专利名称：一个与精神分裂症密切相关联的易感基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个与精神分裂症有显著关联的易感基因。
背景技术：
精神分裂症是最严重的精神疾病之一。在我国，精神分裂症的终身患病率高达0.7％。这样大的患病群体，不仅给家庭和社会带来沉重的经济负担，而且还严重威胁社会的安全与稳定。因此，确定精神分裂症的病因，建立有效地防治方法，已成为医学界乃至整个社会需迫切解决的问题。精神分裂症与遗传因素有密切关系，且归类于多基因遗传病。人类基因组系统扫描发现，除19号、21号和Y染色体外，其余染色体上都可能含有精神分裂症易感基因。利用连锁和关联方法定位精神分裂症的易感基因已成为分子遗传学研究的热点。Pulver等最早报道22q区域可能存在精神分裂症易感基因(Pulver AE，et al.Am JMed Genet，1994，5436-43)。腭-心-面综合征(velo-cardio-facial syndrome，VCFS)也使研究者们注意到第22号染色体与精神疾病的联系(Pulver AE，et al.J Nerv MentDis，1994，182476-478)。但至今在该染色体区域内未发现确定特异的与精神分裂症有关的易感基因。
发明内容
本发明的目的之一是在第22号染色体区域内揭示与精神分裂症密切相关联的易感基因；目的之二是通过该易感基因遗传特性提出一种判定精神分裂症的易感人群的方法，以利于指导精神分裂症的预防和治疗。
本研究结果表明，序列长度为2311bp的CLDN5基因是与精神分裂症密切相关联的易感基因，由于该基因的单核苷酸多态性rs10314碱基C突变为G，从而与精神分裂症的易感性相关联。
CLDN5基因位于22q11.2染色体区域，为腭-心-面综合征缺失的膜转运蛋白基因，编码claudin 5蛋白，属于多基因家族，包含20多个成员，它们主要是紧密连接结构的组成成分。紧密连接存在于内皮细胞和上皮细胞中，这两类细胞的基本功能是将器官分割成不同的部分，而调节它们之间的物质交换，紧密连接构成一道屏障，阻止水、离子和液体进入细胞内，同时也阻止血浆膜顶端和侧部结构之间蛋白质和脂肪的运输，这种紧密连接对生理和病理条件下的变化起着重要的防御作用，脑中缺乏上皮细胞，存在于脑中的紧密连接大多由内皮细胞构成。值得注意的是CLDN5只在内皮细胞构成的紧密连接中表达。Northern blot检测也发现CLDN5在幼儿及成人脑中的所有血管内皮细胞中大量表达，这些发现提示CLDN5在形成血脑屏障中起主要作用。此外，CLDN5也参与Schwann细胞发育成神经细胞时的甲基化过程。由此可见CLDN5是紧密连接的重要组成部分，对于组织外来有害物质进入大脑起着重要作用，如果CLDN5发生缺陷，大脑就容易受到外界有害因子的作用。
本发明在22q11区通过连锁不平衡分析方法进行单个核苷酸多态性(SNP)连锁不平衡制图分析，通过NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapviewer)数据库，获得22q11内所有侯选基因，并获得CLDN5基因序列。通过http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP及http//snp.cshl.org/数据库，在CLDN5基因上选择含有限制性酶切位点的单核苷酸多态性rs10314。下列所示为这个单核苷酸多态性的核苷酸序列。加黑部分分别为引物序列，方框内是发生互换的碱基，划线处则是PvuII限制性内切酶识别的酶切位点，箭头所示内切酶的切割部位。具体信息如下。
SNPrs10314 Gene bank accession numberAC000088，Base changeC/G27181 ccctgggagg aggtctccac aggagtcctt gggagggcgg ggctggtggg tgatgaatgg27241 ggctgctgga cacggaagat ggctggacag agaacaggac acaggtggga gagagttcaa27301 accatttact aagcagattc ttagccttcc cactcccgcc ctctctcaag ctccggtgcc27361 cacaagcctt gcctggggag atgctggagt gagaccggga ggtccaggcc aagtcactgg 27481 gccctgggct etgcatccgc ccctccgaag tcagcaggag cctctgggaa gtaaggcagc以中国东北地区283个汉族精神分裂症患者和他们健康父母双亲组成的核心家系(Trios)为研究对象。患者均于2000-2004年间入院，按国际疾病分类标准第10版(ICD-10)被诊断为精神分裂症。这种基于家系的研究，系以父母双亲传递给患病子女的等位基因为“病例”，以未传递的等位基因为“对照”。因病例与对照等位基因均来自同样的基因池，可避免人群层化问题。
家系成员均由外周静脉抽取抗凝血5ml，用星普液体微量DNA提取试剂盒(宁波)提取基因组DNA。步骤如下①取血样100μ1，加入到1.5ml离心管中，然后加入100ul的1×TE缓冲液，摇匀；②一边振荡，一边加入200μl的B1试剂，充分混匀；③在振荡中加入200μl的B2试剂，充分混匀；④将混合溶液移入旋转离心柱中离心(14000rpm，分钟)⑤向旋转离心柱中加入400μl的B3试剂后离心(14000rpm，1分钟)；⑥重复上述步骤；⑦空柱离心(14000rpm，2分钟)，将旋转离心柱移入干挣的1.5ml离心管中，加入100μl的B4试剂离心(14000rpm，1分钟)此时离心管中的溶液体积为100μl，含有已经提取的基因组DNA。使用美国BECKMAN公司生产的型号为Du640紫外分光光度仪，分别取波长260nm、280nm两个波段，测得其相应DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通过公式，计算出DNA含量，公式为DNA含量＝50mg/ml×OD260nm×稀释倍数，另外通过公式计算出DNA纯度，公式为DNA纯度＝OD260nm/OD280nm。
依据相应的碱基序列合成引物。rs10314为AGGAGGTCTCCACAGGAGTC和CTGCCTTACTTCCCAGAGGC。PCR反应体系为20μl，其中含10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mMMgCl2，0.001％(w/v)gelatin，200μM of each dNTP，上下游引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U，DNA模板30-50ng。PCR扩增条件为①94℃ 5min②96℃45s，60℃1min，72℃1min 3个循环；③95℃45s，58℃1min，72℃1min 5个循环；④94℃ 45s，56℃1min，72℃1min 32个循环；⑤72℃10min。取PCR产物5μl用1.5％琼脂糖凝胶电泳，以DNA marker DL2000为分子量标准品。所扩增的片段长度为352bp(27188～27539)。
在PCR扩增后的反应体系中，加入适量相对应的限制性内切酶及其酶切缓冲液，置37℃温箱4小时。经2.5％琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判断基因型。存在3种基因型，其中有完全切开的纯合基因型，未切开的纯合基因型，既有切开又有未切开的杂合基因型。
建立Pedigree和SPSS SNP基因分型数据库(参见表2和表3)，应用拟合优度卡方检验和传递不平衡检验，应用UNPHASED分析软件进行单倍体传递卡方检验，利用SPSS软件管理数据。
传递不平衡检验(Transmitted disequilibrium test，TDT)显示SNP rs10314与精神分裂症显著关联(x2＝6.723，P＝0.01)。在283个家系566个父母中，270个为杂合子，而这些杂合父母分别将113个C等位基因和157个G等位基因传递给患病子女(参见见表1)。由于G等位基因传递过多，说明含G等位基因的单倍体或染色体可能携带决定精神分裂症易感性的突变位点。
根据本发明由CLDN5基因碱基突变特性判定精神分裂症的易感人群的方法，可对未表现精神分裂症临床症状的人群进行如下所示方法的筛查，rs10314碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群。rs10314碱基为C的个体不易发生精神分裂症。对精神分裂症易感人群在日常生活中应尽量减少诱发因素，如环境因素的刺激，可降低精神分裂症的发病率。这是本发明的一个重要用途。
根据本发明，对精神分裂症的患者可采用如基因敲除等基因工程方法有针对性进行基因治疗。另外，疾病基因的存在有可能导致蛋白质产物结构与功能的缺损或改变，阻碍或干扰特定生化通路中生物大分子的相互作用。正因为CLDN5基因的碱基突变，可能造成蛋白质表达及功能异常。本发明为进一步检测蛋白功能，开发新型治疗药物，开展基于遗传学背景的个体化药物治疗奠定了十分重要的基础，并将带来十分可观的社会与经济效益。
表1.CLDN5基因与精神分裂症的关系等位基因 传递等位基因限制性SNP主等位 次等位主等位次等位 P内切酶基因 基因 基因 基因Rs10314 PvuII GC 157 113 0.007注传递等位基因指杂合父母传递给患病子女的等位基因数目。
表2.Pedigree数据库格式Number 病人父亲 母亲性别 状态Pvu IIABC18 1 2 3 1 2 1/2ABC18 2 0 0 1 1 1/2ABC18 3 0 0 2 1 1/2ABC19 1 2 3 2 2 1/2ABC19 2 0 0 1 1 1/1ABC19 3 0 0 2 1 2/2ABC20 1 2 3 1 2 1/1ABC20 2 0 0 1 1 1/2ABC20 3 0 0 2 1 1/2表3.SPSS数据库格式具体实施方式
通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性rs10314的基因型分析，其rs10314碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群。具体作法是1.基因组DNA提取受试者均由外周静脉抽取抗凝血5ml，用星普液体微量DNA提取试剂盒(宁波)提取基因组DNA。步骤如下①取血样100μl，加入到1.5ml离心管中，然后加入100ul的1×TE缓冲液，摇匀；②一边振荡，一边加入200μl的B1试剂，充分混匀；③在振荡中加入200μl的B2试剂，充分混匀；④将混合溶液移入旋转离心柱中离心(14000rpm，分钟)；⑤向旋转离心柱中加入400μl的B3试剂后离心(14000rpm，1分钟)；⑥重复上述步骤；⑦空柱离心(14000rpm，2分钟)，将旋转离心柱移入干净的1.5ml离心管中，加入100μl的B4试剂离心(14000rpm，1分钟)；此时离心管中的溶液体积为100μl，含有已经提取的基因组DNA。使用美国BECKMAN公司生产的型号为Du640紫外分光光度仪，分别取波长260nm、280nm两个波段，测得其相应DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通过公式，计算出DNA含量，公式为DNA含量＝50mg/ml×OD260nm×稀释倍数，另外通过公式计算出DNA纯度，公式为DNA纯度＝OD260nm/OD280nm。
2.PCR扩增目的片段应用以下引物序列AGGAGGTCTCCACAGGAGTC和CTGCCTTACTTCCCAGAGGC进行PCR扩增。PCR反应体系为20μl，其中含10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mMMgCl2，0.001％(w/v)gelatin，200μM of dNTP，上下游引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U，DNA模板30-50ng。PCR扩增条件为①94℃5min②96℃45s，60℃1min，72℃1min 3个循环；③95℃45s，58℃1min，72℃1min 5个循环；④94℃45s，56℃1min，72℃1min 32个循环；⑤72℃10min。取PCR产物5μl用1.5％琼脂糖凝胶电泳，以DNAmarker DL2000为分子量标准品。所扩增的片段长度为352bp(27188～27539)3.限制性内切酶酶切鉴定基因型酶切的反应体系为20μl，其中PCR产物10μl、限制性内切酶Pvu II 0.7μl、酶切缓冲液2μl、BSA 0.2μl。置37℃温箱4小时。经2.5％琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判断基因型。存在3种基因型，其中有完全切开的纯合基因型(G/G)，未切开的纯合基因型(C/C)，既有切开又有未切开的杂合基因型(C/G)。
4.结果判定rs10314碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群。rs10314碱基为C的个体不易发生精神分裂症。
权利要求
1.一个与精神分裂症密切相关联的易感基因，是序列长度为2311bp的CLDN5基因，由于该基因的单核苷酸多态性rs10314碱基C突变为G，从而与精神分裂症的易感性相关联。
2.一种根据权利要求1所述的CLDN5基因碱基突变特性判定精神分裂症易感人群的方法，其特征是通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性rs10314的基因型分析，其rs10314碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群，具体作法是(1)基因组DNA提取，用微量DNA提取试剂盒提取基因组DNA，(2)PCR扩增目的片段，引物序列为AGGAGGTCTCCACAGGAGTC和CTGCCTTACTTCCCAGAGGC，(3)限制性内切酶酶切鉴定基因型，酶切的反应体系为20μl，其中PCR产物10μl、限制性内切酶PvuII0.7μl、酶切缓冲液2μl、BSA 0.2μl，置37℃温箱4小时，经2.5％琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判断基因型，(4)结果判定，rs10314碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群，rs10314碱基为C的个体不易发生精神分裂症。
全文摘要
本发明提供一个与精神分裂症的发生密切相关的易感基因，即序列长度为2311bp的CLDN5基因，由于该基因的单核苷酸多态性rs10314碱基C突变为G，从而与精神分裂症的易感性相关联。rs10314碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群，rs10314碱基为C的个体不易发生精神分裂症，CLDN5基因及其编码蛋白对阐明精神分裂症遗传学机制及建立基因诊断方法，指导精神分裂症预防、开发新型治疗药物具有重要作用。
文档编号C07H21/00GK1629289SQ20041001113
公开日2005年6月22日 申请日期2004年10月11日 优先权日2004年10月11日
发明者尉军, 刘树铮, 叶琳, 孙祖玥, 沈岩, 鞠桂芝, 谢林, 于雅琴, 史杰萍, 许琪, 张萱, 刘丽波 申请人:吉林大学