二TOF进行各种组合，用于本发明的综合串行TOF光谱仪中。
显而易见，TOF1分离器的所示实例，其包括具有RF约束的分离器、旋束管和静态多路分离器，并未穷举TOF1的所有功能，其提供延长的时间分离，同时保持离子束，这些实例仅证明本发明的综合串行TOF质谱仪的一般方法的可行性。
实现的效果本发明的上述综合串行TOF光谱仪与现有的TOF-TOF质谱仪相比，获得了分析速度和灵敏度。其改进是通过利用首次应用于串行TOF的时间嵌套采集原理来实现的。来自离子源的离子脉冲可被完全利用，并且多个母离子在单个源脉冲中被分析。与也利用了时间嵌套采集的最接近原型IMS-TOF相比，本发明还改善了MS-MS信息的速率。该改进是通过在母离子分离步骤中获得更高分辨率、由此对更复杂的混合物提供分析来实现的。
LC-LC-MS-MS串行MS-MS分析的更高速度开放了将多级液相分离与实际时标下的串行MS分析相联系的机会。这样的分离技术可包括亲合分离、液相色谱(LC)和毛细电泳(CE)。数分钟时标下的高速LC和CE分离在LC-MS分析中变成例行程序。然而，LC-MS-MS分析通常由于MS-MS级的低速而有所减缓，而不再是引入本发明的综合TOF-TOF方法和设备之后的情形。
已经描述了组合有用元件的优选实施例和一些实例，现在对于本领域技术人员变得明显的是，可使用并入了这些概念的其他实施例。因此可认为，这些实施例不应当限定于所公开的实施例，而应当仅由所附权利要求的精神和范围来限定。在权利要求书中，离子流动正交TOF被认为是最接近的原型。
权利要求
1.一种串行质谱仪，包括顺序连接的脉冲离子源、母离子分离器、分裂单元、第二飞行时间质谱仪(TOF2)和为多个母离子采集碎片质谱的时间嵌套数据采集系统，其中，为了改善母离子分离的分辨率，所述母离子分离器是飞行时间质谱仪，以及其中，对于相同质荷比的离子，所述TOF1中的飞行时间远远大于经过所述分裂单元的通过时间和所述TOF2中的飞行时间。
2.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，所述TOF1中的飞行时间比所述TOF2中的飞行时间大至少10倍。
3.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，所述TOF1中的平均离子能比所述TOF2中小至少100倍。
4.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，该脉冲离子源是具有从真空直至0.1毫巴的气压的MALDI离子源。
5.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，该脉冲离子源包括脉冲操作射频(RF)存储装置和连续离子源，该连续离子源选自于由电喷射源、填充有10毫托和1个大气压之间气压下的气体的MALDI离子源、电子碰撞离子源、具有化学电离的电子碰撞离子源或具有光学电离的离子碰撞离子源组成的列表，离子从任一所述离子源中被连续提供，以进行积累，并且从所述存储装置中脉冲喷射而出。
6.如权利要求5所述的串行质谱仪，其中，所述存储装置包括至少一个仅仅RF的线性多极，且补充有至少一个DC电极，用于建立非零轴向电场的。
7.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，所述TOF1包括仅仅RF的线性多极，该线性多极被具有轴向二次电场的两个脉冲镜包围。
8.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，所述TOF1包括二维的仅仅RF的离子隧道，所述隧道被具有二次电场的二维DC镜包围。
9.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，所述TOF1包括其间作用有DC电压的至少一对共轴电极，以及其中，离子在所述电极之间相对于它们的轴成一角度被注入。
10.如权利要求9所述的串行质谱仪，其中，经过由双面印刷电路板所形成的切面边界，离子进入和退出所述电极之间的间隙。
11.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，所述TOF1是平面多路静电TOF，其包括二维自由飞行通道和两个由聚焦和反射电极组成的平面聚焦静电镜。
12.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，所述TOF1是圆柱形多路静电TOF，其包括至少一对具有径向偏转的共轴圆柱体和两个由共轴圆柱体组成的聚焦静电镜。
13.如权利要求1所述的串行质谱仪，包括所述TOF1和所述分裂单元之间的附加定时闸，其能够仅仅在多个狭窄时间窗口之内传送离子。
14.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，注入到所述分裂单元之中的离子的能量通过所述TOF1和所述分裂单元之间的静电偏移量来调整；该偏移量可在TOF1分离期间被调整，以提供对于母离子最为适宜的、大约50V/kD的基于质量的离子能。
15.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，所述分裂单元是碰撞引致裂解(CID)单元，其填充有气体和包括至少一个仅仅RF的多极，且补充有至少一个DC电极。
16.如权利要求13所述的串行质谱仪，其中，通过利用长度小于1cm的短单元、100毫托以上的高气压，减少离子包在所述CID单元之内的时间扩展。
17.如权利要求13所述的串行质谱仪，其中，为了时间压缩，碰撞单元利用轴向DC场的调制，将碎片离子存储于该单元之内，并且喷射与TOF2脉冲同步的脉冲束。
18.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，所述分裂单元包括脉冲时间和空间聚焦透镜、以及涂布有氟烃单层的靶。
19.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，TOF2是具有正交时间注入的TOF MS(o-TOF MS)。
20.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，所述TOF2包括高电流检测器和瞬态记录器。
21.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，该TOF1中的时间分离分辨率通过任一下述方式来增强利用该TOF1中的多次反射，利用长于1m的TOF1，利用具有多个狭窄时间窗口的所述定时闸，该TOF1的任一反射体沿着离子路径形成二次电势分布。
22.如权利要求1所述的串行质谱仪，其中，附加串连检测器被安装在TOF1之后的任一处。
23.一种综合的MS-MS分析方法，包括如下步骤
24.具有各种质荷比(M/Z)的多个母离子从脉冲离子源中脉冲喷射；
25.时间分离在第一时间分离器之内的母离子；
26.分裂时间分离的离子；
27.质量分析第二飞行时间质谱仪(TOF2)之内的碎片离子；
28.无需混合不同母离子的碎片光谱，与每单个离子脉冲的多个母离子相对应，对碎片质谱进行时间嵌套采集，
29.其中，为了改进MS-MS分析的灵敏度和吞吐量，所述时间分离在飞行时间质谱仪(TOF1)之内发生，以及其中，所述母离子分离的时间明显超过所述分裂的时间和所述碎片质量分析的时间。
30.所述综合的MS-MS分析方法，其中，所述TOF1中的所述飞行时间比所述TOF2中至少大10倍。
31.如权利要求23所述的MS-MS分析方法，其中，该离子脉冲在具有从真空直至100毫托的气压的MALDI离子源中产生。
32.如权利要求23所述的MS-MS分析方法，其中，所述离子脉冲由来自存储四极的脉冲喷射形成，同时离子从连续离子源被引入到该存储四极中，该连续离子源选自于由电喷射源、填充有10毫托和1个大气压之间气压下的气体的MALDI离子源、电子撞击离子源、具有化学电离的电子碰撞离子源或具有光学电离的电子碰撞离子源。
33.如权利要求23所述的MS-MS分析方法，其中，母离子的所述时间分离在二次DC场中发生，以及其中，所述TOF1中的离子能比所述TOF2中至少小100倍。
34.如权利要求26所述的MS-MS分析方法，其中，母离子在二次DC场中的所述时间分离是借助于在与DC场正交的至少一维范围中约束射频场来实现的。
35.如权利要求27所述的MS-MS分析方法，其中，仅仅RF的场中的所述离子约束是沿着一个轴来实现的，离子从该RF场区域的一端被注入，并且在脉冲二次DC场中的多次反射之后在另一端被释放。
36.如权利要求27所述的MS-MS分析方法，其中，仅仅RF的场的母离子约束是沿着二维平面来实现的；相对于与DC场的梯度平行的TOF1轴，以小角度注入离子；离子在DC场中经历多次反射，同时在正交方向上向RF场的出口缓慢漂移。
37.如权利要求23所述的MS-MS分析方法，其中，母离子的所述时间分离在静电场中发生，以及其中，该第一飞行时间分离器中的所述离子能比在所述第二飞行时间质谱仪中至少小10倍，以及其中，所述第一飞行时间分离器中的所述有效飞行路径比在所述第二飞行时间质谱仪中大至少30倍。
38.如权利要求23所述的MS-MS分析方法，其中，母离子的所述时间分离在一对共轴电极所建立的静电场中发生，以及其中，相对于电极轴，以一角度将离子注入到所述静电场之中，以及其中，所述静电场在边界处的扰动被双面印刷电路板减少。
39.如权利要求23所述的MS-MS分析方法，其中，母离子的所述时间分离在平面自由飞行通道和平面聚焦筛离子镜所形成的平面静电场中发生；离子相对于TOF1轴以小角度来注入，并且在镜之间经历多次反射。
40.如权利要求23所述的MS-MS分析方法，其中，母离子的所述时间分离在多对共轴圆柱体所形成的圆柱形静电场中发生；在至少一对中施加径向场；圆柱体之间的圆柱形场与权利要求32的场相似；离子相对于TOF1轴以小角度来注入，并且在镜之间经历多次反射。
41.如权利要求23所述的MS-MS分析方法，其中，在将离子提交到所述分裂步骤之前，通过采样多个狭窄时间窗口，增强TOF1中的时间分离分辨率。
42.如权利要求23所述的MS-MS分析方法，其中，所述分裂以如下处理中的一种处理实现在与气体的能量碰撞中、在与表面的碰撞中、在光的作用下。
43.如权利要求23所述的MS-MS分析方法，其中，所述分析在两个步骤中进行步骤1，在利用通路模式下的TOF1的同时，在TOF2中采集母体质谱；步骤2，对应于有用母离子的到达，在碰撞单元前面，对狭窄时间窗口采样，并且仅仅为这些时间窗口采集碎片光谱；基于来自步骤1测量的母体质量，在飞行中选择所述时间窗口。
44.如权利要求23所述的MS-MS分析方法，其中，从全部的MS/MS数据集中重构“母体扫描”，即具有预定碎片离子集的母离子的光谱。
45.一种LC-MS-MS分析或LC-LC-MS-MS分析方法，其中，溶剂的流动从LC中被连续引入到权利要求1的串行质谱仪之中，并且利用权利要求21至37中所述的方法，采集MS-MS数据。
全文摘要
为了提供综合(即快速和灵敏)的MS－MS分析，发明人采用使用两个飞行时间(TOF)质谱仪的时间嵌套分离。母离子在工作于低离子能(1至100eV)下的慢速和较长TOF1中被分离，碎片离子在工作于高得多的keV能量下的快速和较短TOF2中被质量分析。TOF1和TOF2之间的低能分裂单元被设计为主要通过缩短单元和利用较高的气压，来加速分裂和阻尼步骤。由于TOF1中的分离需要毫秒时间，TOF2中的质量分析需要微秒时间，所以本发明提供了在每单个离子脉冲进行多个前体离子的综合MS－MS分析。利用引入新颖的TOF1分析器，TOF1中的慢速分离变得可能。TOF－TOF可利用静态TOF1来实施，这里与旋束管、具有筛空间聚焦离子镜的平面和圆柱形多路分离器相关地描述了静态TOF1。利用新颖的混合TOF1分析器，其组合了射频(RF)和二次DC场，可期望更佳性能。RF场在TOF1分析器之内保持低能离子，同时二次DC场通过补偿相对大的能量扩展度来改善分辨率。
文档编号H01J49/10GK1689134SQ03821954
公开日2005年10月26日 申请日期2003年4月29日 优先权日2002年7月16日
发明者阿纳托利·N.·韦伦奇克沃 申请人:力可公司