用于同时递送与杂合表达模式相关的RNAi因子的多重RNAi表达盒的制作方法

专利名称：：用于同时递送与杂合表达模式相关的RNAi因子的多重RNAi表达盒的制作方法用于同时递送与杂合表达模式相关的RNAi因子的多重RNAi表达盒
背景技术：
以序列特异性方式应用双链RNA抑制基因表达的应用彻底改变了药物发现工业。在哺乳动物中，RNA干扰，或RNAi,由15到49个核苷酸长的被称为小干扰RNA(RNAi因子)的双链RNA分子介导。RNAi因子可以在细胞外化学或酶促合成，之后被递送至细胞(参见，例如Fire等人，Nature(自然)，391:806-11(1998);Tuschl,等人，GenesandDev(基因和发育),13:3191-97(1999);以及Elbashir,等人，Nature(自然)，411:494-498(2001));或者通过细胞内适当的载体可以体内表达(参见，例如，第6,573,099号美国专利)。体内递送作为用于人类的有效治疗剂的未经修饰的RNAi面临大量的技术障碍。首先，由于细胞和血清核酸酶，注射入体内的RNA的半衰期只有约70秒(参见，例如，Kurreck,Eur.J.Bioch(欧洲生化杂志).270:1628-44(2003))。已经尝试通过应用化学^f奮饰增加所注射的RNA的稳定性；但是，有些例子显示化学改变导致了细胞毒性效应的增加。在一个具体实施例中，细胞不能耐受在RNAi双链中每第二个磷酸盐被磷硫酰替代的RNAi的用药(Harborth等人，AntisenseNucleicAcidDrugRev.(反义核酸药物评述)13(2):83-105(2003))。进一步进行的努力致力于发现递送未经修饰的或修饰的RNAi因子的途径，以^提供组织特异性递送，并且以充足量递送RNAi因子以产生治疗性应答而没有毒性。靶细胞，并且递送和原位表达RNAi分子的、基于病毒的和非基于病毒的载体系统。通常，自病毒或非病毒载体骨架转录小RNA作为短发夹RNA(shRNA)前体。一旦被转录，shRNA被Dicer酶处理成适当的活性RNAi因子。基于病毒的递送方法试图挖掘病毒的靶向特性以产生组织特异性，并且一旦被适当靶向，依赖内源性的细胞机制产生足够水平的RNAi因子以达到治疗有效剂量。RNAi治疗剂的一个有益用途是在治疗由杂合等位基因对中基因差异表达所引起疾病的治疗中。在过去的20年中发现了超过1200个人类疾病基因。这些疾病的一些例子包括乳腺癌、I型糖尿病、单纯型大疱性表皮松解症、乳糖耐受不良、嚢性纤维变性、范可尼贫血、和阿兹海默氏病。这些疾病相关的基因涉及孟德尔和遗传学更复杂的表型。在引起疾病的基因中的变异经常可以被定位至单核苷酸多态性(SNP)或^皮称为单体型(haplotype)组的SNP组。可以以多种途径引起SNP。可以由于在多态性位点由一个核香替代另一个核苷而引起单核苷多态性。替代可以是转换或颠换。转换是一个噤呤核苷被另一个。票呤核苷所替代或一个嘧淀核苷被另一个嘧啶核香所替代。颠换是一个噤呤被一个嘧咬所替代，反之亦然。也可以相对于对照的等位基因由去除一个核苷或插入一个核苷引起单核苷多态性。因此，多态位点可以是在位点中一个等位基因相对于另一个等位基因中单核苷具有裂隙的位点。一些SNP在基因中或基因附近存在。一种这样的种类包括落入编码多肽产物的基因区域内的SNP。这些SNP可以导致多肽产物的氨基S吏序列的改变，并引起缺陷型或其他变异蛋白的表达。在一些情况下，这些变异产物导致病理状态，例如，遗传疾病。多态性位于编码序列中导致遗传疾病的疾病例子包括高胆固醇血症、马凡氏综合征和单纯型大疱性表皮松解症。由于在一对基因中的一个等位基因的缺陷导致疾病的表型，这些疾病被归类于常染色体显性疾病。疾病等位基因的表达产物的选择性下降可以导致疾病表型的减少。因此，需要在本领域发展稳定、有效的RNAi方法以特异性改变疾病等位基因的表达。
发明内容本发明提供了稳定、有效的ddRNAi试剂和及其使用方法，以通过改变杂合等位基因对中的仅仅一个等位基因的一个或多个转录活性遗传区的表达水平，控制疾病基因的表达。本发明提供了一种用于等位基因特异性的基因控制的方法，以及与其一起使用的遗传因子，以及含有该遗传因子的遗传修饰的细胞。本发明定位于在单基因或多基因中的一个或两个或多个多态性目标，以为了调整在一异质性基因对或基因对的组中的一个或多个等位基因的表达。本发明允许含有与疾病相关的SNP或其他多态性的一个或两个或多个基因表达发生变化，而不改变表达该基因的正常或野生型版本的等位基因的表达。在只有一个区域接受静息的实施方案中，多重RNAi构建体被用于在单体型组中耙向多个SNP。在多于一个的遗传区域必须被静息的实施方案中，本发明提供了遗传因子的用途，所述遗传因子通过多重RNAi构建体促进基因静息以使直接或间接与疾病相关的杂合等位基因对中的特定等位基因的一个或多个转录活性遗传区下调或静息。这样的多重RNAi构建体可以具有一个启动子或多个启动子。这样的转录活性区在本文也被称为"单核苷遗传性靶目标"或"SNT"。ddRNAi介导的一个或多个SNT的4争息导致对受试对象或细胞培养物中异质性配对的一个等位基因的控制。本发明的RNAi因子在不显著影响正常等位基因的表达的同时，对于疾病基因的一个或两个或多个等位基因变异体可以是特异性的。因此，本发明在一个方面提供一种影响在受试对象或细胞培养物中的一个或多个基因的基因表达的方法，所述方法包括对所述受试对象或细胞培养物使用包括至少一个ddRNAi表达盒(cassette)的遗传构建体，所述ddRNAi表达盒编码含有一个、两个或更多个RNAi核苷酸序列的RNA分子，所述RNAi核苷酸序列单独地与含有一个或多个单核苷酸遗传靶目标(SNTs)或其^f汙生物，直系同源物(ortholog)或同源物(homolog)的核香酸序列的至少一部分具有至少90%的一致性，并且延迟、压制或者以其它方式减少一个或多个SNT在所述受试对象或细胞培养物中的表达，同时不影响杂合配对的正常等位基因的表达。根据指定启动子的数目(y)和RNAi因子的数目(x)的y-x命名法命名本发明的多重RNAi构建体。本发明的y-x构建体由两个或多个RNAi序列组成，所述RNAi序列受一产生单启动子/多重RNAi构建体(l-xRNAi构建体)的单个启动子控制或一构建体控制，所述构建体由两个或多个启动子组成，每一个启动子控制单个RNAi构建体，产生多重启动子/多重RNAi构建体的(y-x)RNAi构建体。在另一方面，本发明提供了如本文所描述的含有ddRNAi表达构建体的遗传修饰的细胞。优选地，该细胞是哺乳细胞，更优选地，该细胞是灵长类或啮齿类细胞，最为优选地，该细胞是人类细胞或小鼠细胞。另外，在另一个方面，本发明提供了含有本发明一个或多个遗传修饰的细胞的多细胞结构。除其他外，多细胞结构包括组织、器官或完整的有机体。根据下文详细的描述，本发明的其他目的和优势将是显而易见的。因此，通过参照在附图中所阐明的实施方案可以获得达到本发明上述特征、优势和目标并可以被详细理解的方案，以及对上文所简洁概括的本发明的更为具体的描述。应该理解的是，附图只说明本发明具体的实施方案，因此不应当认为是对其范围的限制，因为本发明允许有其他等同效果的实施方案。图l是根据本发明用于递送RNAi种类的方法的一个实施方案的简化方块2A和图2B是表示本发明的多重启动子/多重RNAi表达盒的实施方案的简化示意图。图3A和图3B显示递送作为shRNA前体的RNAi因子的多重启动子/多重RNAi表达盒的两个实施方案。图3C显示含有插在启动子/RNAi/终止子部件之间的填充区的多重RNAi表达盒的实施方案。图3D和图3E显示递送无shRNA前体的RNAi的多重RNAi表达盒的实施方案。图4A和图4B是表示本发明的单启动子/多重RNAi表达盒的实施方案的简化示意图。图5A和图5B是表示产生包装在病毒粒子中的多重RNAi表达载体的方法的简化示意图。具体实施方式在描述本组合物和方法之前，应该理解本发明不限于所描述的具体方法学、产物、仪器和因素，因为这样的方法、仪器和制剂当然可以变化。也应该理解的是在本文使用的术语只用于描述具体的实施方案，并不意在限制本发明，本发明只由所附的权利要求所限制。如在本文所使用的，单数形式"a(—个)"，"and(和)，，,和"the(所述)"包括复数指代物，除非上下文清晰地另有所指。因此，例如，述及"afactor(—因素)"是指一个因素或多个因素的混合，述及"themethodofproduction(所述生产方法)"包括指示本领域技术人员7>知的等同步骤和方法，等等。除非另有限定，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常的理解的相同的含义。通过引用将本文所提到的出版物没有限制地并入本文，以用于描述和公开在出版物中被描述的并可以与所描述的本发明结合使用的设备、制剂和方法学。在下面的描述中，提供大量具体的细节以便更彻底地理解本发明。但是，对本领域技术人员显而易见的是，可以在没有这些细节的一个或多个的情况下实施本发明。另夕卜，为了避免使本发明含糊不清，对本领域技术人员公知的特征和众所周知的步骤没有进行描述。本发明的目的是创造性的、强效的遗传组合物和使用单表达构建体向细胞同时递送至少三个不同的RNAi因子的方法。所述组合物和方法提供稳定、持续的靶核酸的抑制。微生物学、重组DNA技术、细胞生物学和病毒学的常规方法。这样的技术在文献中被清楚地解释，参见，例如，Maniatis,Fritsch和Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)(1982);DNACloning:APracticalApproach,VolumesIandII(DNA克隆:实践方法，巻I和II)(D.N.Glover，编辑.1985);OligonucleotideSynthesis(寡核苷酸合成)(M丄Gait,编辑.1984);NucleicAcidHybridization(核酸杂交)(B.D.Hames和S丄Higgins,编辑.(1984)):AnimalCellCulture(动物细胞培养)(R丄Freshney,编辑.1986);和RNAViruses:ApracticalApproach,(RNA病毒实践方法)(Alan,J.Cann,编辑，OxfordUniversityPress(牛津大学出版社)，2000)。"载体"是复制子，例如质粒、噬菌体、病毒构建体或科斯质粒(cosmid),另外一个DNA片段可以与其连接。载体被用于转导和在细胞中表达所述DNA片段。"启动子"或"启动子序列"是能够在细胞中结合RNA聚合酶并启动转录多聚核苷酸或多肽编码序列，例如信使RNA、核糖体RNA、小核核仁RNA或者由任何RNA聚合酶I、II或III的任何种类转录的任何种类的RNA的DNA调节区。当这样的核酸例如作为与转染试剂在一起的混合体或被包装在病毒粒子内被介导入细胞内部的时候，则细胞被外来或异质性核酸或载体"转化"、"转导"或"转染"。转化的DNA可以整合(共价连接)或不整合入细胞的基因组。至于真核细胞，稳定的转化细胞是指在细胞中转化DNA已经整合入宿主细胞染色体或保持为染色体外形式，这样，在细胞复制期间，转化DNA由子代细胞继承的细胞，或者是存在稳定的游离体的非复制的差异细胞。术语"RNA千扰"或"RNAi"通常是指一种方法，在所述方法中，双链RNA分子或短发夹RNA改变与其具有基本或全部同源性的核酸序列的表达。术语"RNA种类"或"RNA因子"是指引起RNAi的独特的RNA序列；术语"RNAi表达盒"是指根据本发明实施方案的含有三个或更多个RNA种类的盒。本发明的术语"多重RNAi构建体"使用下列命名以指定启动子的数目(y)和RNAi因子的数目(x)。在本发明的一个实施方案中，本发明的y-xRNAi构建体由在一单个启动子控制下的两个或多个RNAi序列组成(l-x)。含有两个启动子每一个启动子各自控制RNAi构建体的构建体是2-2多重启动子/多重RNAi构建体，等等。启动子的数目y可以是两个或三个或更多个。RNAi因子的数目x可以是两个或三个或更多个。优选地y小于或等于x。图l是显示一种方法的步骤的简化流程图，在所述方法中，可以使用根据本发明的多重RNAi表达构建体。首先，在步骤200中，构建耙向一具体疾病目标的多重RNAi表达盒。接着，在步骤300中，将多重RNAi表达盒连接入适当的病毒或非病毒递送构建体。之后在步骤400,RNAi表达递送构建体被包装入病毒粒子内，随后病毒粒子被递送至要在步骤500中被处理的耙细胞。在下文给出每一涉及的这些步骤的及成分的详细内容。通过本领域技术人员公知的大量不同的操作可以合成产生或酶促产生根据本发明的多重RNAi表达构建体，并使用例如在Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual.(分子克隆:实-验室手册)第二版.，ColdSpringHarborPress(冷泉港出版社)，ColdSpringHarbor(冷泉港)，纽约(1989)中所描述的标准的重组DNA4支术纯化，并且遵守在例如美国卫生和福利部(Dept.ofHHS)中描述的准则，国立卫生研究院(NIH)重组DNA研究的指导方针等规定。在一个优选的实施方案中，使用亚磷酰胺或类似的化合物使用本领域公知的操作合成多重RNAi表达盒。图2A和图2B是根据本发明实施方案的多重RNAi表达构建体的筒化示意图。图2A显示具有三个启动子/RNAi/终止子部件(3-3RNAi表达盒)的多重RNAi表达盒(10)的实施方案，并且图2B显示具有五个启动子/RNAi/终止子部件(5-5RNAi表达盒)的多重启动子表达盒(10)的实施方案。Pl、P2、P3、P4和P5代表启动子元件。RNAil、RNAi2、RNAi3、脂Ai4和RNAi5代表五个不同RNAi种类的序列。Tl、T2、T3、T4和T5代表终止子元件。根据本发明的多重RNAi表达盒可以包括三个或更多个启动子/RNAi/终止子部件，其中包括在任何多重启动子RNAi表达盒中的启动子/RNAi/终止子部件的数目由例如所选才奪的递送系统的包装大小(例如，一些病毒，例如AAV，具有相对严格的大小限制)；细胞毒性，和最大效果(即，例如，当四个RNAi序列的表达与十个RNAi序列的表达的治疗效果一样)限制。在含有盒的多重RNAi部件中的三个或多个RNAi种类都具有不同的序列；即RNAil、RNAi2、RNAi3、RNAi4和RNAi5彼此都不同。但是，在任何盒中的启动子元件可以是相同的(即，例如，Pl、P2、P3、P4和P5中的两个或多个可以是相同的)；在任何盒中的所有启动子可以彼此不同；或者可以在任何盒中具有只出现一次的启动子元件的结合，以及出现两次或多次的启动子元件的结合。近似地，在任何盒中的终止元件可以是相同的(即，例如，Tl、T2、T3、T4和T5可以是相同的，例如邻近延伸4个或多个T残基)；在任何盒中的所有终止元件可以彼此不同；或者在任何盒中具有只出现一次的终止元件的结合，以及出现两次或多次的终止元件的结合。优选地，在含有任何盒的每一个启动子/RNAi/终止子部件中的启动子元件和终止元件都不同，以降低在部件和/或盒之间DNA重组事件的可能性。另外，在一个优选的实施方案中，在每一个启动子/RNAi/终止子部件中^^用的启动子元件和终止元件;波此匹配；即，启动子和终止子元件取自在其中它们天然存在的同一基因。图3A、图3B和图3C显示含有表达短sh脂A的多重RNAi表达盒的可选择实施方案的多重RNAi表达构建体。shRNA是短双链，其中正义链和反义链通过发夹环连接。一旦表达，shRNA被加工成RNAi种类。盒A、B和C代表3个不同的启动子元件，并且箭头指示转录的方向。终止1(TERM1)、终止2(TERM2)和终止3(TERM3)代表3个不同的终止序列，并且shRNA-l、shRNA-2和shRNA-3代表3个不同的shRNA种类。在实施方案中的多重RNAi表达盒从标记为A的盒延伸向标记为终止3(Term3)的箭头。图3A显示在盒中采以同样方向的三个启动子/RNAi/终止子部件(20)中的每一个，同时，图3B显示处于一个方向的shRNA-l和shRNA-2的启动子/RNAi/终止子部件，以及处于相反方向的shRNA-3的启动子/RNAi/终止子部件(即，转录在盒的两股链上发生)。图3C显示通过DNA的一个区域间隔以增加启动子/RNAi/终止子部件之间距离的每一个盒。被插入的DNA,称为"填充"DNA，可以是在5-5000个核苷之间的任何长度。在启动子之间可以有一个或多个填充片段。在有多个填充片段的情况下，它们可以有相同或不同的长度。填充DNA片段优选为不同的序列。填充DNA片段可以被用于增加本发明多重RNAi盒的大小以为了使其适宜进入相应的递送载体。根据与多重RNAi盒相关的具体载体的大小需要确定填充体的长度。例如，在一个实施方案中，为了适当达到AAV载体大小的需要，填充体长度共4000个核苷酸(nt)。在另一个实施方案中，为适当地达到自我互补AAV载体的大小需要，填充体片段共2000nt。也可以使用其他的变型。图3D和图3E显示包括表达没有发夹环的RNAi种类的多重启动子RNAi表达盒的可选择实施方案的多重RNAi表达构建体。在两个图中，Pl、P2、P3、P4、P5或P6代表启动子元件(箭头指示转录方向)；并且T1、T2、T3、T4、T5和T6代表终止元件。同样在两个图中，RNAil正义链和RNAil反义链(a/s)是互补的，RNAi2正义链和RNAi2a/s是互补的，RNAi3正义链和RNAi3a/s是互补的。在图3D中所显示的实施方案中，所有的三个RNAi正义《连序列从一股链(经Pl、P2和P3)转录，同时三个RNAi反义链(a/s)序列从互补链(经P4、P5和P6)转录。在该具体实施方案中，RNAil反义链的终止元件(T4)落入启动子P1和RNAil正义链序列之间；同时，RNAil正义链的终止元件(Tl)落入RNAil反义链序列和其启动子P4之间。该基元被重复，这样，如果图3D所显示的上链被指定为(+)链，并且下链被指定为(-)链，则从左到右移动所遇到的元件将是P1(+)、T4(-)、RNAil(正义链和反义链)、Tl(+)、P4(-)、P2(+)、T5(-)、RNAi2(正义4连和反义4连)、T2(+)、P5(-)、P3(+)、T6(-)、RNAi3(正义链和反义链)、T3(+),和P6(-)。在图3E所显示的可选4奪实施方案中，所有的RNAi正义链和反义链序列从同股链转录。本领域技术人员认识到图3A到图3E所显示的多重启动子RNAi表达盒的任一实施方案可以用于具体应用，其结合或变体也同样可以。图4A和图4B是根据本发明实施方案各自含有三个和五个RNAi茎环结构的1-3和l-5RNAi表达盒的简化示意图。本领域技术人员应当理解本发明的l-xRNAi表达盒可以包括二、四、六或更多个茎环结构，并且图中所显示的实施方案是示例性的。这些图显示了含有一个启动子和;波间隔子区分隔的三个或五个茎环结构的1-3和l-5RNAi表达盒的实施方案。茎区1-5含有在约17-21之间的碱基对，优选是19个碱基对。环区1-5含有在约3-20之间的核苦酸，优选5到9个核苷酸，更优选为6个核苷酸。在RNAi茎之间的间隔子区(N^N2…)在约4-10个核苷酸之间，优选为6个核苷酸。在一些实施方案中，可以使用强度可变的启动子。例如，使用三个或多个强启动子(例如，PolIII型启动子)，在一些情况下，例如去除可利用的核苷酸库或其他转录所需的细胞组分，可使细胞负荷加重。另外或可选择地，使用几个强启动子可导致RNAi因子在细胞中表达至毒性水平。因此，在一些实施方案中，在多重启动子RNAi表达盒中的一个或多个启动子可以弱于盒中的其他启动子，或者盒中的所有启动子可以低于最大速率表达RNAi因子。使用分子技术，或其他，例如通过调整元件可以调整也可以不调整启动子以达到更弱的转录水平。启动子可以是组织特异性或细胞特异性的。术语"组织特异性"当其用于启动子时是指能够指导对特异类型的组织(例如肝脏)选择性表达相关的核苷酸序列的启动子，而在不同类型的组织(例如脑)中的同样的相关核苷序列相对缺乏表达。这样的组织特异性启动子包括诸如lck、肌细胞生成素，或thyl的启动子。术语"细胞特异性"当其用于启动子时是指能够指导在特定类型的细胞中相关核苷序列的选择性表达的启动子，而在同样组织中不同类型的细胞中的相关的同样的核苷序列相对缺乏表达(参见，例如，Higashibata,等人，J.BoneMiner.Res(骨骼矿物质研究杂志).Jan19(1):78-88(2004);Hoggatt,等人，Circ.Res.(循环研究)，Dec.91(12):1151-59(2002);Sohal，等人.，Circ.Res.(循环研究)Jul89(1):20-25(2001);以及Zhang等人，GenomeRes(基因组研究)Jan14(1):79-89(2004))。术语"细胞特异性，，当用于启动子时也指在单一组织内的区域内能够促进相关核苷序列的选择性表达的启动子。可选择地，启动子可以是组成性的或可调节的。另外，可以调整启动子以使其具有不同的特异性。术语"组成性的"当涉及启动子时是指启动子能够在缺乏刺激(例如，热休克、化合物、光等)时能够指导可操作性连接的核酸序列的转录。通常，组成性的启动子能够在基本上任何细胞或任何组织中指导编码序列的表达。用于转录RNAi种类的启动子优选是组成性的启动子，例如由RNA聚合酶II控制的泛素、CMV、卩肌动蛋白、组蛋白H4、EF-la或pgk基因的启动子，或使用由RNA聚合酶I控制的启动子元件。在优选实施方案中，使用由RNA聚合酶III控制的启动子元件，例如U6启动子(例如，U6-l、U6-8、U6-9)、HI启动子、7SL启动子、人Y启动子(hYl、hY3、hY4(参见Maraia,等人，NucleicAcidsRes(核酸研究)22(15):3045-52(1994))，以及hY5(参见Maraia，等人，NucleicAcidsRes(核酸研究)24(18):3552-59(1994))、人MRP-7-2启动子、腺病毒VA1启动子、人tRNA启动子、5s核糖体RNA启动子，以及任何这些启动子的功能性的杂交和组合。可选择地，在一些实施方案中，选择能够允许可诱导表达RNAi种类的启动子可能是最佳的。大量的使用这样的启动子的、用于可诱导表达的系统在本领域是公知的，其包括但不限于四环素应答系统和lac操作子-抑制子系统(参见PCT出版物WO03/022052Al;和美国专利申请出版物第2002/0162126Al号)，蜕皮激素调节系统，或由糖皮质激素、孕激素、雌激素、RU-486、类固醇、甲状腺激素、环AMP、细胞因子、4丐化醇家族的调节子调节的启动子，或金属硫蛋白启动子(由无机金属调节)。在本发明的多重RNAi表达构建体中也可以存在一个或多个增强子以增加相关基因的表达。适宜于应用在本发明实施方案中的增强子包括ApoEHCR增强子，如果想在肝脏中表达时有最近被描述的(参见，Xia等人，NucleicAcidsRes(核酸研究)31-17(2003))CMV增强子，以及对本领域技术人员而言是公知的其他增强子，例如指导肌细胞转录的肌细胞特异性增强子。由本发明的RNAi表达盒编码的RNAi序列导致一种或多种干扰RNA的表达，所述干扰RNA是在哺乳动物细胞中没有毒性的短的、双链RNA。对本发明的RNAi种类的长度没有特别限制，只要其不显示细胞毒性即可。RNAi可以是，例如15-49个碱基对(bp)的长度，优选是15-35bp的长度，更为优选是19-29bp的长度。RNAi的双链RNA部分可以完全是一致的，或者由于序列错配(每一条链上相对应的核苷酸不互补)，凸出(在一条链上缺乏相对应的互补核苷酸)等等，可以包括非配对的部分。这样的非配对部分可以被容忍到其不显著干扰RNAi双链形成或效力的程度。根据本发明的RNAi种类的末端可以是钝性的或粘性的(突出的)，只要RNAi能有效静息靶基因即可。粘性的(突出的)末端结构不仅仅限制为3，突出，也可以包括5，突出结构，只要生成的RNAi能够诱导RNAi效应即可。另夕卜，突出的核苷的数目可以是任何数目，只要生成的RNAi能够诱导RNAi效应即可。例如，如果存在，突出可以由1-8个核苷酸组成，优选地其由2-4个核苷酸组成。在本发明中使用的RNAi种类可以具有茎环结构的前体(shRNA),在其中，双链RNA的末端由单链的连接子RNA连接。shRNA的单链环部分的长度可以是5-20bp的长度，并且优选是5-9bp的长度。与常染色体显性疾病相关的任何被转录的核酸序列可以是本发明的RNAi因子的耙。可能作为RNAi耙的基因例如，但不限于发育基因(例如，粘附分子、周期蛋白激酶抑制剂、Wnt家族成员、Pax家族成员、温格尔德螺旋(Wingledhelix)家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子和其受体，生长/分化因子和其受体、神经传递素和其受体)；癌基因(例如，ABL1、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSF1R、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、M画2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3,和YES);肿瘤抑制基因(例如，APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53和WT1);以及酶(例如，ACC合成酶和氧化酶、ACP去饱和酶和羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、乙醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、查尔酮合成酶、几丁质酶、环氧合酶、脱羧酶、糊精酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、颗粒结合型淀粉合成酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、整合酶、菊粉酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧合酶、溶菌酶、胭脂碱合成酶、章鱼碱合成酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、植酸酶、植物生长调节剂合成酶、多聚半乳糖搭酸酶、蛋白酶和肽酶、普鲁兰酶、重组酶、逆转录酶、2-磷酸核酮糖羧化酶(RUBISCOs)、拓朴异构酶和木聚糖酶)；病毒结构基因例如衣壳和包膜蛋白；细菌基因例如涉及复制或结构特征的基因，或来自其它病原体的涉及复制或结构特征的基因。另外，本发明的多重RNAi表达盒可以用于耙向特异性的序列，所述序列对在诸如SCA、引起亨廷顿舞蹈病的等位基因、或引起成骨不全症的胶原基因等位基因的在常染色体显性疾病中引起病理作用的等位基因而言是独特的。本发明的一个重要方面在于，通过siRNA因子可以静息引起个体疾病的靶基因等位基因，并对正常的等位基因表达没有影响或具有降低的影响。本发明的另一方面在于，一个或多个特异性等位基因的多SNP可以同时被本发明的多重RNAi因子所耙向。本发明的这个特征使其与现有技术方法相区别，在现有^f支术中，只能耙向单一基因的单一特征。用于比较的序列的比对方法和RNAi序列选择的方法在本领域是公知的。使用数学算法可以实现对在两个或更多个序列之间的一致性百分比的确定。优选地，这种数学算法的非限制性例子是Myers和Miller算法(1988);Pearson和Lipman的寻找近似性法(1988);以及Karlin和Altschul的方法(1993)。优选地使用这些数学算法的计算机应用。这样的应用包括但不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics,MountainView,力口利福尼亚州获得)；ALIGN程序(2.0版本)，GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA，Megalign(使用JotunHein、Martinez、Needleman-Wunsch算法)，DNAStarLasergene(参见www.dnastar.com)和威斯康星遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage)中的TFASTA,版本8(可乂人GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDrive,麦迪逊，美国威斯康星州获得)。使用缺省参数或由操作者选择参数可以实施采用这些程序的比对。Higgins对CLUSTAL程序进行了详细的描述。ALIGN程序以Myers和Miller算法为基础；BLAST程序以Karlin和Altschul的算法为基础。通过国家生物#支术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)可共获得实施BLAST分析的软件(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)。对于序列比较，通常一个序列作为要进行比较的测试序列的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，接着设定亚序列坐标，并且设定序列算法程序参数。之后根据设定的程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。通常，通过RNAi抑制靶序列需要在靶序列和RNAi分子的正义链之间具有高度的序列同源性。在一些实施方案中，这样的同源性高于约70%，并且可以高于约75%。优选地同源性高于约80%,以及高于85%或者甚至90%。更优选地，在耙序列和RNAi正义链之间的序列同源性高于约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。当靶向对具体等位基因有特异性的异质性单体型组时，本发明的多重RNAi表达构建体特别有用。除了基于靶序列保守区选择RNAi序列之外，也可以基于其他因素选择RNAi序列。尽管以想定的靶基因的特征(例如，GC含量百分比，距离翻译起始密码子的位置，或基于电子序列数据库搜索所提出的RNAi的同源性的序列近似性，热力学配对标准)为基础，对鉴定在RNAi中有效的序列的选择标准的设计进行了大量尝试，当前还不可能很有把握地预测出与想定的靶目标相对应的无数可能的候选RNAi序列中，哪个确实能引起RNAi静息应答。取而代之的是，通常产生和鉴定个别具体的候选RNAi多核苷酸序列以确定是否51发对想定靶目标的表达的干扰。如所提到的，多重RNAi表达盒的RNAi编码区操作性地与终止子元件相连。在一个实施方案中，终止子包括四个或更多个胸腺嘧啶脱氧核苷的片段。在一个实施方案中，只有一个终止子。在另一个优选的实施方案中，针对每一个启动子/RNAi元件的有单独的终止子元件。在一个实施方案中，所使用的终止子元件都是不同的，并且与来自衍生出终止子的基因的启动子元件相匹配。这样的终止子包括SV40聚A、AdVAl基因、5S核糖体RNA基因，以及人t-脂A的终止子。另外，启动子和终止子可以混和在一起并相互匹配，就如同通常利用RNA聚合酶II启动子和终止子的做法一样。另外，被转录的RNAi因子可以设定为具有位置设计好的多克隆位点和/或单限制性内切酶位点，这样，启动子、RNAi和终止子元件可以容易地被移除或替代。再者，使用位置设计好的限制性内切酶位点和/或互补粘性末端可以由较小的寡核香酸组分装配多重启动子RNAi表达盒。根据本发明的实施方案的一种方法的基本载体由具有多重接头的质粒组成，在所述多重接头中所有的位点都是唯一的(尽管这不是绝对地要求)。接着，在其设定的唯一位点之间插入每一个启动子，生成具有三个或更多个启动子的基本盒，其中所有启动子都有可变的方向。接着，同样地，将退火的引物对插入每一个单独的启动子下游的单独位点中，生成三重的表达盒构建体。使用在三重表达盒构建插入体侧翼的两个单酶切位点(相同或不同的位点)，可以将这种插入体移入，例如AAV骨架。在图1的步骤300中，将多重RNAi表达盒连接入递送载体中。多重RNAi表达盒所插入的、并^皮应用于高效转导和在不同细胞类型中表达RNAi因子的构建体优选地衍生于病毒，并与病毒递送相兼容。使用本领域公知的任何遗传工程技术可以完成构建体的产生，包括但不限于，PCR、寡核苷酸合成、限制性核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化，以及DNA测序的标准技术。构建体优选地包括，例如，将多重启动子RNAi表达构建体包装入病毒粒子所必需的序列和/或将多重启动子RNAi表达构建体整合入靶细胞基因组的序列。病毒构建体也可以包括病毒复制和增殖的基因，尽管在优选的实施方案中可以以反式提供这种基因。另外，病毒构建体可以包括源自任何已知的有机体以天然形式或修饰形式整合的基因或遗传序列。例如，优选的病毒构建体包括用于细菌中构建体的复制的序列。构建体也可以包括另外的遗传元件。可以包括在构建体中的元件类型没有任何方式的限制，并且本领域技术人员可以进行选择。例如，另外的遗传元件可以包括才艮导基因，例如一种或多种的诸如GFP或RFP的荧光素标记蛋白的基因；诸如(3-半乳糖苷酶、荧光素酶、|3-葡糖苷酸酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌的胚胎碱性磷酸酶等容易检测的酶；或诸如激素或细胞因子等容易进行免疫检测的蛋白。在本发明的实施方案中发现可以使用的其他遗传元件包括那些编码例如腺苷脱氨酶、氨基寿唐香石粦酉吏寿争牙多酶(aminoglycodicphosphotransferase)、二氬叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶的赋予细胞选"l奪性生长优势的蛋白的遗传元件，或者那些编码提供营养缺陷型所缺失的生物合成能力的蛋白的遗传元件。如果一起包括有报导基因与多重启动子RNAi表达盒，则可以包括内在的核糖体进入位点(IRES)序列。优选地，另外的遗传元件可操作地与独立的启动子/增强子连接并受其控制。基于任何适当病毒的病毒递送系统可以用于递送本发明的多重启动子RNAi表达构建体。另外，可以使用杂合的病毒系统。根据不同的参数，例如被递送靶向的组织、系统的转导效率、致病性、免疫学特性及相关毒性等等来选择病毒递送系统。考虑到通过本发明的多重启动子RNAi表达构建体可被干扰的疾病目标呈多样性，显然没有适合于所有应用的单一的病毒递送系统。当选择在本发明中使用的病毒递送系统时，重要的是选择一种系统，其中含多重启动子RNAi表达盒的病毒粒子优选地1)可繁殖并稳定增殖；2)能够纯化到高滴度；以及3)能够介导靶向的递送(将多重启动子RNAi表达构建体递送到相关组织或器官而不广泛扩散)；4)能够以构成性或可调节性表达。总之，在基因治疗中使用的五个最常规使用的病毒系统种类根据其基因组是整合入宿主细胞染色质(致肿瘤的逆转录病毒和慢病毒)，或是主要作为染色体外的游离体稳定存在于细胞核(腺相关病毒、腺病毒和疱渗病毒)，将它们分为两组。该特性是每一个具体应用的载体的适宜性的重要的决定因素；在一定的情况下非整合载体可以介导在非增殖细胞中的稳定持久表达，但是如果需要在分化细胞中保持稳定的遗传改变，则整合载体是选择的工具。例如，在本发明的一个实施方案中，使用源自细小病毒家族的病毒。细小病毒是小单链、无包膜的DNA病毒家族，其基因组大约为5000个核苷酸长。包括在其家族成员中的有腺相关病毒(AAV)，它是一种根据命名需要与另一种病毒(通常为腺病毒或疱渗病毒)共感染以启动和保持多产的感染循环的依赖性的细小病毒。在缺乏这样的辅助者病毒时，通过在非分化细胞和分化细胞中受体介导的结合和内在化，穿入核，AAV仍然可以感染和转导靶细^^包。一旦在核中，病毒去衣壳，并且转基因由大量不同的形式一其中最稳定的是环状单体形式被表达。AAV将整合入被稳定转导的1-5%的细胞的基因组中(Nakai,等人，J.Virol(病毒学杂志)76:11343-349(2002))。转基因的表达可以异常的稳定，并且在一个IX因子的AAV递送的研究中，在单次直接注入病毒后，在犬模型持续表达治疗水平的蛋白超过5.0年。由于在缺乏辅助者病毒时，AAV感染不产生后代病毒，转导的程度只受限于感染病毒的原始细胞。正是这种特征使AAV成为用于本发明的优选的基因治疗载体。另夕卜，不像逆转录病毒、腺病毒，和单纯疱渗病毒，AAV似乎缺乏人致病性和毒性(Kay,等人，Nature(自然)424:251(2003)和Thomas,等人，NatureReviewsGenetics(遗传学自然评论),4:346-58(2003))。由于基因组通常只编码两种基因，并不令人惊奇的是，作为递送工具，AAV的包装能力只限制在单链4.5千个碱基(kb)。但是，尽管该大小的限制性可以限制能被递送用于替代基因治疗的基因，但是其对例如RNAi的短序列的包装和表达没有不利影响。用于本发明多重启动子RNAi表达构建体的另一种病毒递送系统是基于逆转录病毒科病毒的系统。逆转录病毒包括具有两个独特特征的单链RNA动物病毒。首先，逆转录病毒的基因组是双倍体，由两个拷贝的RNA组成。第二，通过病毒粒子相关酶逆转录酶，RNA被转录为双链DNA。该双链DNA或原病毒之后可以被整合入宿主基因组并作为宿主基因组的稳定整合成分从父代细胞传递到后代细胞。在一些实施方案中，慢病毒属是转录病毒科在本发明中使用的优选成员。慢病毒载体经常由疱疹性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)假型包装化，并衍生于人类免疫缺陷性病毒(HIV),即人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子；梅迪和维斯纳病毒(visan-maedi),其在绵羊中引起脑炎(维斯纳)或肺炎；马感染性贫血病毒(EIAV),其在马中引起自身免疫溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV),其在猫中引起免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV),其在牛中引起淋巴结病和淋巴球增多；以及猿免疫缺陷病毒(SIV),其在非人的灵长类动物中引起免疫缺陷和脑病。基于HIV的载体通常保持<5%的父代基因组，并且<25%的基因组被整合入包装构建体中，其使产生能够回复复制的HIV的可能性最小化。通过开发自我灭活载体进一步增加了生物安全性，所述载体在长末端重复序列的下游被删除了调节元件，除去了对于载体动员是必须的包装信号的转录。使用慢病毒载体的主要优势是基因转移持续在大多数组合和细胞类型中进行。用于表达RNAi因子的以慢病毒为基础的构建体优选地包括源自慢病毒5'和3'长末端重复序列(LTRs)的序列。更优选地，病毒构建体包括被灭活的或自我灭活的源自慢病毒的3'LTR。可通过在本领域任何已知方法进行3'LTR的自我灭活。在一个优选的实施方案中，3'LTR的U3元件包括删除其增强子序列，优选地为TATA盒，Spl和NF-kB位点。作为自我灭活3'LTR的结果，整合入宿主细l包基因组的前病毒将包括被灭活的5'LTR。LTR序列可以是来自任何种的慢病毒的LTR序列。以慢病毒为基础的构建体也可以结合用于MMLV或MSCV，RSV或哺乳动物基因的序列。另夕卜，源自慢病毒5'LTR的U3序列在病毒构建体中可以被启动子序列所替代。这可以增加从包装细胞系获得的病毒的滴度。也可以包括增强子序列。可以用于将本发明的多重启动子RNAi表达盒递送至相关细胞的、本领域技术人员已知的其它的病毒或非病毒系统，包括但不限于基因删除的腺病毒-转座子载体，所述载体通过整合入宿主细胞在体内稳定地保持病毒编码的转基因(参见Yant，等人，NatureBiotech(自然生物技术)20:999-1004(2002));4汙生于辛德毕斯(Sindbis)病毒或塞姆利基森林(Semlikiforest)病毒(参见Perri,等人，J.Virol.(病毒学杂志)74(20):9802-07(2002))的系统；衍生于新城疫病毒或仙台(Sendai)病毒的系统；或缺乏细菌DNA序列的小环状DNA(mini-circleDNA)载体(参见Chen,等人,MolecularTherapy(分子治疗).8(3):495-500(2003))。如在美国专利出版物第2004/0214329号所描述的小环状DNA公开了提供持续高水平核酸转录的载体。环状载体的特征在于缺乏表达静息的细菌序列，并且可以包括单向的位点特异性的重组产物序列以及表达盒。在图1的步骤400中，多重RNAi表达构建体被包装入病毒粒子中。本领域任何公知方法可以用于产生感染性病毒粒子，所述病毒粒子的基因组包括病毒多重RNAi表达构建体的一份拷贝。图5A和图5B显示可选择用于将本发明的多重RNAi表达构建体包装入病毒粒子以进行递送的方法。图5A中的方法利用能以反式稳定表达病毒蛋白，以及其它的对于具体的病毒递送系统是必需或优选的序列(例如，复制、结构蛋白和病毒装配所需的序列)，和用于进入组织的或衍生于病毒或人工的配体的包装细胞，所述病毒蛋白对于将病毒多重RNAi表达构建体整合入病毒粒子而言是必需的。在图5A中，多重RNAi表达盒被连接于病毒递送载体(步骤300),并且生成的病毒多重RNAi表达构建体被用于转染包装细胞(步骤410)。之后包装细胞复制病毒序列，表达病毒蛋白，并且将病毒多重RNAi表达构建体包装入感染病毒粒子(步骤420)。包装细胞系可以是能够表达病毒蛋白的任何细胞系，所述细胞系包括但不限于293,HeLa,A549,PerC6，D17,MDCK，BHK，bingcherry,phoenix,Cf2Th,或由本领域技术人员所公知或开发出的任何其它细胞系。在例如美国专利第6,218,181号中描述了一种包装细胞系。可选择地，不稳定表达必需的病毒蛋白的细胞系可以与两种或多种构建体共转染以达到功能粒子的高效生产。所述构建体中的一种包括病毒多重RNAi表达构建体，其它质粒包括编码蛋白的核酸，所述蛋白对于细胞产生功能性病毒(复制和包装构建体)以及其它辅助功能而言是必需的。在图5B显示的方法利用不能稳定表达病毒复制和包装基因的细胞进行包装。在这种情况下，多重RNAi表达构建体被连接于病毒递送载体(步骤300),之后与一种或多种表达对于感染病毒粒子复制和生产是必需的序列的载体共转染(步骤430)。细胞复制病毒序列，表达病毒蛋白并将病毒多重RNAi表达构建体包装入感染病毒粒子(步骤420)。在包装细胞系中生产之后，纯化和定量(滴定)含有多重RNAi表达构建体的病毒粒子。纯化策略包括密度梯度离心，或优选地，柱层析方法。病毒或非病毒递送方法的选择是基于特定的细胞类型或组织是否将是RNAi治疗的靶目标，或者治疗是否是系统性的，或者是优选持续的还是暂时的静息效应，RNAi治疗的用药模式，等等。在图1的步骤500中，多重RNAi表达构建体被递送至需要处理的细胞。本发明的多重RNAi表达构建体可以在体外(&v"ra)或离体(exWvo)被导入细胞内，之后被放入动物体或人体内以实现治疗，或通过体内用药直接给药至生物体，器官或细胞。通过病毒感染的递送是优选的递送方法；但是，可以使用任何适当的方法递送多重RNAi表达构建体。使用任何常规的方法可以将含多重RNAi构建体的载体用药于哺乳动物宿主，其中在本领域已知有大量不同的这样的方法。通过任何数量的途径，包括病毒感染、微注射或嚢泡融合可以将核酸导入到组织或宿主细胞中。如Furth等人Anal.Biochem.(分析生物化学)115(205):365-368(1992)所描述，也可以使用注射进行肌肉内用药。可以将核酸涂敷在金微粒子上，并通过粒子轰击装置经皮内递送，或根据文献(参见，例如，Tang等人，Nature(自然)356:152-154(1992))中描述的"基因枪"，其中金4鼓粒被涂敷以DNA，之后被轰击进入皮肤细胞。另一种用于本发明方法的递送方法包括使用授权给Davis等人的美国专利第6,509,323号中所描述的CyclosertTM技术。CyclosertTM技术平台是基于被称为环糊精的葡萄糖的杯状环形重复分子。环糊精分子的"杯"可以与其它分子形成"包含复合体"，使其可以用其它部分结合Cyclosert聚合物以提高稳定性或增加耙向配体。另外，发现环糊精在人体内基本是安全的(单独的环糊精普遍促进FDA批准的口服和静脉内用药药物的溶解性)，并且可以以低成本大量购得制药级别的环糊精。这些聚合物有非常高的水溶性，在治疗剂量上甚至重复用药时是非毒性和非免疫原性的。聚合物可以容易地适应以显著高于脂质体的药物荷载携带广范围的小分子治疗剂。含多重RNAi构建体的载体可配制成注射制剂，或通过在水性溶剂或非水性溶剂，例如油，合成的脂肪酸甘油酯，高级脂肪酸或丙二醇的酯中溶解，悬浮或乳化用药；并且如果需要，伴以常规的添加剂，例如增溶剂，等渗剂，悬浮剂，乳化剂，稳定剂和防腐剂。另外，通过与适当的，制药学可接受的载体或稀释剂结合，可以将含有多重RNAi构建体的载体制备成药物组合物。在制药学剂型中，含有多重RNAi构建体的载体可以被单独用药或与其它制药学活性化合物结合或组合用药。本领域技术人员将容易地认识到含有多重RNAi构建体的载体的剂量水平将作为递送工具的性质，转导靶细胞的相对容易度，RNAi种类在靶细胞中的表达水平等的函数而改变。根据本发明的RNAi因子包括可作用于常染色体显性(AD)基因型的RNAi因子。AD疾病的例子包括成人多嚢肾病、亨廷顿舞蹈病，和冯威利布兰德病。AD疾病可以归因于受体蛋白或结构蛋白的变异。具体地说，本发明的RNAi因子被定向于与一种SNP或一套SNP相关联的AD疾病。对于发现单基因作为病因的疾病而言，例如，肌张力障碍(Distonia)、亨廷顿病，或结肠癌，本发明的多重RNAi构建体通过应用也^C称为单体型的等位基因特异性SNP组靶向作用于疾病等位基因的几个区域。由于可以攻击同样基因的多个靶目标，该方法极大地提高了降低表达的效率。这使得可达性问题阻碍本发明RNAi因子效率的可能性最小化。对于显示为多基因缺陷作为病因的疾病而言，例3口，希尔施普龙病(Hirschsprungdisease)、骨质發1^>症，或青光眼一本发明的多重启动子盒同时靶向作用多个基因。在下文用代表性的蛋白家族列出了在所提出的SNPs和每一分类的基因成员之间的可能的疾病相互关系的例子。淀粉酶淀粉酶负责寡糖或多糖中的1,4-a-糖苷键连接的内切性水解。淀粉酶基因中的改变可以指示延迟成熟以及各种淀粉酶导致的瘤和癌。淀粉样物血清淀粉样物A(SAA)蛋白包括与高密度脂蛋白(HDL)高度相关的脊推动物蛋白家族。在炎症中，该家族特定成员的合成大大增加。血浆SAA水平的长时间升高，如在慢性炎症中一样，导致称作淀粉样变性的疾病状况，其影响肝脏、肾脏和脾脏，其以在这些组织中SAA的高度不溶性积聚为特征。淀粉样物选择性限制胰岛素刺激的糖利用和肌肉中的糖原储存，同时不影响脂肪细胞的葡萄糖代谢。纤维状淀粉样蛋白在神经元内的沉积，如神经原纤维缠结，在细胞外沉积，如附着斑，和在血管内，是阿兹海默病和老年唐氏综合征(agedDown'ssyndrome)的特征。淀粉样物的沉积也与II型糖尿病相关。血管生成素CAngiopoeitin)血管生成素/纤维蛋白原家族成员显示出刺激新生血管的产生，限制新生血管的产生，以及在血液凝结中扮演几种角色。新生血管的产生，被称为血管生成，也是肿瘤生长为使肿瘤获得扩展所需要的血液供应的基本步骤。这些基因的变化可以增加任何形式的心脏疾病、大量的血液凝结紊乱、中风、高血压和肿瘤形成和转移的易感体质的危险性。特别是，本发明的RNAi因子可以减少变异株的表达并可以作为抗高血压、化疗，以及抗肺瘤因子的治疗剂。凋亡相关蛋白活细胞自杀(凋亡)由诸如生长因子的去除和毒素等事件诱导。其由调节子控制，所述调节子或限制程序化细胞死亡的效应(抗凋亡)或阻断抑制子的保护效应(促凋亡)。许多病毒通过编码其自身的抗凋亡基因阻止其耙细胞过快死亡找到了对抗防御性凋亡的途径。本发明的RNAi因子有助于耙向这些基因的等位基因变异抹。钙粘附蛋白、细胞周期蛋白、聚合酶、癌基因、组蛋白、激酶诸如细胞周期蛋白的细胞分化/细胞周期通路的成员，许多转录因子和激酶，DNA聚合酶、组蛋白、解旋酶和其他癌基因在癌发生中扮演关键的角色，其中不被控制的细胞增生导致肺瘤形成以及最后的转移。这些基因中的变异可以是从肿瘤形成的高风险到增高的转移率的任何癌症形式易感体质的前兆。特别地，这些变异抹可以被本发明的RNAi因子所耙向。集落刺激因子相关蛋白粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子是通过控制2个相关的血液白细胞种群，粒细胞和单核巨噬细胞的产生、分化和功能对造血作用产生影响的细胞因子。与这些种类的基因相关的常染色体显性疾病包括亨廷顿病和骨质疏松症。本发明的RNAi因子可以靶向这些基因的多个等位基因变异抹，同时不影响正常等位基因的表达。补体相关蛋白补体蛋白是免疫相关的细胞毒性因子，其在清除靶细胞的链反应中起作用，通过形成膜攻击复合体(MAC)由抗体引发所述反应。杀灭机制是通过在靶细胞膜上开孔。20个补体基因或其抑制子的改变与许多自身免疫紊乱相关。补体产物的经修饰的血清水平引起许多组织的水肺、狼疮(SLE)、脉管炎、肾小球性肾炎、肾衰、溶血性贫血、血小板减少和关节炎。它们干扰ADCC(抗体依赖的细胞毒性)的机制，严重损害免疫能力并降低吞噬细胞的能力。补体基因的变异抹也可以提示I型糖尿病，诸如杆状体肌病(Nemalinemyopathy)的脑膜炎神经性紊乱，新生儿肌张力减退，诸如先天性肌病的肌肉紊乱以及其他疾病。衍生于本发明多重启动子盒的RNAi因子在治疗具有多基因耙目标的常染色体显性疾病，例如狼瘙中特别有效。适用本发明方法的其他综合的遗传疾病包括，但不限于骨质疏水>症、结肠癌和青光眼。这些疾病与多个基因中的变异相关，因而同时有效耙向多个多态性将导致致病的多个等位基因的表达减少。细胞色素呼吸链是所有需氧细胞都必需的关键的生化途径。在该链中包括有五个不同的细胞色素。这些色素是亚铁血红素结合蛋白，并作为电子载体。这些基因的改变可以提示共济失调、痴呆、肌病或肌肉中的神经性改变。本发明的RNAi因子可以用于减少引起疾病的等位基因变异林的表达，同时使正常的等位基因的表达不受影响。马区动蛋白(kinesin)驱动蛋白是微管分子马达，其发挥在细胞内运输细胞器以及在细胞分化中沿微管移动染色体的功能。这些基因的改变可以提示诸如脑匹克病(Pickdisease)、结节性)哽化症的神经性紊乱。G蛋白偶联受体G蛋白偶联受体(也称为R7G)是激素、神经传递素、气味和光的受体的扩展组，其通过与结合鸟噤呤核苷(G)的蛋白相互作用传导细胞外信号。编码G偶联蛋白的基因的改变可涉及和提示大量的生理学状况。其包括血压调节、肾功能障碍、男性不育、多巴胺相关感知(dopamineassociatedcognitive)、情感，以及内分泌功能、高4丐血、软骨发育异常和骨质疏松症、假曱状旁腺机能减退、生长延迟和侏儒症。在本发明的一个方面，RNAi因子可以影响与常染色体显性的多嚢肾病(ADPKD)相关的变异基因的表达。该疾病是遗传性肾病中最为常见的，仅在美国就超过600,000例。该疾病以肾功能不全导致肾移植为特征。对ADPKD的主要基因，l型多嚢肾病基因(PKD1)中的变异筛选经常是不完全的，因为在染色体16也存在有该基因的多个同源拷贝。在对与PKD1连锁的16个家系的研究中通过单体型分析已发现变异与ADPKD呈共分离。在这些变异中，六个是插入/删除，五个是无义突变，五个是^"义突变。在PKD2连锁的家系中，发现了错义突变R322Q。本发明的RNAi因子可以特异降低导致多嚢肾病的变异基因的表达。本发明的RNAi因子可以靶向同一基因的多个多态性，所述基因提供选择性抑制变异等位基因的多个位点。在本发明的另一方面，多重RNAi因子构建体可以影响与常染色体显性疾病肌张力障碍相关的变异基因的表达。肌张力障碍是以不自主的肌肉收缩为特征的神经性运动紊乱，其强迫身体的特定部位进入反常的，有时是痛苦的运动或姿势。肌张力障碍可以影响包括臂、腿、躯干、颈、眼睑、面部或声带的身体的任何部分。肌张力障碍可以由编码一种ATP结合蛋白，torsinA的DYTl基因变异引起。本发明的肌张力障碍是单基因/单突变疾病的例子，本发明的多重启动子盒可以用于靶向torsinA基因中的等位基因的特异性SNPs。这些SNPs不是必然带来疾病的表型，仅是与疾病基因型相关联，因而为本发明的RNAi因子提供了靶目标。表1-使用ddRNAi可以被靶向的示范性的SNT序列<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>与本发明结合使用的其他因子对于本领域技术人员来说是显而易见的。实施例在名为"同时递送RNAi因子的多重启动子表达盒"，发明人为PetrusW.Roelvink,DavidA.Suhy，牙口AlexanderKolykhalov的美国专利申请第11/072,592号中记述了描述多重RNA盒的方法和实施例，通过引用将其并入本文。实施例1:用于基因表达增效控制的shRNA三启动子构建体的检为了观察被靶向到单基因的多重RNA构建体的效果，用下列启动子产生图3C所示出类型的三启动子盒；位置A的U6-9,位置B的U6-1，和位置C的U6-8。启动子驱动靶向^r测基因中不同位置的shRNA序列的转录。制造单和双启动子/shRNA构建体以测量耙向单基因的一种或两种shRNA因子的效果。单、双或三RNAi构建体与含有靶基因所有三个区的荧光素酶靶向基因报导子质粒共转染。在共转染进入Huh7细胞72小时后检测荧光素酶的活性。对靶目标的一个区具有特异性的shRNA显示对含有该基因该区的荧光素酶报导质粒具有适当的抑制性活性。当表达对不包含在报导质粒中的耙基因的区具有特异性的单或多shRNA时，没有观察到非特异性抑制。由于更多的靶向该基因不同区域的shRNA被加至表达盒，靶基因的表达被降低。通过引用将本文所引用的所有的出版物、专利和专利申请都并入本文。尽管在上文的说明书中，结合特定的优选实施例对本发明进行了描述，并且举出许多详细资料以用于阐述，对本领域技术人员显而易见的是，本发明可以有其他实施方案，并且从本发明的基本原则出发，可以相当大地改变本文所描述的特定细节。权利要求1.一种影响受试对象或细胞培养物中一种或多种基因的基因表达的方法，所述方法包括将含有至少一种ddRNAi表达盒的遗传构建体用药于所述受试对象或细胞培养物，所述表达盒编码含有一个、两个或更多个RNAi核苷酸序列的RNA分子，所述RNAi核苷酸序列单独地与含有一个或多个单核苷酸遗传靶目标或其衍生物、直系同源物或同源物的核苷酸序列的至少一部分具有至少90％的一致性，并且所述RNAi核苷酸序列延迟、抑制或以其他方式降低受试对象或细胞培养物中杂合配对的一个或多个单核苷酸遗传靶目标的表达，同时不影响杂合配对的另一等位基因的表达。2.—种遗传修饰的细胞，所述细胞包括至少一个ddRNAi表达盒，所述表达盒编码含有一个、两个或更多个RNAi核苷酸序列的RNA分子，所述RNAi核苷酸序列单个地与含有一个或多个单核苷酸遗传靶目标或其衍生物、直系同源物或同源物的核苷酸序列的至少一部分具有至少90%的一致性，并且所述RNAi核苷酸序列延迟、抑制或以其他方式降低受试对象或细胞培养物中杂合配对的一个或多个单核苷酸遗传靶目标的表达，同时不影响杂合配对的另一等位基因的表达。全文摘要本发明提供适宜于在体外或体内表达抗相关细胞、组织或器官内的一等位基因或多等位基因的y-x多重RNAi因子的组合物和方法，以治疗疾病。文档编号C07H21/04GK101228176SQ200680022921公开日2008年7月23日申请日期2006年4月28日优先权日2005年4月28日发明者伊丽莎白·埃弗茨,莎拉·J.·布拉希尔斯申请人:贝尼泰克有限公司