专利名称：三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种生物成分的提取方法，特别是涉及一种天然抗癌药物——三尖杉酯碱与高三杉酯碱的提取方法。
背景技术：
随着科学技术的不断发展，人们对许多原来是不治之症的疾病都找到了治疗的方法。一种极其稀有的树种——三尖杉(CephalotaxusLanceolata K.M.Feng)，经临床医学测定，其树皮及其他部位内含有的生物碱——三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱，是天然的抗白血病的良药，这种生物制剂的问世，给许多濒于死亡的白血病患者带来了生命的希望。
传统的提取工艺是以三尖杉树皮为原料，采用酒精渗漉，回收酒精，经多次反复酸碱处理，氯仿萃取，再经中性氧化铝吸附柱层析，硅胶分配柱层析，得到三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱。
上述方法的不足之处在于生产工艺复杂，周期长，可操作性差，生产量极小，环境污染较严重，回收率低，无法实现工业化连续操作，且极大破坏珍稀树种资源，不利于保护生态环境。
中国专利局公布了申请号为99806044.5的“新的三尖杉烷衍生物及其制备方法”的发明(申请日期为1999.03.17)，该发明公布了一种采用侧链前体构成的酰化物直接酯化天然的三尖杉碱的方式，提供了一种通过化学合成来生成三尖杉酯碱的方法。
该方法投资成本较大，且仍需采用天然三尖杉碱作为原料，同样具有前述传统工艺的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种能简化生产工艺，合理使用珍稀树种资源，减少废物排放，并能有效提高制剂产量的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了含量较树皮低但可再生的三尖杉小枝叶为原料，经过打粉并用10％稀氨水碱化→超临界CO2流体萃取→分离回收三尖杉总生物碱→吸附树脂连续柱层析→回收三尖杉混合酯碱→制备高速逆流色谱并经紫外检测得到三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱单体和少量的二者混合物→分别重结晶纯化得到供制剂用的纯品。
所述原料打粉粉粒度为0.5-3mm，物料堆积密度为228kg/m3。
所述超临界CO2流体以乙醇为夹带剂，流量为180-190kg/h；所述超临界萃取的工艺条件是萃取时间为3h，萃取温度为40℃，萃取压力为20Mpa；所述吸附树脂连续柱层析由四个过程组成一次大孔吸附树脂柱层析→一次离子交换柱层析→二次大孔吸附树脂柱层析→二次离子交换柱层析。
所述大孔吸附树脂为AB8大孔吸附树脂，一次大孔吸附树脂柱层析采用解吸剂为6％柠檬酸-甲醇体系，样品吸附量按干膏和树脂1∶15-20比例计算，流速为0.5-5ml/cm2/min；二次大孔吸附树脂柱层析采用解吸剂为pH5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液与甲醇体系，样品吸附量按干膏和树脂1∶10-15比例计算，流速为0.5-5ml/cm2/min。所述离子交换树脂为100*7#阳离子交换树脂，一次离子交换树脂柱层析所采用的解吸剂为不同pH浓度的氢氧化钠与甲醇体系，样品交换容量按干膏和树脂1∶20比例，流速为0.5-3ml/cm2/min；二次离子交换树脂柱层析采用的解吸剂为pH9.0以上的氢氧化钠与甲醇体系，样品交换容量按干膏和树脂1∶20比例，流速为0.5-3ml/cm2/min。
所述高速逆流色谱按如下方法制备柱体积为1000ml，溶剂系统为氯仿，0.07mol/L磷酸钠-0.04mol/L柠檬酸组成的pH值为5.0的缓冲液，保留值80％，转速800转/min，流速200ml/h，检测波长为284nm，每2分钟自动收集每管检测。
由于采用上述工艺，使本发明具有了如下优点(1)使用了含量较树皮低但可易再生且资源远比树皮丰富的三尖杉小枝叶代替树皮作为原料，解决了三尖杉树皮的稀缺问题，保护了物种资源；(2)使用了来源广泛且能回收的CO2代替有毒溶剂，可在近常温条件下进行操作，利于生物活性物质的提取，且减少了工艺步骤，降低污染和能耗；(3)使用吸附树脂连续柱层析的技术，既可以降低能耗，实现工业化连续生产，又能减少有机溶剂的排放，保护人类的生态环境，且吸附树脂可以再生反复利用，极大地降低了生产成本；(4)采用逆流色谱不用固态支撑体，完全排除了支撑体对样品组分的吸附、玷染、变性、失活等不良影响，能避免不可逆吸附所造成的溶质色谱峰拖尾现象，可实现很高的回收率；本发明的提出简化了生产工艺，减少了对环境的污染，提高了生产效率，满足了日益增长的天然抗癌药物的市场需求，保护了珍贵的自然资源和生态环境，使得人与自然能够协调发展。
附图所示是本发明工艺流程图。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明的最佳实施方式作进一步的详细描述。
原料先用破碎机打成粗粉，粉粒度为0.5-3mm。粉状物料用10％稀氨水碱化后，装入1000升料筐内，堆积密度为228kg/m3。
把装有物料的料筐吊入萃取釜内，关闭并锁紧卡箍，将以85％乙醇为夹带剂的液体CO2，经预热器加热后，打入萃取釜，对物料进行正向超临界萃取，CO2流量为180-190kg/h，萃取时间为3h，萃取温度为40℃，萃取压力为20Mpa；携带有效成份的超临界流体，经截流阀减压、降温后，进入分离器中分离，其中有效成份经高效液相色谱仪测定收集，即得总生物碱，CO2气体经冷凝器液化后，流入回收罐，再经高压泵加压循环使用。
选择AB8大孔吸附树脂和100*7#阳离子交换树脂为柱层析的载体，树脂需预先处理，以乙醇连续洗涤数次，至洗涤液加适量水无白色浑浊(1ml乙醇液加5ml水)时，然后以大量的蒸馏水洗去乙醇，备用。上样液经预先沉淀，PH值调节至7.5-8.0，过滤，乙醇湿法装柱，开启蠕动泵，以干膏和树脂的比例为1∶15-20上样，以6％柠檬酸-甲醇缓冲液体系作为洗脱液解吸，流速为0.5-5ml/cm2/min，用高效液相色谱仪测定。
继续进行离子交换树脂柱层析，将备好的阳离子交换树脂装柱，以干膏和树脂的比例为1∶10-15上样，以氢氧化钠-甲醇体系按不同pH值制成的梯度洗脱液连续不断地流过柱体洗脱，流速为0.5-3ml/cm2/min，分段收集，用高效液相色谱仪测定。
选择pH7-8流份，旋转蒸发器浓缩体积的六分之一，第二次上大孔吸附树脂柱，以pH值为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液与甲醇体系作为洗脱液连续不断地流过柱体，样品吸附量按干膏和树脂1∶10-15比例计算，流速仍为0.5-5ml/cm2/min，用高效液相色谱仪测定。
第二次上离子交换树脂柱层析，以干膏和树脂的比例为1∶20上样，以pH值为9.0以上的氢氧化钠与甲醇体系的洗脱液连续不断地流过柱体，流速仍为0.5-3ml/cm2/min，收集流份，用高效液相色谱仪测定，蒸干，即得混合酯碱。
制备高速逆流色谱，选择溶剂系统为氯仿、0.07mol/L磷酸钠-0.04mol/L柠檬酸组成的pH值为5.0缓冲液，将选好的两相互不相溶的溶剂在分液漏斗中充分振摇后静置分层。取上相作为固定相，下相作为流动相，先将固定相注满管柱，柱体积为1000ml，再将流动相以200ml/h的流速泵入，待流动相从管柱出口流出，基线稳定后，将样品由进样器注入，进样量为15ml，此时按800r/min的转动速度启动主机，管柱流出物经UV(紫外线)检测，检测波长为284mm，收集峰I、II、III，每2分钟自动收集每管检测；洗脱液收集300ml后，以下相溶剂反向洗脱，按如上述方式又收集峰a、b、c，即得三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱和少量二者混合物。
二种单体经不同的溶剂重结晶纯化，可得到供制剂用的纯品。
通过以上工艺方式得到的二种单体，其纯度可达98％以上，比原工艺纯度提高约3％左右，回收率达80％，比原工艺提高了20％左右。
权利要求
1.一种提取三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱的方法，其特征在于采用含量较低的可再生的三尖杉小枝叶为原料，以如下加工工艺过程制备而成打粉并用10％稀氨水碱化→超临界CO2流体萃取→分离回收三尖杉总生物碱→吸附树脂连续柱层析→回收三尖杉混合酯碱→制备高速逆流色谱并经紫外检测得到三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱单体和少量的二者混合物→分别重结晶纯化得到供制剂用的纯品。
2.根据权利要求1所述的三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱的提取方法，其特征是，原料打粉粉粒度为0.5-3mm，物料堆积密度为228kg/m3。
3.根据权利要求1所述的三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱的提取方法，其特征是，超临界CO2流体加以乙醇为夹带剂，流量为180-190kg/h；
4.根据权利要求1所述的三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱的提取方法，其特征是，超临界萃取的工艺条件是萃取时间为3h，萃取温度为40℃，萃取压力为20Mpa；
5.根据权利要求1所述的三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱的提取方法，其特征是，吸附树脂连续柱层析由四个过程组成一次大孔吸附树脂柱层析→一次离子树脂交换柱层析→二次大孔吸附树脂柱层析→二次离子交换树脂柱层析。
6.根据权利要求1或5所述的三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱的提取方法，其特征是，所采用的大孔吸附树脂为AB8大孔吸附树脂，一次大孔吸附树脂柱层析采用解吸剂为6％柠檬酸-甲醇体系，样品吸附量按干膏和树脂1∶15-20比例计算，流速为0.5-5ml/cm2/min；二次大孔吸附树脂柱层析采用解吸剂为pH5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液与甲醇体系，样品吸附量按干膏和树脂1∶10-15比例计算，流速为0.5-5ml/cm2/min。
7.根据权利要求1或5所述的三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱的提取方法，其特征是，所采用的离子交换树脂为100*7#阳离子交换树脂，一次离子交换树脂柱层析所采用的解吸剂为不同pH浓度的氢氧化钠与甲醇体系，样品交换容量按干膏和树脂1∶20比例，流速为0.5-3ml/cm2/min；二次离子交换树脂柱层析采用的解吸剂为pH9.0以上的氢氧化钠与甲醇体系，样品交换容量按干膏和树脂1∶20比例，流速为0.5-3ml/cm2/min。
8.根据权利要求1所述的三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱的提取方法，其特征是，高速逆流色谱按如下方法制备柱体积为1000ml，溶剂系统为氯仿，0.07mol/L磷酸钠-0.04ml/L柠檬酸组成的pH值为5.0的缓冲液，保留值80％，转速800转/min，流速200ml/h，检测波长为284nm，每2分钟自动收集每管检测。
全文摘要
本发明提供了一种能简化生产工艺，合理使用珍稀树种资源，减少废物排放，并能有效提高制剂产量的方法。本发明采用了含量较低的可再生的三尖杉小枝叶为原料，经过打粉并用10％稀氨水碱化→超临界CO
文档编号C07D491/00GK1493572SQ0215032
公开日2004年5月5日 申请日期2002年11月1日 优先权日2002年11月1日
发明者李国平, 吴雪平 申请人:福建广生堂药业有限公司