专利名称：蜘蛛拖牵丝蛋白基因在转基因家蚕中时空表达系统的构建方法
技术领域：
本发明专利涉及蜘蛛拖牵丝和家蚕丝蛋白L链的氨基酸序列及其空间结构，更具体涉及一种蜘蛛拖牵丝蛋白基因在转基因家蚕中高效时空表达系统的构建方法。
目前，国外在大肠杆菌和酵母菌中成功地表达了蜘蛛丝蛋白基因，但不能形成具有天然纤维特殊机械性能的产物。对由蛋白到天然丝纤维的分泌加工过程人们了解得不多，这是人造蛛丝纤维的最大障碍。因此，上述技术路线，短期内难以达到产业化的程度。家蚕作为生物反应器合成具有经济价值的多肽、蛋白等，已引起众多研究者和投资者的极大兴趣。但目前，在以家蚕作为外源基因受体的研究中，还存在一些不足之处(1)大多数的研究均有外源基因整合不稳定、传种接代不稳定的缺点；(2)家蚕丝心蛋白的合成加工、运输、分泌机理还不太明了，因而应用上受到限制，技术操作上工作量大，外源基因的家蚕转化多为非稳定整合的瞬间表达。
本发明专利的目的是提供了一种蜘蛛拖牵丝蛋白基因在家蚕中时空表达系统的构建的方法，将来自Trichoplusia ni的转座子pigg-yBac改造成为转基因载体，能够稳定地将目的基因转移并整合在家蚕基因组中，操作方便，转化率高。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施构建的家蚕转基因载体系统，包括两个质粒，其中之一含有一个目的基因表达单元和一个GFP基因标记单元，以便于转基因家蚕的筛选和外源基因的表达。该DNA区域两侧各有一段转座子的末端重复序列，以便于转座酶的识别，实现在家蚕基因组中的高频率整合。另一个载体为带有转座酶编码区的辅助质粒。该载体系统的特征在于基因转移系统的构建，蜘蛛拖牵丝基因与蚕丝蛋白L链cDNA融合，并置于L链基因启动子之后；家蚕转座因子被改造成为整合型载体，形成家蚕基因转移系统，人工合成多克隆位点区和两末端重复序列。蜘蛛融合基因在家蚕中得到时空表达。将蜘蛛丝蛋白基因4.4Kb的DNA片段插入0.7Kb的蚕丝蛋白L链cDNA片段末端，再将形成的融合片段置于L链基因5’端的1.5Kb的启动子区域后；家蚕转基因系统来自Trich-oplusia ni的转座子pigg-yBac改造成为家蚕转基因载体，转座子的两末端重复序列之间的序列被GFP基因取代，并加上多克隆位点，转座酶基因的DNA片段克隆至另一载体中。人工合成转座子pigg-yBac的两端重复序列，包括在PCR引物中，其中上游引物的重复末端后还接上一个带有一段长为20bp的多克隆位点区的人工接头。
图1基因转移载体的物理图谱示意2融合基因的构建示意3转基因家蚕的筛选示意4转基因家蚕的Southern杂交分析示意图下面结合附图对本发明作进一步的详细描述依据图1可知，载体的构建路径如下首先根据已知的GFP基因序列设计一对用于扩增GFP基因的PCR引物，将转座因子两端重复序列设计在PCR上、下游引物的末端，引物的核苷酸序列为上游引物5’-GTGAATTCCCCTAGAAAGATACC GCGGCTGCAGATGAGCAAGGGCG-3’下游引物5’-TCGAATTCCCCTAGAAAGATACT GCAGCCTTGTACAGCTCG-3’扩增出片段后，再在片段上游加上一个带有一段长20bp的多克隆位点区(MCS)的人工接头；其次，将该扩增DNA片段克隆在载体pBS中，并在GFP基因编码区前面加入家蚕组成型表达的基因启动子，其后面接相应的终止子序列，构建成功家蚕基因的运载质粒；第三，将转座子中的转座酶编码区序列采用PCR技术克隆至质粒pUC18中，编码区前边加上基因启动子，后面接相应的终止子序列，即为基因转移的辅助质粒。二者共同构成了家蚕基因转移系统。该系统可以确保外源目的基因在家蚕基因组中的多拷贝、高频率整合，进一步提高外源基因的表达水平。因此，研制的整合载体，通过转座的方式，可实现外源基因在家蚕基因组中高频率的整合，转化频率可达0.5％；按照图2所知，显示的是融合基因的构建过程，首先提取家蚕后部丝腺中的mRNA，根据已知的家蚕丝心L链蛋白基因的序列，设计上、下游引物，RT-PCR扩增，从而获得家蚕丝心蛋白L链cDNA，大约为0.7Kb，从家蚕总DNA中，根据已知的L链5’端设计上、下游引物，扩增出L链5’端及其上游的启动子区域的DNA片段，其中包括信号肽序列，将上述片段按正确的读码框连接成融合的L链基因，将已有的蜘蛛拖牵丝基因SP14.4kb片段插入到L链的3’末端区域第7个外显子之中，构建成L-SP1融合片段，根据已知的L链基因终止子序列合成PCR上下游引物，PCR扩增出L链基因基因终止子片段，大小为0.5Kb，将该终止子片段插入到L-SP1融合基因编码区后，形成完整的L-SP1融合基因。
根据图3可知，显示家蚕的基因转化和筛选。把上述构建的基因转移系统，用显微注射仪注入家蚕蚕卵中，25℃培养，孵化，形成蚁蚕，用桑叶喂养，形成5龄幼蚕的第二天，即可用于转基因家蚕的鉴定，初步鉴定出的转基因家蚕，用于继代培养，为孟德尔式遗传。研究中，注射了2000只蚕卵中，形成795条幼蚕，420条能形成产卵的蛾子，G0代中0.7％显示荧光蛋白阳性。用350nm-390nm荧光检验仪，初步鉴定转基因蚕。对转基因家蚕进行继代培养，将获得的荧光蛋白阳性家蚕进行回交和姊妹交配，将产下的蚕卵分为两份，一份采用荧光蛋白基因的上下引物进行PCR扩增，若显示阴性，弃去另一份蚕卵，若为阳性，则保留另一份，并于5龄以后第二天，再用荧光检测，取其中部分阳性个体，提取总DNA，PCR快速分子鉴定，对阳性个体的总DNA进行Southern杂交分析(图4为以蜘蛛拖牵丝基因特异性片段为探针进行的Southern杂交的结果)。对阳性个体进一步进行姊妹交，以纯化转基因家蚕至到G3代，获得的G3后代阳性个体即为外源基因整合的转基因家蚕。抽取后部丝腺的蛋白质，抽检蚕茧中的蛋白质，进行SDS-PAGE分析等系列鉴定，结果表明蜘蛛丝蛋白含量高。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果方法易行，操作简便，转化率高，经检测转基因家蚕的蚕丝中蛛丝含量为30％，为获得蜘蛛丝纤维开辟了新的途径，具有显著的社会和经济效益。
权利要求
1.一种蜘蛛拖牵丝蛋白基因在家蚕中时空表达系统的构建方法，其特征在于基因转移系统的构建，蜘蛛拖牵丝基因与蚕丝蛋白L链cDNA融合，并置于L链基因启动子之后；转座因子被改造成为整合型载体，形成家蚕基因转移系统；人工合成多克隆位点区和两末端重复序列。
2.按权利要求1所述的一种蜘蛛拖牵丝蛋白基因在家蚕中时空表达系统的构建方法，其特征在于将蜘蛛拖牵丝蛋白基因4.4Kb的DNA片段插入蚕丝蛋白L链cDNA 0.7Kb的DNA片段末端外显子之中，再将形成的融合片段置于L链基因5’端1.5Kb的启动子区域后。
3.按权利要求1所述的一种蜘蛛拖牵丝蛋白基因在家蚕中时空表达系统的构建方法，其特征在于家蚕转基因系统来自Trichoplusia ni的转座子pigg-yBac改造成为转基因载体，转座因子的两个反向重复末端之间的序列被GFP基因取代，并加上多克隆位点，转座酶基因的DNA片段克隆至另一载体中。
4.按权利要求1或3所述的一种蜘蛛拖牵丝蛋白基因在家蚕中时空表达系统的构建方法，其特征在于人工合成转座子pigg-yBac的两端重复序列，包括在PCR引物中，其中上游引物的重复末端后还接上一个带有一段长为20bp的多克隆位点区的人工接头。
全文摘要
本发明公开了一种蜘蛛拖牵丝蛋白基因在家蚕中时空表达系统的构建方法。应用DNA重组技术将蜘蛛拖牵丝蛋白基因与家蚕丝蛋白L链cDNA融合,并置于L链基因启动子之后构建成完整的融合基因。将来自Trichoplusia ni的转座子piggy－Bac改造成为转基因的载体,包括两个质粒,一个用于目的基因的转运,一个用作辅助质粒。将构建的融合基因插入基因转移载体,注射到蚕卵中,获得多个转基因家蚕,蜘蛛拖牵丝基因和GFP标记基因稳定整合于家蚕基因组中,拖牵丝基因获得表达。本发明方法易行,操作简便,转化率高,家蚕的蚕丝中蛛丝含量为30%。
文档编号C07K14/435GK1362520SQ0110640
公开日2002年8月7日 申请日期2001年1月2日 优先权日2001年1月2日
发明者刘天艳, 刘辉芬, 李维, 赵力宾 申请人:成都天友发展有限公司