专利名称：一种采用络合共保护制备s-保护谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用络合共保护制备S-保护谷胱甘肽(1 )的方法。
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其中R基团表示是对L-半胱氨酸巯基的保护基团，可以是甲基、节基、对甲基节 基、二苯甲基、三苯甲基、叔丁基、乙酰胺甲基、三甲基乙酰胺甲基、芴甲基等。
背景技术：
谷胱甘肽是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，是属于含有巯基的、 小分子肽类物质，具有抗氧化作用和解毒作用，在医药领域中的广泛应用早已得到公认。
已报道有多种谷胱甘肽的化学合成方法，DouglasKT有相应的综述(Glutathione: Chemical, BiochemicaUnd Medical Aspects ， PartA. Vol. 3: 243-279， 1989)，在这些方 法中，均需要对L-谷氨酸的a-羧基和氨基分别进行保护，游离出Y-羧基后，才能进行 接肽反应。接肽结束后，需要将L-谷氨酸oc-羧基和氨基的保护基团脱除，获得最终产 品。在反复保护一脱保护过程中，容易造成肽键断裂、消旋化等现象，从而使得收率降 低、光学纯度降低。
对于L-谷氨酸的a-羧基和氨基迸行共保护的方法也有报道，如Nefkens等采用 L-谷氨酸与三烷基硼反应形成硼噁唑啉酮来共保护a-羧基和氨基(见Tetrahedron, 39(18):2995-2998, 1983); Itoh等采用N-保护L-谷氨酸与多聚甲醛反应形成5-氧噁唑啉 酮来共保护a-羧基和氨基(见Chem.Pharm.Bull.， 17:1679, 1969)。这些方法虽然能够 实现L-谷氨酸的a-羧基和氨基的共保护，但仍然需要消耗大量的反应试剂，且不可回 收。
因此，找到一个能够实现L-谷氨酸的Ct-羧基和氨基共保护并且能重复使用的方法 是化学合成谷胱甘肽的关键。
发明内容
本发明目的是提供一种对L-谷氨酸的a-羧基和氨基络合共保护方法，进而通过游 离Y -羧基与S-保护L-半胱氨酸和甘氨酸顺序接肽，实现谷胱甘肽的化学合成。 本发明的目的是通过下列技术措施实现的
一种采用络合共保护制备S-保护谷胱甘肽的方法，该方法包括下列步骤
(1) L-谷氨酸a-羧基和氨基共保护；
其中反应中所采用的手性助剂为2- (N-节基-L-脯氨酰)氨基-二苯甲酮(2a， n=l， R，=Ph， BPB)、 2- (N-苄基吡咯-2-甲酰)氨基-二苯甲酮(2b, n=2， R，=Ph， BPyB)和 2- (N-苄基-L-脯氨酰)氨基-苯甲醛(2c， n=l， R，=H， BPBa)中的一种。
络合共保护反应中所采用的二价金属离子(M2+)盐为C^+、 Ni2+、 Zn2+、 (:02+等二 价过渡金属离子的盐酸盐、硫酸盐或硝酸盐中的一种。
反应中所采用的碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾中的一种。 (2)络合共保护L-谷氨酸接S-保护L-半胱氨酸；
在DMF中，加入络合共保护L-谷氨酸，采用接肽试剂接上S-保护L-半胱氨酸。此 步无需分离，可直接进行下一步操作。
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这里所采用的S-保护L-半胱氨酸巯基的保护基(R)可以苄基、甲基、对甲基节基、 二苯甲基、三苯甲基、叔丁基、乙酰胺甲基、三甲基乙酰胺甲基、芴甲基等保护基团中 的一种。所用的接肽试剂可以是DCC/HOBt、 DCC/H0Su、 DCC/H0At中的一种。每组
接肽试剂中两个物质的摩尔比通常保持l: 1。 (3)络合共保护谷胱二肽接甘氨酸；
前一步反应产物采用接肽试剂接上甘氨酸，完成三肽的合成。反应物倒入水中，析 出固体，过滤后即可得到络合共保护S-保护谷胱甘肽。 (4)络合共保护S-保护谷胱甘肽复合物水解；
将络合共保护S-保护谷胱甘肽溶于甲醇中，溶液缓慢滴加到酸中进行水解。过滤得
手性助剂，可回收重复使用。滤液蒸除溶剂，得s-保护谷胱甘肽和二价金属离子混合物。 在此步骤中所使用的酸可以是盐酸、硫酸或硫酸和盐酸混合溶液中的一种。酸的摩
尔浓度可以为3mol/L。
(5)谷胱甘肽与二价金属离子交换分离；
将S-保护谷胱甘肽复合物水解液转至已处理好的阳离子交换树脂柱内，采用氨水洗 脱，将S-保护谷胱甘肽与二价金属离子分离。将收集液冻干，得S-保护谷胱甘肽。洗脱 二价金属离子，回收使用。
本发明的有益效果
本发明的络合共保护方法制备S-保护谷胱甘肽与其他化学合成方法相比有如下优点
1、 采用络合共保护方法减少了对L-谷氨酸中的a-氨基和羧基的保护与脱保护过程，
后续接肽过程中无需氨基和羧基保护，避免了接肽反应过程中反复的保护与脱保护步 骤，操作简单。
2、 在去除络合共保护后，可高收率回收络合助剂。同时通过离子交换分离出二价 金属离子，回收重复使用。除去必要的接肽试剂，几乎不消耗其它试剂，具有较好的原 子经济性。
具体实施例方式
以下实施例主要是为了更好的理解本发明，而不能被视为对本发明范围的限制。 实施例l: BPB-Ni-Glu配合物的合成
2- (N-节基-L-脯氨酰)氨基-二苯甲酮(2a, n=l， R，=Ph, BPB ， 0.005mol)、 NiCl2'6H2O(0.01mol)、 Glu(0.025mol)和甲醇18mL混合，搅拌，加热至40-50。C。 一次加 入氢氧化钾水溶液(0.08mo1),反应2小时，冷却至室温，将上述混合物倒入200毫升水 中，静置过夜，有大量晶体析出。过滤，晶体用水洗涤两次。真空干燥，得红色晶体 BPB-Ni-Glu络合物(3a， n=l， R，=Ph， M2+=Ni2+) 2.76g，相对于BPB的摩尔产率为 97 %。
实施例2: BPyB-Ni-Glu配合物的合成
反应过程与条件同实施例1，采用2-(N-苄基吡咯-2-甲酰)氨基-二苯甲酮(2b， n=2， R，-Ph， BPyB)与、NiCl2'6H20、 Glu反应，得红色晶体BPyB-Ni-Glu络合物(3b， n=2， R，=Ph， M2+=Ni2+) 2.67g，相对于BPyB的摩尔产率为92%。
实施例3: BPBa-Cu-Glu配合物的合成
反应过程与条件同实施例1，采用2- (N-苄基-L-脯氨酰)氨基-苯甲醛(2c, n=l， R>H， BPBa)与、CuS04.6H20、 Glu反应,得黄色固体BPBa-Cu-Glu络合物(3c, n=l, R，-Ph， M2+=Cu2+) 2.29g,相对于BPBa的摩尔产率为92%。
实施例4: BPB-Ni- (S-苄基)谷胱二肽的合成
BPB-Ni-Glu(3a， 0.005mol)力口入20mL DMF，室温搅拌溶解，加入DCC(0.005mo1，) 和HOBt(0.005mo1)，反应2小时，过滤除去DCU，取滤液，即为络合共保护L-谷氨酸 活化酯溶液。
S-节基L-半胱氨酸(0.005mol)溶于20mL DMF，缓慢滴加至上述络合共保护L-谷氨 酸活化酯溶液，反应过夜。过滤，滤液内含BPB-Ni-(S-苄基)谷胱二肽(4a,n-l， R'-Ph， R=PhCH2， M2+=Ni2+)，无需处理进行下一步反应。
实施例5: BPyB-Ni- (S-甲基)谷胱二肽的合成
反应过程与条件同实施例4，采用BPyB-Ni-Glu (3b)和S-甲基L-半胱氨酸进行接 肽反应，得BPyB-Ni- (S-甲基)谷胱二肽(4b， n=2， R，=Ph, R=CH3， M2+二Ni2+)滤液， 无需处理可进行下一步反应。
实施例6: BPBa-Cu- (S-苄基)谷胱二肽的合成
反应过程与条件同实施例4，采用BPBa-Cu-Ghi (3c)和S-苄基L-半胱氨酸进行接 肽反应，得BPyB-Ni- (S-苄基)谷胱二肽(4c,『1, R，=H， R=PhCH2， 1^2+=(:112+)滤液， 无需处理可进行下一步反应。
实施例7: BPB-Ni- (S-苄基)谷胱甘肽的合成
实施例4中的滤液(4a)搅拌，加入DCC(0.005mol)和HOBt(0.005mo1)，反应2小时， 过滤除去DCU，取滤液，即为络合共保护S-苄基L-谷氨酰L-半胱氨酸活化酯溶液。
甘氨酸(0.005mol)溶于20mLDMF，缓慢滴加至上述络合共保护S-苄基L-谷氨酰L-半胱氨酸活化酯溶液中，反应过夜。过滤，滤液倒入100mL水中，析出固体，过滤， 得到BPB-Ni- (S-苄基)谷胱甘肽3.19g(5a，，n爿，R，=Ph, R=PhCH2, M2+=Ni2+)，相对 于BPB-Ni-Glu的摩尔产率为78%。
实施例8: BPyB-Ni- (S-甲基)谷胱甘肽的合成
反应过程与条件同实施例7，采用(4b)与甘氨酸进行接肽反应，得到BPB-Ni- (S-甲基)谷胱甘肽2.79g(5b, n=2， R，=Ph， R=CH3, M2+=Ni2+)，相对于BPyB-Ni-Glu(2b) 的摩尔产率为65%。
实施例9: BPB-Ni- (S-苄基)谷胱甘肽的水解
将实施例7中制备的BPB-Ni- (S-苄基)谷胱甘肽(5a)溶于20 mL甲醇中，缓慢滴
加到3 mol/L的盐酸溶液中，6(TC搅拌水解。反应结束后，过滤得固体，为手性助剂BPB 1.31g(2a，收率90%)，回收重复使用。滤液蒸除溶剂，得S-苄基谷胱甘肽(la， R=PhCH2) 和镍离子混合物。
实施例10: BPyB-Ni- (S-甲基)谷胱甘肽的水解
反应过程与条件同实施例9，采用BPB-Ni- (S-甲基)谷胱甘肽进行水解，得到S-甲基谷胱甘肽(3b， R=CH3)和镍离子混合物，回收手性助剂BPyB 1.31g (lb，收率 90%)。
实施例ll: S-苄基谷胱甘肽与镍离子交换分离
将实施例9中得到的S-苄基谷胱甘肽和镍离子混合物溶于20mL水中，转至已处理 好的H型731阳离子交换树脂柱内，树脂量为水解液体积的10-15倍左右。用质量浓度 为8。/。的氨水淋洗，至S-苄基谷胱甘肽完全洗出。将收集液冻干,得S-苄基谷胱甘肽1.24g (la， R=PhCH2，收率90%)。残留在阳离子交换树脂上的镍离子用酸洗脱，回收使用。
权利要求
1、采用络合共保护制备S-保护谷胱甘肽的方法，该方法包括下列步骤(1).采用手性助剂、二价金属离子盐和L-谷氨酸在碱性溶液中形成络合物，实现L-谷氨酸α-羧基和氨基共保护；(2).络合共保护L-谷氨酸通过接肽试剂接上S-保护L-半胱氨酸，形成络合共保护S-保护谷胱二肽；(3).络合共保护S-保护谷胱二肽通过接肽试剂接上甘氨酸，形成络合共保护S-保护谷胱甘肽；(4).络合共保护S-保护谷胱甘肽在酸溶液中水解，得到手性助剂沉淀和S-保护谷胱甘肽与二价金属离子的混合溶液；(5).通过阳离子交换树脂分离S-保护谷胱甘肽与二价金属离子。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所采用的手性助剂为2-(N-苄基-L-脯氨酰)氨基-二苯甲蹈、2- (N-节基吡咯-2-甲酰)氨基-二苯甲酮或2- (N-苄基-L-脯氨酰)氮基-苯甲醛中的一种。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所采用的共保护二价金属 离子盐为Ci^+、 Ni2+、 Zn2+、 C户的硫酸盐、盐酸盐或硝酸盐中的一种。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所采用的碱是氢氧化钠、 氢氧化钾中的一种。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中S-保护L-半胱氨酸巯基 的保护基是苄基、甲基、对甲基苄基、二苯甲基、三苯甲基、叔丁基、乙酰胺甲基、三 甲基乙酰胺甲基、芴甲基中的一种。
6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)、 (3)中所采用的接肽试剂 是DCC/HOBt、 DCC/HOSu、 DCGHOAt中的一种。
7、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所使用的酸是盐酸、硫酸 或硫酸和盐酸混合溶液中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种采用络合共保护制备S-保护谷胱甘肽的方法。该方法包括下列步骤采用手性助剂、二价金属离子盐和L-谷氨酸在碱性甲醇溶液中形成络合物，实现L-谷氨酸α-羧基和氨基共保护；络合共保护L-谷氨酸通过接肽试剂接上S-保护L-半胱氨酸，形成络合共保护S-保护谷胱二肽；络合共保护S-保护谷胱二肽通过接肽试剂接上甘氨酸，形成络合共保护S-保护谷胱甘肽；络合共保护S-保护谷胱甘肽在稀酸溶液中水解，得到手性助剂沉淀和S-保护谷胱甘肽与二价金属离子的混合溶液；通过阳离子交换树脂分离S-保护谷胱甘肽与二价金属离子。本发明操作简单，收率高，生产成本低，便于工业化应用。
文档编号C07K5/00GK101108876SQ200710024589
公开日2008年1月23日 申请日期2007年6月25日 优先权日2007年6月25日
发明者叶玲娅, 周佳栋, 张小龙, 飞 曹, 李振江, 萍 韦 申请人:南京工业大学