专利名称：吸附树脂法从苦荞植物全株提取高纯度黄酮化合物的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及高选择性吸附树脂的合成及其在天然产物有效成分提取纯化中的应用技术领域。
背景技术：
苦荞即苦荞麦，国外称鞑靼荞麦(tartary buckwheat)，是我国特有的一种荞麦，主要分布于我国西南地区的高寒地带。荞麦属于双子叶蓼科作物，荞麦富含高生物价的蛋白质、维生素、矿物质等，且茎、叶、花、果实等均含有丰富的芦丁等黄酮类化合物，尤其是苦荞中黄酮含量极为丰富(徐宝才，丁霄霖，苦荞黄酮的测定方法[J]，无锡轻工大学学报，2003，22(2)98-101)。研究表明，苦荞黄酮具有较强的生物活性，毒理学实验证明其为无毒、无副作用的物质，因此苦荞是传统的药食同源的天然植物。随着分子生物学研究手段的不断深入，对于苦荞黄酮药效学的研究取得了显著的成果，实验证明对于实验性高血脂血症大鼠的血脂和肝指数有明显的降低作用，可大大提高血液的抗氧化能力，减轻高脂饮食导致的氧化损伤(童红莉，田亚平，汪德清等，苦荞壳提取物对大鼠血脂的调节作用[J]，第四军医大学学报，2006，27(2)120-122)，对于实验性高血糖小鼠血糖有明显降低作用，对其耐糖量也有明显改善作用(祁学忠，吉锁兴，王晓燕等，苦荞黄酮及其降血糖作用的研究[J]，科技情报开发与经济，2003，13(8)111-112)。正是由于苦荞黄酮显著的降血糖、降血脂、抗疲劳、增强免疫功能，使得在医药、化妆品、保健品方面具有广阔的应用前景。
目前关于苦荞黄酮的提取方法大致分为传统方法和现代方法，传统方法仍以简单的溶剂浸提为主，黄酮提取效率和提取纯度均较低，这就极大的浪费了原料，只能制备低纯度的粗提物，无法在药用研究中发挥更大的作用，同时由于提取时消耗大量有机溶剂，生产成本较高，对环境的污染较大([1]李裕，刘有智，霍红，苦荞麦中提取芦丁的工艺研究[J]，华北工学院学报，2002，23(2)130-132。[2]刘本国，朱永义，苦荞中生物类黄酮提取工艺的研究[J]，粮食与饲料工业，2004，423-25)。为了减少有机溶剂的消耗，也有用水作为浸提剂提取苦荞黄酮的研究报道(肖诗明，张忠，李勇等，苦荞麦麸皮中黄酮的提取工艺条件研究[J]，食品科学，2006，27(1)156-158)，但是水作为浸提剂，常常将苦荞中水溶性物质也提取出来，如纤维素、多糖等，造成提取物易吸湿，且黄酮含量较低，只有10％左右(周瑞雪，阎志惠，刘恩荔等，苦荞黄酮类化合物的提取工艺[J]，中药材，2006，29(8)849-850)。苦荞黄酮现代提取方法主要有微波提取(王军，王敏，李小艳，微波提取苦荞麦麸皮总黄酮工艺研究[J]，天然产物研究与开发，2006，18655-658)和超声提取(季春燕，周乐，王欣等，正交设计优选苦荞黄酮成分的超声提取工艺[J]，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2005，33(5)105-107)，与传统提取方法相比，这些方法大大提高了提取效率，但是仍然存在着设备投资昂贵、噪声污染较大、难于大规模工业化生产的缺陷，同时提取物中黄酮的纯度仍然较低。
近年来，在天然产物有效成分的现代提取分离方法中，吸附树脂法收到了人们越来越多的关注，吸附分离技术是70年代发展起来的一项新技术，应用于中草药有效成分的提取分离已有近20年，实践证明，它具有吸附选择性高、再生简便、能循环使用、生产成本低等优点，在黄酮类化合物的提取纯化中得到了广泛的应用，例如用弱极性AB-8树脂对苦参黄酮、银杏黄酮进行吸附分离取得了良好的效果([1]高红宁，金万勤，郭立伟等，AB-8树脂对苦参总黄酮的吸附性能研究[J]，中草药，2001，32(10)588-590；[2]麻秀萍，蒋朝晖，杨玉琴等，大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附研究[J]，中国中药杂志，1997，22(9)539-554)。但是到目前为止还未见吸附树脂法提取苦荞黄酮，特别是高纯度苦荞黄酮的报道，这主要是因为现有的商品化树脂主要以聚苯乙烯为骨架，吸附作用力仍为广谱性的疏水作用力，因此树脂的吸附选择性较差，难以用于制备高纯度提取物。另外虽然苦荞植物全株的不同部位均含有丰富的黄酮类化合物，但是目前多集中于从苦荞种子(苦荞麦粒)或其种皮中提取苦荞黄酮，对于生物量更大的苦荞茎叶只作为废物丢弃，未见提取的研究报道，这必然造成资源的极大浪费，制约了无废物苦荞的开发研究。
发明内容本发明目地是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种高选择性氢键吸附树脂的制备方法，根据苦荞黄酮分子结构的特征，在树脂上引入特殊功能基团，将疏水、氢键等多种弱相互作用的协同效应引入树脂吸附过程，并首次将其用于从苦荞种子、茎叶中提取高纯度黄酮类化合物。
通过对苦荞黄酮分子结构的特点研究，发现它含有酚羟基结构，是形成氢键的典型基团(其分子结构如式1所示)，所以我们设计合成了一类高选择性吸附树脂，在其骨架结构上有目的的引入能与酚羟基形成氢键的特殊功能基团，大大提高了树脂对黄酮的吸附选择性，将其用于从苦荞植物全株的不同部位，如种子和茎叶中提取苦荞黄酮，建立了树脂法提取工艺。
R＝C12H21O9式1苦荞黄酮分子结构本发明提供的吸附树脂法从苦荞植物全株提取高纯度黄酮化合物的工艺方法，通过以下步骤实现1)将市售的苦荞种子、茎叶或二者的原料粉碎，用70％乙醇水溶液60℃回流提取2小时，共提取三次，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇后，加水稀释(溶液体积(ml)与原料质量(g)比为10/1-30/1)，过滤，得澄清水溶液，为吸附上柱液；其中，苦荞种子的黄酮含量高于4％，茎叶的黄酮含量高于1％；2)将吸附上柱液通入装有氢键吸附树脂的树脂柱中吸附，吸附柱的径长比为1/5-1/20，吸附流速为1.0-3.0BV/小时；3)吸附完成后，用水将树脂清洗干净，60-80％乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为0.5-1.0BV/小时，收集解吸液；4)解吸液经减压蒸馏回收乙醇、浓缩、真空干燥，得到淡黄绿色苦荞黄酮提取物。
上述方法2)步中使用的氢键吸附树脂通过以下步骤制备而成1)初始聚苯乙烯共聚物白球的制备在常温下，将明胶或聚乙烯醇溶解于水中，配成浓度0.5-1.0％的水溶液，为反应的水相，于三口瓶中水浴加热至30～50℃；以二乙烯苯和苯乙烯为聚和反应的混合单体(其中二乙烯苯占混合单体总质量的6-20％)、以混合单体总质量80-150％的长链烷烃作致孔剂、以混合单体总量0.5-1.0％的偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰为引发剂，将上述混合单体、致孔剂、引发剂充分混匀，配成反应的油相，将油相加入水相中，其中油相与水相体积比为1∶3；经悬浮聚合，升温至60～80℃反应2～6小时以上，再升温至90℃反应3小时以上，经过滤、洗涤处理后，制备出聚苯乙烯型大孔吸附树脂，简称白球；2)白球的氯甲基化常温下在三口瓶中加入白球，以氯甲醚和二氯乙烷的混合溶液充分溶胀，混合溶液用量为白球质量的5-8倍，氯甲醚和二氯乙烷的体积比为1∶2；加入ZnCl2作催化剂，用量为白球质量的40-60％，充分混匀，然后升温到30-40℃，反应8-12小时，取样测定氯含量高于18-20％后停止反应，经过滤、洗涤处理后，制备出氯甲基化的聚苯乙烯树脂，简称氯球；3)氯球的胺化常温下在三口瓶中加入氯球，以N，N-二甲基甲酰胺或二氯乙烷为溶剂充分溶胀，用量为氯球质量的2-4倍，加入氯球质量50％的脂肪胺(甲胺、二甲胺、乙胺、或二乙胺)，以5％氢氧化钠水溶液调节体系pH值为9-10，加热至50-60℃，反应6-8小时，取样测定残余的氯含量，低于0.3mmol/g干树脂，同时测定胺交换量高于4mmol/g干树脂时停止反应，经过滤、洗涤处理后制备出胺化的聚苯乙烯树脂，简称胺球；4)胺球的酰胺化常温下在三口瓶中加入胺球，以乙酸酐或酰氯为溶剂和反应试剂充分溶胀，用量为胺球质量的2-4倍，升温至40-60℃，反应6-8小时，取样测定胺交换量低于0.2mmol/g干树脂时停止反应，经过滤、洗涤处理后制备出所需的氢键吸附树脂。
氢键吸附树脂外观特征和结构参数为外观为球形，浅黄色，粒径0.3-1.0mm，比表面积为120-600m2/g干树脂，含水量为60-80％，平均孔径为10-30nm，孔隙率50-65％。
本发明的优点和积极效果本发明合成了一种高选择性氢键吸附树脂，利用氢键作用和疏水作用的协同效应，可高选择性的提取苦荞中的黄酮类有效成分，仅通过“吸附—洗脱”一步简单工艺，即可得到高纯度苦荞黄酮提取物，避免现有提取工艺中使用大量易挥发、易燃的有机溶剂、分离工艺烦琐、生产成本高、提取效率低、制备的提取物纯度低的缺点，本发明仅经“吸附—脱附”一个工艺流程，操作简单、环境友好、树脂可再生使用、生产成本低，适于大规模工业化生产，制备的苦荞黄酮提取物质量稳定、色泽好、纯度高于90％。以苦荞种子为原料计，总产率高于4％，以苦荞茎叶为原料计，总产率高于1％。本发明的工业化应用可为苦荞进一步的药用开发提供大量高纯度的试验样品。
具体实施方式
实施例1在常温下，将聚乙烯醇溶解于水中，配成浓度1.0％的水溶液450ml，于1000ml三口瓶中水浴加热至45℃；以58g苯乙烯、12g二乙烯苯的混合物为反应单体、以56g甲苯和28g液蜡混合物作致孔剂、以0.7g偶氮二异丁腈为引发剂混合均匀后加入三口瓶中，开动搅拌，调节油珠大小适宜，经悬浮聚合，缓慢升温至80℃反应6小时，再缓慢升温至90℃反应3小时后停止反应，经过滤、洗涤处理后，制备出聚苯乙烯型大孔吸附树脂，简称白球。
常温下在1000ml三口瓶中加入100g白球，以200ml氯甲醚和400ml二氯乙烷的混合溶液充分溶胀后，加入60g无水ZnCl2作催化剂，充分混匀，然后升温到30-40℃，反应10小时，取样测定氯含量为5.49mmol/g干树脂，停止反应，经过滤、洗涤处理后，制备出氯甲基化的聚苯乙烯树脂，简称氯球。
常温下在500ml三口瓶中加入100g氯球，以250ml N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，充分溶胀，加入50g甲胺，以5％氢氧化钠水溶液调节体系pH值为9.5，加热至50℃，反应6小时，取样测定残余的氯含量为0.25mmol/g干树脂，同时测定胺交换量为4.13mmol/g干树脂，停止反应，经过滤、洗涤处理后制备出胺化的聚苯乙烯树脂，简称胺球。
常温下在500ml三口瓶中加入100g胺球，以200ml乙酸酐为溶剂和反应试剂，充分溶胀后，升温至60℃，反应6小时，取样测定胺交换量为0.16mmol/g干树脂，停止反应，经过滤、洗涤处理后制备出所需的氢键吸附树脂。氢键吸附树脂外观特征和结构参数为外观为球形，浅黄色，粒径0.5-0.8mm，比表面积为528m2/g干树脂，含水量为64.7％，平均孔径为21.6nm，孔隙率55.4％。
实施例2
在常温下，将聚乙烯醇溶解于水中，配成浓度0.8％的水溶液4.5升，于10升三口瓶中水浴加热至40℃；以600g苯乙烯、150g二乙烯苯的混合物为反应单体、以750g 200#汽油作致孔剂、以7.0g过氧化苯甲酰为引发剂，混合均匀后加入三口瓶中，开动搅拌，调节油珠大小适宜，经悬浮聚合，缓慢升温至78℃反应6小时以上，再缓慢升温至90℃反应3小时以上，经过滤、洗涤处理后，制备出聚苯乙烯型大孔吸附树脂，简称白球。
常温下在10升三口瓶中加入1Kg白球，以2升氯甲醚和4升二氯乙烷的混合溶液充分溶胀后，加入500g无水ZnCl2作催化剂，充分混匀，然后升温到35℃，反应12小时，取样测定氯含量为5.52mmol/g干树脂，停止反应，经过滤、洗涤处理后，制备出氯甲基化的聚苯乙烯树脂，简称氯球。
常温下在5升三口瓶中加入1Kg氯球，以2.5升N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，充分溶胀，加入500g乙胺，以5％氢氧化钠水溶液调节体系pH值为10.0，加热至60℃，反应8小时，取样测定残余的氯含量为0.21mmol/g干树脂，同时测定胺交换量为4.08mmol/g干树脂，停止反应，经过滤、洗涤处理后制备出胺化的聚苯乙烯树脂，简称胺球。
常温下在5升三口瓶中加入1Kg胺球，以2升乙酸酐为溶剂和反应试剂，充分溶胀后，升温至60℃，反应8小时，取样测定胺交换量为0.18mmol/g干树脂，停止反应，经过滤、洗涤处理后制备出所需的氢键吸附树脂。氢键吸附树脂外观特征和结构参数为外观为球形，浅黄色，粒径0.3-1.0mm，比表面积为538m2/g干树脂，含水量为75.4％，平均孔径为23.6nm，孔隙率59.2％。
实施例2将20克苦荞种子(即苦荞麦粒，黄酮含量为4.7％)研磨成粉，120ml 70％乙醇水溶液60℃提取，共三次，过滤后合并三次提取液，减压蒸馏回收乙醇后，加水稀释至250ml，过滤，得澄清水溶液，为吸附上柱液，将上柱液通过装有上述实施例中制备的氢键吸附树脂的树脂柱(柱内径15mm，柱长250mm，装有30ml湿树脂)，吸附速度为1.0Bv/hr，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用30ml 75％的乙醇解吸，解吸速度为0.5Bv/hr。解吸液经减压浓缩回收乙醇，至回收乙醇体积为25ml时停止减压蒸馏，静置至室温，过滤，滤渣干燥即得浅黄绿色提取物0.83g，产率为4.1％，经过waters484型高效液相色谱仪色谱分析，产品纯度为黄酮含量95.5％。
实施例3将300g苦荞种子(即苦荞麦粒，黄酮含量为4.7％)研磨成粉，1.8L 75％乙醇水溶液60℃提取，共三次，过滤后合并三次提取液，减压蒸馏回收乙醇后，加水稀释至3L，过滤，得澄清水溶液，为吸附上柱液，将上柱液通过装有氢键吸附树脂的树脂柱(柱内径5cm，柱长60cm，装有400ml湿树脂)，吸附速度为1.0Bv/hr，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用400ml 75％的乙醇解吸，解吸速度为0.5Bv/hr。解吸液经减压浓缩回收乙醇，至回收乙醇体积为350ml时停止减压蒸馏，静置至室温，过滤，滤渣干燥即得浅黄绿色提取物13.5g，产率为4.5％，经过waters484型高效液相色谱仪色谱分析，产品纯度为黄酮含量92.1％。
实施例4将500g苦荞种子(即苦荞麦粒，黄酮含量为4.7％)研磨成粉，2.0L 75％乙醇水溶液60℃提取，共三次，过滤后合并三次提取液，减压蒸馏回收乙醇后，加水稀释至5L，过滤，得澄清水溶液，为吸附上柱液，将上柱液通入装有氢键吸附树脂的树脂柱(柱直径5cm，柱长60cm，装有400ml湿树脂)，吸附速度为2.5Bv/hr，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用600ml 75％的乙醇解吸，解吸速度为1.0Bv/hr。解吸液经减压浓缩回收乙醇，至回收乙醇体积为550ml时停止减压蒸馏，静置至室温，过滤，滤渣干燥即得浅黄绿色提取物21.3g，产率为4.3％，经过waters484型高效液相色谱仪色谱分析，产品纯度为黄酮含量94.3％。
实施例5将50克苦荞茎叶粉碎(黄酮含量为1.5％)，300ml 75％的乙醇水溶液60℃提取，共三次，过滤后合并三次提取液，减压蒸馏回收乙醇后，加水稀释至200ml，过滤，得澄清水溶液，为吸附上柱液，将上柱液通入装有氢键吸附树脂的树脂柱(柱直径15mm，柱长250m，装有30ml湿树脂)，吸附速度为1.5Bv/hr，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用30ml 75％的乙醇解吸，解吸速度为0.5Bv/hr。解吸液经减压浓缩回收乙醇，至回收乙醇体积为25ml时停止减压蒸馏，静置至室温，过滤，滤渣干燥即得浅黄绿色提取物0.74g，产率为1.48％，经过waters484型高效液相色谱仪色谱分析，产品纯度为黄酮含量91.5％。
实施例6将1.2kg苦荞茎叶粉碎(黄酮含量为1.5％)，6L 75％乙醇水溶液60℃提取，共三次，过滤后合并三次提取液，减压蒸馏回收乙醇后，加水稀释至5L，过滤，得澄清水溶液，为吸附上柱液，将上柱液通入装有氢键吸附树脂的树脂柱(柱直径5cm，柱长60cm，装有400ml湿树脂)，吸附速度为3.0Bv/hr，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用500ml 75％的乙醇解吸，解吸速度为1.0Bv/hr。解吸液经减压浓缩回收乙醇，至回收乙醇体积为450ml时停止减压蒸馏，静置至室温，过滤，滤渣干燥即得浅黄绿色提取物18.1g，产率为1.51％，经过waters484型高效液相色谱仪色谱分析，产品纯度为黄酮含量90.6％。
权利要求
1.一种吸附树脂法从苦荞植物全株提取高纯度黄酮化合物的工艺方法，其特征是通过以下步骤实现1)将市售的苦荞种子、茎叶或二者的原料粉碎，用70％乙醇水溶液60℃回流提取2小时，共提取三次，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇后，加水稀释，其中溶液体积(ml)与原料质量(g)比为10/1-30/1，过滤，得澄清水溶液，为吸附上柱液；2)将吸附上柱液通过装有氢键吸附树脂的树脂柱中吸附，吸附柱的径长比为1/5-1/20，吸附流速为1.0-3.0BV/小时；3)吸附完成后，用纯水将树脂清洗干净，60-80％乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为0.5-1.0BV/小时，收集解吸液；4)解吸液经减压蒸馏回收乙醇、浓缩、真空干燥，得到淡黄绿色苦荞黄酮提取物。
2.根据权利要求1所述的吸附树脂法从苦荞植物全株提取高纯度黄酮化合物的工艺方法，其特征是以苦荞种子为原料，苦荞黄酮提取物产率高于4％，以茎叶为原料，苦荞黄酮提取物产率高于1％。
3.根据权利要求1所述的吸附树脂法从苦荞植物全株提取高纯度黄酮化合物的工艺方法，其特征是制备的苦荞黄酮提取物中黄酮类混合物纯度高于90％。
4.根据权利要求1所述的吸附树脂法从苦荞植物全株提取高纯度黄酮化合物的工艺方法，其特征是2)步中使用的氢键吸附树脂通过以下步骤制备而成1)初始聚苯乙烯共聚物白球的制备在常温下，将明胶或聚乙烯醇溶解于水中，配成浓度0.5-1.0％的水溶液，为反应的水相，于三口瓶中水浴加热至30～50℃；以二乙烯苯和苯乙烯为聚和反应的混合单体、其中二乙烯苯占混合单体总质量的6-20％，以混合单体总量80-150％的长链烷烃作致孔剂，以混合单体总量0.5-1.0％的偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰为引发剂，将上述混合单体、致孔剂、引发剂充分混匀，配成反应的油相，将油相加入水相中，其中油相与水相体积比为1∶3；经悬浮聚合，升温至60～80℃反应2～6小时以上，再升温至90℃反应3小时以上，经过滤、洗涤处理后，制备出聚苯乙烯型大孔吸附树脂，简称白球；2)白球的氯甲基化常温下在三口瓶中加入白球，以氯甲醚和二氯乙烷的混合溶液充分溶胀，混合溶液用量为白球质量的5-8倍，氯甲醚和二氯乙烷的体积比为1∶2；加入ZnCl2作催化剂，用量为白球质量的40-60％，充分混匀，然后升温到30-40℃，反应8-12小时，取样测定氯含量高于18-20％后停止反应，经过滤、洗涤处理后，制备出氯甲基化的聚苯乙烯树脂，简称氯球；3)氯球的胺化常温下在三口瓶中加入氯球，以N，N-二甲基甲酰胺或二氯乙烷为溶剂充分溶胀，用量为氯球质量的2-4倍，加入氯球质量50％的脂肪胺，以5％氢氧化钠水溶液调节体系pH值为9-10，加热至50-60℃，反应6-8小时，取样测定残余的氯含量，低于0.3mmol/g干树脂，同时测定胺交换量高于4mmol/g干树脂时停止反应，经过滤、洗涤处理后制备出胺化的聚苯乙烯树脂，简称胺球；4)胺球的酰胺化常温下在三口瓶中加入胺球，以乙酸酐或酰氯为溶剂和反应试剂充分溶胀，用量为胺球质量的2-4倍，升温至40-60℃，反应6-8小时，取样测定胺交换量低于0.2mmol/g干树脂时停止反应，经过滤、洗涤处理后制备出所需的氢键吸附树脂。
5.根据权利要求4所述的吸附树脂法从苦荞植物全株提取高纯度黄酮化合物的工艺方法，其特征是氯球的胺化中加入的脂肪胺为甲胺、二甲胺、乙胺、或二乙胺。
6.根据权利要求4或5所述的吸附树脂法从苦荞植物全株提取高纯度黄酮化合物的工艺方法，其特征是氢键吸附树脂外观特征和结构参数为外观为球形，浅黄色，粒径0.3-1.0mm，比表面积为120-600m2/g干树脂，含水量为60-80％，平均孔径为10-30nm，孔隙率50-65％。
全文摘要
吸附树脂法从苦荞植物全株提取高纯度黄酮化合物的工艺。本发明合成了新型氢键吸附树脂，利用氢键和疏水作用的协同效应，仅通过“吸附—洗脱”一步工艺，即可制备高纯度苦荞黄酮提取物。步骤为分别以苦荞种子、茎叶为原料，粉碎后乙醇回流提取，提取液浓缩回收乙醇后，用水稀释，过滤，得澄清溶液为吸附上柱液，将其通过装有氢键吸附树脂的树脂柱，吸附完成后用乙醇解吸，收集解吸液，经减压蒸馏回收乙醇、浓缩、真空干燥，得淡黄绿色苦荞黄酮提取物。本发明操作简单、环境友好、树脂可再生使用、生产成本低，适于大规模工业化生产，制备的提取物中黄酮纯度高于90％。本发明的工业化应用可为苦荞深入的药用开发提供大量高纯度试验样品。
文档编号C07D311/00GK101050227SQ20071005675
公开日2007年10月10日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者王春红, 施荣富, 刘睿, 史作清 申请人:南开大学