具有改变的根构造的植物、涉及编码exostosin家族多肽及其同源物的基因的相关的构建...的制作方法

专利名称：具有改变的根构造的植物、涉及编码exostosin家族多肽及其同源物的基因的相关的构建 ...的制作方法
技术领域：
本发明领域涉及植物育种和遗传学，并且具体地讲涉及用于改变植物根构造的重组DNA构建体。
背景技术：
在所有(除了非常少的几个之外)自然生态系统中，水和营养物质的可用性限制 了植物生长。它们在大多数农业生态系统中限制产量。植物根部起到重要作用，如水和营 养物质摄取、在土壤中固定植物以及在根围建立生物相互作用。因此阐明植物根发育和功 能的基因调控是农学和生态学中相当受关注的课题。根系发源于在胚胎形成期间发育的初生根。初生根产生次生根，次生根继而产生 三生根。所有次生、三生、四生以及更进一步分生的根均被称为侧根。包括玉米在内的许多 植物也可从连续的地下节位(冠根)或地上节位(支柱根)处产生不定根。有三个主要 过程影响根系的总体构造。第一个是在初生根分裂组织中的细胞分裂过程，该过程通过加 入新生细胞到根中使得根不定生长。第二个是侧根形成过程，该过程增加根系的探索能力。 第三个是根毛形成过程，该过程增加初生根和侧根的总表面(Lopez-Bucio等人，Current Opinion in Plant Biology (2003)6 =280-287) 在已经分离出的玉米突变体中仅仅缺少 根型的一个亚型。已经鉴定了拟南芥属的根形态基因突变体如SH0RTR00T和SCARECROW， 它显示初生根和侧根的发育缺陷(J. E. Malamy, Plant, Cell and Environment (2005) 28 67-77)。已经鉴定了许多特异性影响根发育的玉米突变体(Hochhol dinger等人，2004， Annals of Botany 93:359-368)。隐性突变体rtcs和rtl不形成或形成较少的冠根和支 柱根，然而初生根和侧根不受影响。在隐性突变体des 21中，缺失侧生种子根和根毛。隐性 突变体rthl-3缺失根毛。突变体Irtl和ruml在侧根开始产生之前受影响，而突变体slrl 和slr2的侧根伸长能力受到削弱。决定根系构造的内源响应途径包括激素、细胞循环调节 子和调节基因。水分胁迫和营养物质可用性属于决定根系构造的环境响应途径。提交于2005年2月14日的美国专利申请2005-57473 (美国专利公开公布 2005/223429A1，公布于2005年10月6日)涉及使用拟南芥属细胞分裂素氧化酶基因改变 植物中的细胞分裂素含量并刺激根生长。美国专利公开6，344，601 (公布于2002年2月5日)涉及在植物细胞中低表达或 超表达肌动蛋白抑制蛋白(profilin)以改变植物生长习性，例如减少根系或根毛系统会 使花期推迟。W02004/US16432(提交于 2004 年 5 月 21 日(W02004/106531，公布于 2004 年 12 月 9日)涉及使用超表达顺式_异戊烯转移酶的方法操纵生长速率和/或产量和/或构造。提交于2004年9月30日的美国专利申请2004/489500 (美国专利公开公布 2005/059154A1，公布于2005年3月13日)涉及使用在植物中超表达转录因子E2F的方法
改变细胞数量、构造和产量。
可利用激活标记来鉴定能影响性状的基因。已经在模型植物拟南芥属中使用该方法(Weigel 等人，2000，Plant Physiol. 122 :1003_1013)。插入转录增强子元件能够显著激活和/或提高附近内源基因的表达。

发明内容
本发明包括在一个实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST 样多肽的核酸序列或所述核酸序列的全长互补序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15或31比较时具有至少80 %的序列同一性，或在与SEQ ID NO 25比较时具有至少95%的序列同一性。在第二实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST 样多肽的核酸序列或所述核酸序列的全长互补序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15或31比较时具有至少85%的序列同一性。在第三实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST 样多肽的核酸序列或所述核酸序列的全长互补序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15或31比较时具有至少90%的序列同一性。在第四实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST 样多肽的核酸序列或所述核酸序列的全长互补序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15或31比较时具有至少95%的序列同一性。在第五实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST 样多肽的核酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ IDN0:15、25、或31。在第六实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST 样多肽的核酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID N0:14、24、或30。在另一个实施方案中，包含任何前述多核苷酸的载体和重组构建体，以及包含所 述重组构建体的细胞。在另一个实施方案中，用任一前述多核苷酸来转化细胞的方法，以及用于生产和 再生包含任一前述多核苷酸的转化植物的方法。 在另一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构建体 包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽 的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构 建体的对照植物进行比较时表现出改变的根构造。在另一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构建体 包含(a)可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所 述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、 31、或34进行比较时具有至少50 %的序列同一性，或(b)抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件 可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 ClustalV 比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行 比较时具有至少50%的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列； 或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来 源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于ClustalV比对方法，所述区域的核酸序列 具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽，并且 其中在与未包含所述重组构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的 改变。
在另一个实施方案中，改变植物根构造的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体 引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多 核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50%的序列同一性； 以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其 基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出改 变的根构造；以及任选地，(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其 基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出改 变的根构造。在另一个实施方案中，评价植物根构造的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体 引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多 核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50%的序列同一性， (b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因 组中包含该重组DNA构建体；以及(c)评价与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时 该转基因植物的根构造；以及任选地，(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代 植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及任选地，(e)评价与未包含该重组DNA构建 体的对照植物比较时该子代植物的根构造。在另一个实施方案中，评价植物根构造的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体 引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多 核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50%的序列同一性， (b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因 组中包含该重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其 基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)评价与未包含该重组DNA构建体的对照植物比 较时该子代植物的根构造。在另一个实施方案中，测定植物农学特性改变的方法，该方法包括(a)将重组DNA 构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序 列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法 在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50%的序列同 一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其 基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)测定该转基因植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变；以及任选地，(d)获得源自该 转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及任选 地，(e)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少 一种农学特性的改变。在另一个实施方案中，测定植物农学特性改变的方法，该方法包括(a)将 重组DNA 构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序 列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法 在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50%的序列同 一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其 基因组中包含该重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物 在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构 建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。在另一个实施方案中，测定植物农学特征改变的方法，该方法包括 (a)将抑制DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少 一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分㈧编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于 Clustal V 比对方法在与 SEQ IDNO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具 有至少50%的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域 所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核 酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多 肽；(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)测定该转基因植物在与未包含该抑制 DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变；以及(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含 该抑制DNA构建体；以及任选地，(e)测定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照 植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。在另一个实施方案中，测定植物农学特征改变的方法，该方法包括(a)将抑制DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少 一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分㈧编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于 Clustal V 比对方法在与 SEQ IDNO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具 有至少50%的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域 所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核 酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多 肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体，并且当与未包含所述抑制DNA构建体的对 照植物比较时表现出改变的根构造；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表 现出至少一种农学特性的改变。在另一个实施方案中，改变植物根构造的方法，该方法包括(a)将抑制DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少 一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分㈧编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于 Clustal V 比对方法在与 SEQ IDNO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具 有至少50%的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域 所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸 序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽； 以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物 在其基因组中包含该抑制DNA构建体，并且其中该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建 体的对照植物比较时表现出改变的根构造；以及任选地，(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中 包含该重组DNA构建体，并且其中该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比 较时表现出改变的农学特性。在另一个实施方案中，评价植物根构造的方法，该方法包括(a)将抑制DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少 一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分㈧编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于 Clustal V 比对方法在与 SEQ IDNO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具 有至少50%的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域 所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核 酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多 肽；(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)评价与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时该转基因植物的根构造；以及(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含 该抑制DNA构建体；以及任选地，(e)评价与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时该 子代植物的根构造。在另一个实施方案中，评价植物根构造的方法，该方法包括(a)将抑制DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至
(i)以下序列的全部或部分㈧编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于 Clustal V 比对方法在与 SEQ IDNO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具 有至少50%的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域 所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核 酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多 肽；(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含 所述抑制DNA构建体；以及(d)评价当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时所述子代植物的根构造。在另一方面，本发明也涉及对基因变异进行作图的方法，所述基因变异与控制种 子发育期间的胚芽/胚乳大小和/或改变植物中的含油表型有关，所述方法包括(a)使两种植物品种杂交；并且(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异⑴选自 SEQ ID NO 14、16、18、20、22、24、26、28、30 或 33 的核酸序列；或(ii)编码选自 SEQ ID NO :15 ;17、19、21、23、25、27、29、31 或 34 的多肽的核酸序 列，其中所述评价是使用选自下组方法进行的RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分 析。在另一个实施方案中，本发明涉及改变种子发育期间的胚芽/胚乳尺寸和/或改 变植物中含油表型的分子育种方法，所述方法包括(a)使两种植物品种杂交；并(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异⑴选自 SEQ ID NO :14、16、18、20、22、24、26、28、30 或 33 的核酸序列；或(ii)编码选自 SEQ ID NO :15 ;17、19、21、23、25、27、29、31 或 34 的多肽的核酸序 列；其中所述评价是使用选自下组方法进行的RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分 析。本发明中还包括上述植物的任何子代、上述植物的任何种子以及来自任一上述植 物和子代植物的细胞。生产可作为产品销售的种子的方法，该种子提供改变的根构造，该方法包括任一 前述优选的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含 所述重组DNA构建体。附图以及序列表的说明根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。

图1示出pHSbarENDs2激活标记构建体(SEQ ID NO 1)的图谱，该构建体用于制 备拟南芥属种群。图2示出载体pD0NRTM/ZeO (SEQ ID NO 2)的图谱。attPl位点位于核苷酸 570-801 ；attP2位点位于核苷酸2754-2985 (互补链)。图3示出载体pD0NR 221(SEQ ID NO 3)的图谱。attPl位点位于核苷酸570-801 ； attP2位点位于核苷酸2754-2985 (互补链)。图4示出载体pBC-yell0W(SEQ ID NO 4)的图谱，该载体是用于构建拟南芥属表 达载体的目的载体。attRl位点位于核苷酸11276-11399(互补链)；attR2位点位于核苷 酸9695-9819 (互补链)。图5示出PHP27840 (SEQ ID NO 5)的图谱，该载体是用于构建大豆表达载体的目 的载体。attRl位点位于核苷酸7310至-434 ；attR2位点位于核苷酸8890-9014。 图6示出PHP23236(SEQ ID NO 6)的图谱，该载体是用于构建GaspeFlint衍生的 玉米品系的表达载体的目的载体。attRl位点位于核苷酸2006-2130 ；attR2位点位于核苷 酸 2899-3023。图7示出PHP10523(SEQ ID NO 7)的图谱，它是存在于农杆菌菌株LBA4404中的 质粒DNA。图8示出PHP23235(SEQ ID NO 8)的图谱，它是用于构建目的载体PHP23236的载体。图9示出了入门克隆PHP20234(SEQ ID NO 9)的图谱，它是转运PINII终止子的 载体。attR2位点位于核苷酸591-747 ；attL3位点位于核苷酸1100-1195。图10示出PHP28529(SEQ ID NO 10)的图谱，该载体是用于构建玉米品系表达载 体的目的载体。attR3位点位于核苷酸3613-3737 ；attR4位点位于核苷酸2035-2159。图11示出了入门克隆PHP28408(SEQ ID NO :11)的图谱，它是转运组成型玉米 G0S2启动子的载体。attL4位点位于核苷酸160-255 ；attRl位点位于核苷酸2301-2447。图12示出了入门克隆PHP22020(SEQ ID NO 12)的图谱，它是转运玉米根NAS2启 动子的载体。attRl位点位于核苷酸31-187 ；attL4位点位于核苷酸2578-2673。图13示出PHP29635(SEQ ID NO 13)的图谱，该载体是用于构建Gaspe Flint衍 生的玉米品系的表达载体的目的载体。attRl位点位于核苷酸40786-40910 ；attR2位点位 于核苷酸41679-41803。图14示出PII0XS2a-FRT87(ni)m(SEQ ID NO 43)的图谱，该载体用于构建目的载 体PHP29635。图15A至151示出以下全长氨基酸序列的多重比对SEQ ID NO :15、17、19、21、23、 25、27、29、31、34、以及SEQ ID NO :35、36、37、和38。完全匹配共有序列的残基显示为暗色。 将共有序列显示于每个比对上部。共有残基通过直接取多数来确定。图16示出图15A至151中示出的EXST同源物的每对氨基酸序列的序列同一性百 分比和趋异值图表。图17是实施例17中用于半水耕玉米生长的培养基。图18是列出实施例17中与不同硝酸盐浓度对Gaspe Flint衍生的玉米品系的生长和发育的影响相关的数据的图表。序列描述以及所附序列表遵循如37C. F. R. § 1. 821-1. 825所列出的关于专利申
请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。 序列表包含用于核苷酸序列字符的单字母码和用于氨基酸的三字母码，如遵照 IUPAC-IUBMB 标准所定义的，该标准在 Nucleic Acids Res. 13 3021-3030 (1985)以及在 Biochemical J. 219(2) =345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本文。 用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的规定。SEQ ID NO lpHSbarENDs2SEQ ID NO :2pD0NR /ZeoSEQ ID NO :3pD0NR 221SEQ ID NO :4pBC_yellowSEQ ID NO :5PHP27840SEQ ID NO :6PHP23236SEQ ID NO :7PHP10523SEQ ID NO :8PHP23235SEQ ID NO :9PHP20234SEQ ID NO :10PHP28529SEQ ID NO :11PHP28408SEQ ID NO :12PHP22020SEQ ID NO :13PHP29635重叠群列出了本文所述的多肽、包含编码多肽全部或其主要部分的核酸片段的 cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的对应标识符(SEQID N0:)。^t 1EXST 禾口 EXST 样蛋白 SEQ ID NO :32 是拟南芥属胚囊发育停顿蛋白 5 (embryo sacdevelopment arrest 5) (EDA5，Exostosin 家族蛋白或 EXST 蛋白，NCBIGI NO 15228598, At3g03650)的核苷酸序 列。SEQ ID NO 33 是 0RF，对应于 SEQ ID NO 32 的核苷酸 245-1744。SEQ ID NO 34对应于蛋白序列(NCBI GI NO 15228598)，该序列由 SEQ ID NO 33
编码SEQ ID NO :35 对应于 NCBI GI NO 115476598 (稻)。SEQ ID NO :36 对应于 NCBI GI NO 115487106 (稻)。SEQ ID NO :37 对应于 NCBI GI NO 115452759 (稻)。SEQ ID NO :38 对应于 NCBI GI NO 115441893 (稻)。SEQ ID NO 39 是 attBl 序列。SEQ ID NO 40 是 attB2 序列。SEQ ID NO 41是实施例9中的正向引物VC062。SEQ ID NO 42是实施例9中的反向引物VC063。SEQ ID NO :43PII0XS2a_FRT87(ni)m。SEQ ID NO 44 是玉米 NAS2 启动子。SEQ ID NO :45 是 G0S2 启动子。SEQ ID NO :46是泛素启动子。SEQ ID NO 47 是 S2A 启动子。SEQ ID NO :48 是 PINII 终止子。优选实施方案的详细描述本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引用方式并入本文。如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。术语“根构造”指构成根的不同部分的布置方式。术语“根构造”、“根结构”、“根 系”或“根系构造”在这里可互换使用。一般来讲，植物由胚发育成的第一种根称为初生根。在大多数双子叶植物中，初生 根被称为主根。这种主根向下生长并产生分枝根(侧根)。在单子叶植物中，植物的初生根 发生分枝，生成须根系。术语“改变的根构造”指与参照植株或对照植株比较，在其不同发育阶段构成根系 的不同部分的改变状况。应当理解，改变的根构造涵盖了一种或多种可测量参数(包括但 不限于一个或多个根系部分的直径、长度、数目、角度或表面)的改变，所述根系部分包括 但不限于初生根、侧根或分枝根、不定根和根毛，所有这些均在本发明的范围内。这些改变 可导致根所占的面积或空间的整体改变。参照植株或对照植株在其基因组中不含重组DNA 构建体或异源构建体。“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录 的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长 插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自，但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更 多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)， 该序列能得自FIS或重叠群。“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时 的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养 组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组 织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白 质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、茎倒伏、植株高度、穗长和收获指数。"Exostosin 家族”、“at-Exostosin 家族、exst、at-exst 本文可互换使用，指拟南 芥属位点 AT3G03650 (SEQ ID NO 32)。EXST 指由 AT3G03650(SEQ ID NO 32)的 0RF(SEQ ID N0:33 编码的蛋白(SEQ ID NO 34)。"exst 样”指拟南芥属“exostosin 家族”位点 AT3G03650 (SEQ IDNO 32)的来自不 同物种的核苷酸同源物，如玉米和大豆，并且不受限制的包括任何以下核苷酸序列SEQ ID NO :14、16、18、20、22、24、26、28 和 30。“EXST样”指拟南芥属“EXOSTOSIN家族”多肽(SEQ ID NO 34)的来自不同物种的 蛋白同源物，如玉米和大豆，并且不受限制的包括任何以下氨基酸序列SEQ ID N0:15、17、 19、21、23、25、27、29 和 31。“环境条件”指植物生长的条件，例如水的可用性、营养物质(例如氮)的可用性或
者病害的存在。“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何 细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的 转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖 通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组) 改变。“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括 存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子 代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组 织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。“子代”包括植物的任何后续世代。“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何 细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的 转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖 通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重 组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组) 改变。“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。优选的是，异源多核 苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独 地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指 通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含 有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常 以它们的5'-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代“A”为腺苷酸或 脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧 鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或 T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚 合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类 似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸 序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的 Y羧化、羟化和ADP-核糖基化。“信使RNA(mRNA) ”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以 是单链的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任 何前肽或原肽的多肽。“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原 肽可以是并且不限于细胞内定位信号。“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中 通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得 分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段 来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸 而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事 件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而 发生的那些。“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重 组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通 常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。“调控序列”指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序 列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列 可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否 来源于植物细胞。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一 地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。术语“可操作地连接”指核酸片段联合成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能 受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核 酸片段进行了可操作地连接。“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如生成 mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”意指“转染”或“转 化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整 合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表 达(如转染的mRNA)。“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)引入其中的任何细胞。在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。“稳定转化”指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦 稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。“瞬时转化”指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基 因表达而没有基因稳定遗传。“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二 倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处 是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之 一上，则该植物在该基因座处是半合子的。序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定， 这些方法包括但不限于LASERGENE 生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison, WI) 的Megalign 程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用ciustal v比对方法 (Higgins和Sharp, 1989，CAB I OS. 5 151-153)采用默认参数(空位罚分=10，空位长度罚 分=10)执行。用Ciustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的同一性百分比计算的默认 参数为 KTUPLE =1、缺口罚分=3、窗口(WINDOW) = 5 禾口 DIAGONALS SAVED = 5。而对于核 酸，这些参数为 KTUPLE = 2，空位罚分=5，窗口 = 4 和 DIAGONALSSAVED = 4。用 Ciustal V程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”和“趋 异度”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算的。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献 中有更全面的描述:Sambrook, J. ， Fritsch, E. F.禾口 Maniatis， T. ，Molecular Cloning A Laboratory Manual ；Cold Spring HarborLaboratory Press :Cold Spring Harbor, 1989 (下文称为 “Sambrook” )。现在来看优选的实施方案优选的实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、重组DNA构建体、包含这些重组DNA 构建体的组分(例如植株或种子)以及利用这些重组DNA构建体的方法。优选的分离的多核苷酸和多肽本发明包括如下优选的分离的多核苷酸和多肽分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基 酸序列基于 Ciustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进 行比较时具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%, 77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^ 100% 的序列同一性；或(ii) (i)的核酸 序列的全长互补序列；任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包 括抑制DNA构建体)。所述多肽优选为EXST或EXST样蛋白。分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Ciustal V比对方法在与SEQID N0 :15、 17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具有至少 50%,51 %,52%,53%,54%,55%, 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性。所述多肽优选为EXST或EXST样蛋白。分离的多核苷酸，该多核苷酸包含⑴核酸序列，所述核酸序列基于Ciustal V比 对方法在与SEQ ID N0:15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50%、 51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%, 66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%, 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，或(ii) (i)的核酸序列的全长互补序列。任 一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。该 分离的多核苷酸编码EXST或EXST样蛋白。优选的重组DNA构建体和抑制DNA构建体。在一个方面，本发明包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。在一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列 (如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中该多核苷酸包含(i)编码氨基酸序列的 核酸序列，所述氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、 27、29、31、或 34 进行比较时具有至少 50% ,51 % ,52% ,53% ,54% ,55% ,56% ,57% ,58% , 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100% 的序列同一性，或 (ii) (i)的核酸序列的全长互补序列。在另一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序 列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)核酸序列， 所述核酸序列在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少 50%,51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%, 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，或(ii) (i)的核酸序列的全长互补序 列。图15A至151示出以下氨基酸序列的多重比对SEQ ID NO :15、17、19、21、23、 25、27、29、31、34、以及 SEQ ID NO :35、36、37、和 38。用 LASERGENE 生物信息计算包 (DNASTAR Inc.，Madison, ffl)的Mega 1 ign 程序进行序列多重比对。具体地讲，使用 Clustal V比对方法(Higgins和Sharp (1989) CABI0S. 5 151-153)，多重比对预设参数为空 位罚分=10，空位长度罚分=10，成对比对预设参数为KTUPLE = 1，空位罚分=3，窗口 = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5。图16显示图15A至151中显示的EXST同源物的每对氨基酸序列的序列同一性百 分比和趋异值。在另一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序 列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码EXST或EXST样蛋 白。在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。抑制DNA构建体优选包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)， 该调控序列可操作地连接至(a)以下序列的全部或部分(i)编码多肽的核酸序列，所述 多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、 31、或 34 进行比较时具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%, 60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%, 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100% 的序列同一性，或(ii) 所述(a) (i)的核酸序列的全长互补序列。或者(b)源自所关注的靶基因的有义链或反义链 的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对 方法，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并 且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样蛋白；或(c)以下序列的全部或部分⑴ 核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、 27、29、31、或 34 进行比较时具有至少 50% ,51 % ,52% ,53% ,54% ,55% ,56% ,57% ,58%, 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ^ 100% 的序列同一性，或 ( )所述(c)⑴的核酸序列的全长互补序列。该抑制DNA构建体优选包含共抑制构建体、 反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体、 RNAi构建体或小RNA构建体(如，siRNA构建体或miRNA构建体)。应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核 酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码 子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、 亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负 电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电 荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽 分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的 修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因 “沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本 文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑 制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。术语“抑制”包括降低、减少、下调、 减弱、抑制、消除或阻止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括(并且不限于)反义、 共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域并且可包含所关注的靶基因 的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可与所 关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100%相同或者具有少于100%同一性的同 一性(如，具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%, 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%, 77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的同一性)。抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制 构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi (RNA干扰)构建体和小RNA构建体， 例如siRNA (短干扰RNA)构建体和miRNA (微RNA)构建体。“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。 “反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片 段表达的RNA转录物(美国专利号5，107，065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部 分，即5'非编码序列、3'非编码序列、内含子或编码序列互补。“共抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA 和在细胞内或体外能被翻译成蛋白质的RNA在内的RNA转录物。此前，已通过着眼于以有 义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的 所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，1998，Plant J.， 16 651-659 ；以及 Gura，2000Nature 404 :804_808)。另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于 1998年8月20日公开的PCT专利公开WO 98/36083)。此前描述的是“发夹”结构的利用，该结构以互补方向整合mRNA编码序列的全部 或部分，导致已表达的RNA形成潜在的“茎环”结构(于1999年10月21日公开的PCT专利 公开W099/53050)。在这种情况下，茎由对应相对于启动子以有义或反义方向插入的相关基 因的多核苷酸形成，并且环由一些相关基因的多核苷酸形成，在构建体中该多核苷酸不具 有互补序列。这增加了获得的转基因植物中的共抑制或沉默频率。关于发夹抑制的综述，参 JALWesley, S. V.等人，2003,Methods in Molecular Biology, PlantFunctional Genomics Methods and Protocols 236 :273_286。其中茎由至少30个来自待抑制基因的核苷酸形成而环由任何的核苷酸序列形成 的构建体也已经有效地用于抑制(于1999年12月2日公开的PCT专利公开WO 99/61632)。使用聚-T和聚-A序列产生茎环结构中的茎已经有所描述(于2002年1月3日 公开的PCT专利公开WO 02/00894)。然而另一种变型涉及使用合成的重复序列来促进茎环结构中的茎的形成。用这种 重组DNA片段产生的转基因生物体已经显示由形成茎环结构的核苷酸片段编码的蛋白质 的水平降低，如于2002年1月3日公开的PCT专利公开WO 02/00904中所述。RNA干扰是指由短干扰性RNA(SiRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默 的过程(Fire等人，Nature 391 :8061998)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默 (PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过程 是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共 有(Fire等人，Trends Genet. 15 =3581999)。这种防止外来基因表达的保护作用可能是通 过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应，响应源自病毒感染或源自转座 因子随机整合到宿主基因组内的双链RNA(dsRNA)的生成而进化而来。dsRNA在细胞中的存 在通过还没有完全表征的机制引发了 RNAi反应。细胞中长dsRNA的存在刺激了称为dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer涉 及使dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的短dsRNA片段(Berstein等人，Nature 409 3632001)。源自dicer活性的短干扰RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸，并且包含约19个破基对的双链体(Elbashir等人，Genes Dev. 15 =188,2001) Dicer还涉及从保守 结构的前体RNA上切下21个和22个核苷酸的小时序RNA(StRNA)，该小时序RNA参与翻译 控制(Hutvagner等人，2001，Science 293:834)。RNAi响应还涉及内切核酸酶复合物，通 常称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单 链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补的区域中间发生(Elbashir 等人，Genes Dev. 15 :188，2001)。此外，RNA干扰还涉及小RNA(如miRNA)介导的基因 沉默，可推定是通过调节染色质结构并由此防止靶基因序列转录的细胞机制(参见(例 如)Allshire，Science 297 1818-18192002 ；Volpe 等人，Science 297 1833-18372002 ； Jenuwein, Science 297:2215-22182002 ；和 Hall 等人，Science 297:2232-22372002)。这 样，本发明的miRNA分子可用于通过与RNA转录物相互作用或者作为另一种选择通过与特 定基因序列相互作用来介导基因沉默，其中这样的相互作用导致在转录或转录后水平上的 基因沉默。已经在多种系统中研究了 RNAi。Fire等人(Nature 391 :806，1998)首次在秀丽隐 杆线虫(C. elegans)中观察到 RNAi。Wianny 和 Goetz (Nature Cell Biol. 2 70,1999)描 述了在小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人(Nature 404 =293,2000)描述了在 用 dsRNA转染的果蠅(Drosophila)细胞中的 RNAi。Elbashir 等人(Nature 411 4942001) 描述了通过将合成的21-核苷酸RNA的双链体引入包括人胚肾和HeLa细胞在内的培养的 哺乳动物细胞中而诱导的RNAi。小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小 RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变 植物基因的基因表达。小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结 合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信 小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受 到抑制。据认为，小RNA和它们的RNA靶标之间的序列互补性有助于确定采用了哪种机制 (RNA裂解或翻译抑制)。据信，优选与它们的靶标互补的siRNA通过RNA裂解起作用。一 些miRNA与它们的靶基因具有完全或几乎完全的互补性，并且对于至少一些这样的miRNA， 已经证实了 RNA裂解。其他miRNA与它们的靶标具有若干错配，并且在翻译水平上明显 抑制了它们的靶标。同样，无需坚持特定的作用机理，出现了这样一种一般规律完全或 几乎完全的互补性引起RNA裂解，而当miRNA/靶标双链体含有许多错配时倾向于翻译抑 制。对于此规律的一个明显例外是植物中微RNA 172(miR172)。miR172的其中一个靶标是 APETALA2 (AP2)，尽管miR172与AP2具有几乎完全的互补性，但其表现出引起AP2的翻译抑 制而不是引起RNA裂解。微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷 酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定 出的非编码 RNA (Lages-Quintana 等人，Science 294:853-858 2001，Lagos-Quintana 等 人，Curr. Biol. 12 :735_7392002 ；Lau 等人，Science 294 :858_862，2001 ；Lee 和 Ambros, Science 294 :862_864，2001 ;Llave 等人，Plant Cell 14 1605-1619, 2002 ；Mourelatos ^ 人，Genes. Dev. 16 :720_728，2002 ；Park 等人，Curr. Biol. 12 1484-1495，2002 ；Reinhart等人，Genes. Dev. 16 1616-1626，2002)。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体 转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。在动物中，涉及加工 miRNA前体的酶称为Dicer，这是一种核糖核酸酶III样蛋白(Grishok等人，Cell 106 23-342001 ；Hutvagner 等人，Science 293 834-8382001 ；Ketting 等人，Genes. Dev. 15 2654-2659,2001)。植物也具有 Dicer 样酶，即 DCLl (以前称为 CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENS0R1)，并且最近有证据表明，其像Dicer —样，也涉及发夹前体的加 工以产生成熟 miRNA (Park 等人，Curr. Biol. 12 1484-1495, 2002 ；Reinhart 等人，Genes. Dev. 16 :1616-1626，2002)。此外，最近的研究已经清楚地表明，至少某些miRNA发夹前体 最初是作为较长的聚腺苷酸化转录物存在，并且在单个转录物中可存在几种不同的miRNA 以及相关发夹(Lagos-Quintana 等人，Science 294:853-8582001 ；Lee 等人，EMBO J21 4663-46702002)。最近的研究还测定了从dsRNA产物的miRNA链选择，所述dsRNA产物是 通过DICER加工发夹而产生的(Schwartz等人，2003，Cell 115 199-208) 看起来，经加工 的dsRNA的两 端的稳定性(即G C与A U的含量比，和/或错配)影响链选择，具有低 稳定性的末端更容易因解旋酶活性而解旋。低稳定性末端的5'末端链被整合至RISC复合 物内，而另一条链被降解。微RNA看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节 靶基因。就lin-4和let-7而言，靶位点位于靶mRNA的3'非翻译区中(Lee等人，Cell 75 :843-854，1993 ；Wightman 等人，Cell 75 :855_862，1993 ；Reinhart 等人，Nature 403 901-906，2000 ；Slack 等人，Mol. Cell 5 659-6692000)，并且在 lin-4 和 let_7miRNA 与其 靶位点之间有几个错配。lin-4或let-7miRNA的结合看起来引起了由靶mRNA编码的蛋白质 的稳态水平下调，而不影响转录物自身(Olsen和Ambros，Dev. Biol. 216 =671-680,1999) 另一方面，最近有证据表明，在某些情况下，miRNA可引起靶转录物在靶位点内特异性RNA 裂解，并且该裂解步骤看起来需要miRNA与靶转录物之间具有100%的互补性(Hutvagner 和 Zamore,Science 297:2056-2060 2002 ;Llave 等人，Plant Cell 14:1605-1619 2002)。 看起来有可能miRNA可进入至少两条靶基因调控途径当靶互补性< 100%时，蛋白下调， 当靶互补性是100%时，RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi) 期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25nt短干扰RNA(SiRNA)类似 (Hamilton 禾口 Baulcombe 1999 ；Hammond 等人，2000 ；Zamore 等人，2000 ；Elbashir 等人， 2001)，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复 合物(RISC)内。用生物信息学鉴定miRNA的靶标在动物中没有成功，这可能是因为动物miRNA与 它们的靶标具有低水平的互补性。另一方面，生物信息学方法已经成功地用于预测植物 miRNA 的靴标(Llave 等人，Plant Cell 14 :1605_1619 2002 ；Park 等人，Curr. Biol. 12 1484-1495 2002 ;Rhoades 等人，Cell 110:513-520 2002)，因此，看起来植物miRNA 与它们 的推定靶标的整体互补性高于动物miRNA。植物miRNA的这些预测靶标中的大部分编码涉 及植物发育模式或细胞分化的转录因子家族的成员。本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)优选包含至少一种调控序列。优选的调控序列是启动子。多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)中。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性 启动子、细胞特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S 或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异表达和/或胁迫特异表达可消除不需要的效应但保留改变根构造 的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol. 17 287-291)。
适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和 在TO 99/43838和美国专利6，072，050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动 子(Odell 等人，Nature 313:810-812(1985))；稻肌动蛋白(McElroy 等人，Plant Cell 2 163-171(1990))；泛素(UBI) (Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 12 :619_632 (1989)禾口 Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 18 :675_689 (1992)) ；pEMU (Last 等人，Theor. Appl. Genet. 81 :581-588 (1991)) ；MAS (Velten 等人，EMBO J. 3 :2723_2730 (1984)) ；ALS 启动子 (美国专利公开5，659，026)、玉米G0S2启动子(W00020571A2，公布于2000年4月1日) 等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5，608，149,5,608, 144,5,604, 121,5, 569，597、 5，466，785,5, 399，680,5, 268，463,5, 608，142 和 6，177，611 中公开的那些启动子。在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调 控启动子。优选的组织特异性启动子或发育调控启动子是这样的DNA序列，该序列调节DNA 序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中的表达，并限制这种DNA 序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均 可用于本发明的方法中。种子或胚特异性的并且可用于本发明的启动子包括大豆Kimitz胰蛋白酶抑制 剂(Kti3，Jofuku 和 Goldberg，Plant Cell 1 1079-1093 (1989))、马铃薯块莲特异蛋白 (patatin)(马铃薯块莲)(Rocha-Sosa，Μ.等人，1989，EMBO J. 8 :23_29)、convicilin、豌 豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)(Rerie, W. G.等人，1991，Mol. Gen. Genet. 259 149-157 ； Newbigin, E. J.等人，1990，Planta 180 461-470 ；Higgins, T. J. V.等人，1988，Plant. Mol. Biol. 11 683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J. P.等人，1988，EMBO J. 7 1249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 82 :3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker, Τ.等人，1987，EMBO J. 6 :3571-3577)、Β-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z-L等人，1988，EMBO J. 7 297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等人，1988，Plant Mol. Biol. 10 359-366)、麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot，V.等人，1987，EMBO J. 6 3559-3564)和甘薯C藏蛋白(sporamin)(甘薯块根)(Hattori，T.等人，1990, Plant Mol. Biol. 14 595-604)。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因 的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实例包括在拟南芥属和甘蓝型 油菜种子中表达脑啡肽的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人， Bio/Technology 7 :L929_932 (1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子 (Riggs等人，Plant Sci. 63 :47_57 (1989))，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot 等人，EMBO J 6 :3559-3564(1987))。可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操作地连接的DNA序列。 可诱导的或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸 如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。优选的启动子包括如下启动子1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等人，1999， Nature Biotechnol. 17 287-91) ；2)大麦启动子B22E ;B22E的表达是发育中的玉米籽 粒中的柄所特异性的(“Primary Structureof a Novel Barley Gene Differentially Expressed in ImmatureAleurone Layers (在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一 级结构)”。Klemsdal, S. S.等人，Mol. Gen. Genet. 228(1/2) :9_16(1991))；以及 3)玉米 启动子 Zag2( "Identification and molecularcharacterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsisflora homeotic gene AGAMOUS (ZAG1-拟南芥属花同源异 形基因AGAMOUS的玉米同系物的鉴定和分子表征)”，Schmidt, R.J.等人，Plant Cell 5(7) :729_737 (1993))ο "Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairsof AGAMOUS-Iike MADS-box genes from maize (两对来自玉米的AGAMOUS样MADS-box基因的结构表征、染色体定位及系统发育评 价)”，Theissen 等人，Gene 156(2) 155-166 (1995) ；NCBI GenBank AccessionX80206))。 Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP) 7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的 雌花序心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉 前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的 雌小花母系相关的基因的任何启动子。用于在植物中调节本发明的核苷酸序列表达的其他优选启动子是维管元件特异 性启动子或茎优选启动子。这种茎优选启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号 EF030816 ；Abrahams 等人，Plant Mol. Biol. 27 :513_528 (1995))和 S2B 启动子(GenBank 登 录号EF030817)等等，将这些文献以引用的方式并入本文。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构 成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不同 的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表 达。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，一些变型的 DNA片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启 动子通常称为“组成型启动子”。目前不断在发现可用于植物细胞中的不同类型的新启动 子；在 Okamuro, J. K.禾口 Goldberg，R. B. ，Biochemistry ofPlants 15 1-82 (1989)的、汇编 中可找到许多实例。(将其与其他组成型启动子描述放在一起。)优选的启动子可包括RIP2、mLIP15、ZmCORURabl7、CaMV 35S、RD29A、B22E、 Zag2、SAM合成酶启动子、泛素启动子(SEQ ID NO 46)、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶 启动子、R-等位基因启动子、根细胞启动子、维管组织特异性启动子S2A(Genbank登录号 EF030816 ；SEQ ID NO 47)和 S2B (Genbank 登录号 EF030817)及来自 6260 玉米的组成型启 动子G0S2(SEQ ID NO :45)。其他优选的启动子包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动 子(SEQ ID NO :44)、玉米 Cyclo 启动子(US2006/0156439，公开于 2006 年 7 月 13 日)、玉米R00TMET2 启动子(W005063998,公开于 2005 年 7 月 14 日)、CRlBIO 启动子(W006055487,公 开于 2006 年 5 月 26 日)、CRWAQ81 (W005035770,公开于 2005 年 4 月 21 日)和玉米 ZRP2. 47 启动子(NCBI 保藏号:U38790, gi =1063664)。
核苷酸序列的“主要部分”包含的核苷酸序列足以提供其包含的启动子的推定鉴 定。核苷酸序列可由本领域技术人员来人工评价，或使用基于计算机的序列比较和鉴定工 具进行评价，所述工具使用算法如 BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool ；Altschul 等人(1993)J.Mol.Biol.215 :403-410)。一般来讲，为了推定鉴定启动子核酸序列是否与 已知启动子同源，包含三十或更多个邻接核苷酸的序列是必需的。具有如本文报道序列的 有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知 的目的。因此，本发明包括在附随序列表中报道的完全序列，以及那些上述序列的主要部 分。本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)也可包括其他调控序列，包括但 不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个优选的实施方案 中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。内含子序列可加入到部分编码序列的5’非翻译区或编码序列以增加积聚在胞浆 中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接 内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg， Mol. Cell Biol. 8 :4395-4405 (1988) ;Callis 等人，Genes Dev. 1 :1183_1200 (1987)。这 种内含子对基因表达的增强通常在将其设置接近转录单位的5’端时为最大。玉米内含子 Adhl-S内含子1、2和6、Bronze-I内含子的使用是本领域已知的。通常参见The Maize Handbook，第 116 章，Freeling 和 Walbot (编辑)，Springer，纽约(1994)。如果期望进行多肽表达，则通常希望在多核苷酸编码区的3'-端处包含有多腺 苷酸化区。该多腺苷酸化区可源自天然基因，源自多种其他植物基因或源自T-DNA。要加入 的3'端序列可源自(例如)胭脂碱合成酶或章鱼碱合成酶基因，或作为选择源自另外的植 物基因，或较不优选的是源自任何其他真核基因。“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译前导 序列存在于翻译起始序列的经完全加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初 级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例已经有所描述(Turner，R.和 Foster, G. MolecularBiotechnology 3 :225(1995))。在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或 沉默子。任何植物均可选择用来鉴定将用于产生本发明重组DNA构建体和抑制DNA构建体 的调控序列和基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、 苹果、杏、拟南芥属植物、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰 花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔 类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅 菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、 酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、 橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、大蕉、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑 麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、 蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。用于鉴定调控序列的特别 优选的植物是拟南芥属植物、玉米、小麦、大豆和棉。优诜的组合物本发明的优选组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(包括任何 抑制DNA构建体)(例如上面所讨论的那些优选构建体)的植物。优选的组合物也包括任 何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中 包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而 获得的连续世代。子代也包括杂交种和近交系。优选地，在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合 的近交系植物。该近交系植物产生含有新引入的重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的 种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的根(或植物)构造，或者可用于育种程序 以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出改变的根(或植物)构造的植物。 优选地，种子是玉米。 优选地，植物是单子叶植物或双子叶植物，更优选地，是玉米或大豆植物，甚至更 优选的是玉米植物，例如玉米杂交种植物或玉米近交系植物。植物还可以是向日葵、高梁、 蓖麻、葡萄、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉、稻、大麦或小米。优选地，重组DNA构建体稳定地整合进植物的基因组中。尤其优选的实施方案包括但不限于如下优选的实施方案1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该重组DNA 构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所 述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、29、 31、或 34 进行比较时具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%, 60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%, 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%, 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100% 的序列同一性，并且其 中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出改变的根构造。 优选地，在与该对照植物比较时，该植物还表现出至少一种农学特性的改变。2.植物(优选地玉米或大豆植物)，所述植物在其基因组中包含重组DNA构建 体，所述重组DNA构建体包含(a)可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所 述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、 31、或34进行比较时具有至少50 %的序列同一性，或(b)抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件 可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分㈧编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时 具有至少50%的序列同一性，或(B) (b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域 所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸 序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽， 并且其中在与未包含所述重组构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特 性的改变。3.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该重组DNA 构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码EXST 或EXST样蛋白，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植 物表现出改变的根构造。优选地，该植物还表现出至少一种农学特性的改变。优选地， 该EXST或EXST样蛋白来自拟南芥属(Arabidopsisthaliana)、 玉米(Zea mays)、大豆 (Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、里予大豆(Glycine soja)禾口短绒里予大豆(Glycine tomentella)。4.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该抑制DNA 构建体包含至少一种可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部 分的区域的调控元件，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于 Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样蛋白，并且其中在与未包 含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。5.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该抑制DNA构 建体包含至少一种可操作地连接至以下序列的全部或部分的调控元件(a)编码多肽的核 酸序列，在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34 比较时，基于Clustal V 比对 方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，或 (b) (a)的核酸序列的全长互补序列，并且其中在与未包含所述重组构建体的对照植物比较 时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。6.上述优选实施方案1-5中的植物的任何子代、上述优选实施方案1-5中的植物 的任何种子、上述优选实施方案1-5中的植物的子代的任何种子以及来自上述优选实施方 案1-5中的植物以及它们的子代的细胞。在上述优选的实施方案1-6或本发明的任何其他实施方案中的任一项中，重组 DNA构建体(或抑制DNA构建体)优选包含至少一种在植物中有功能的启动子作为优选的 调控序列。在上述优选的实施方案1-6或本发明的任意其他实施方案中的任一项中，至少一 种农学特性的改变是增加或减少，优选增加。在任一前述的优选实施方案1-6或本发明的任何其他实施方案中，至少一种农学特性优选选自绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种 子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织中的含氮量、总植物游离氨基酸 含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白 质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、抗涝性、氮摄取、根倒伏、 茎倒伏、植株高度、穗长以及收获指数；产量、绿度、生物量和根倒状是尤其优选进行改变的 农学特性(优选增加)。在任一前述的优选实施方案1-6或本发明的任何其他实施方案中，在与对照植物 比较时，植物优选表现出至少一种与环境条件例如水和营养物质的可用性无关的农学特性 的改变。本领域的普通技术人员熟悉测定植物根构造改变的规程。例如，可检测分析转基 因玉米植物的根构造在幼苗期、花期或成熟期的改变。根构造的改变可通过统计温室培 育的植物顶部第3或第4节的节根数目或根带的宽度来测定。“根带”指成熟期植物在花 盆底部的根丛宽度。植物根构造变化的其他量度包括但不限于侧根的数量、节根的平均根 直径、侧根的平均根直径、根毛的数量和长度。侧根分枝的程度(如侧根数量、侧根长度) 可通过这样测定从完整的根系进行二次取样，将样本用平面扫描器或数码相机成像并用 WinRHIZO 软件(Regent Instruments Inc.)分析。对提取的有关根表型的数据进行统计分析(通常为t检验)，以将转基因根与非转 基因姊妹株植株的根进行比较。在多个事件和/或构建体涉及该分析的情况下，还可使用 单因素方差分析。下面的实施例描述了一些用于检测根构造改变的代表性规程和技术。也可通过在田间测试中，在相同条件下比较植物与对照或参照植物提高产量的能 力，来评价植物根构造的改变。也可通过在田间测试中比较植物在胁迫条件下(例如营养物质过剩或受限、水过 剩或受限、存在病害)保持基本产量(优选地至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、99%或100%产量)的能力，与非胁迫条件下的对照或参照植物的产量，来评价 根构造改变。根构造的改变可通过测定转基因植物较于参照植物或对照植物的抗根倒伏性来测量。在评价或测量其中利用了对照或参照植物的本发明任何实施方案(如，如本文描 述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将很容 易认识到要利用的合适对照或参照植物。例如，通过如下非限制性示例来说明1.转化过的植物的子代，该转化过的植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建 体)来说是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体(或抑制DNA构建体) 的植株包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于未包含该重组 DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即，未包含该重组DNA构建体(或抑 制DNA构建体)的子代是对照或参照植株)。2.重组DNA构建体(或抑 制DNA构建体)基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或 基因渗入进变种中，例如在大豆中基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或变种品系是对照或参照植物)。3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建 体)第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即亲本近交系或变种品系为对照植 物或参照植物)。4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株该植株可相对于这样的 对照植株进行评价或测量，该对照植株不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)，但 具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植 株相比较，核遗传物质具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验 室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性 DNA(RAPD)、任何引物聚合成酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域 (SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP )和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评价或测量转基因植物的农学特性 或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型通过诱变 或转化而选择的植物。优诜的方法优选的方法包括但不限于用于改变植物根构造的方法、用于评价植物根构造改变 的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于测定植物农学特性改变的方法以及用于产生 种子的方法。优选地，植物是单子叶植物或双子叶植物，更优选地，是玉米或大豆植物，甚至 更优选地，是玉米植物。植物还可以是向日葵、高梁、蓖麻、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉、稻、大麦 或小米。种子优选的是玉米或大豆种子，更优选的是玉米种子，并且甚至更优选的是玉米杂 交种种子或玉米近交系种子。特别优选的方法包括但不限于如下方法改变植物根构造的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物 细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中有功能的 启动子)的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比 对方法在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50%、 51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%, 66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%, 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性；以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物 细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与 未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。所述方法可进一步包括 (c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA 构建体并且在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。改变植物根构造的方法，该方法包括(a)将包含至少一种调控序列(优选在植物 中有功能的启动子)的抑制DNA构建体导入可再生植物细胞中，该调控序列可操作地连接 至
(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQID NO 15、17、19、 21、23、25、27、29、31、或34比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至 少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性，或(B)(a)⑴㈧的核酸序列的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至 少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码 EXST或EXST样多肽；以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物 在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时 表现出改变的根构造。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其 中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的 对照植物比较时表现出改变的根构造。评价植物根构造改变的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生 的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中 有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具 有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、 64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%, 79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，或(b)在步骤(a)之后从该可再 生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体； 以及(c)评价与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时该转基因植物的根构造；该方 法还可包括(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含 该重组DNA构建体；以及(e)评价与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时该子代植 物的根构造。评价植物根构造改变的方法，所述方法包括(a)将包含至少一种调控序列(优选 在植物中有功能的启动子)的抑制DNA构建体导入可再生植物细胞中，该调控序列可操作 地连接至⑴以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQID NO 15、17、19、 21、23、25、27、29、31、或34比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至 少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，或⑶所述(a)⑴(A)的核酸序列的 全长互补序列；或者(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，当与所述区域所 来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸 序列具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶 基因编码EXST或EXST样多肽；以及 (b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与未包含该抑制 DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。该方法可另外包括(d)获得源自该转基因植 物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代 植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。评价植物根构造改变的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生 的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中 有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具 有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、 64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%, 79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生 植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；(c) 获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建 体；以及(d)评价该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构 造。评价植物根构造的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至 少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多 肽的核酸序列，在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34 比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50 %、51 %、52 %、53 %、54%、55 %、56 %、57 %、 58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%, 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一 性，或(B)所述(a) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或者(ii)源自所关注的靶基因的 有义链或反义链的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基 于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；(b)在步骤(a) 之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制 DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包 含所述抑制DNA构建体；以及(d)评价与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时该子 代植物的根构造。测定植物农学特性改变的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中 有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID N0:15、17、19、 21、23、25、27、29、31、或34比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至 少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、5 7%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，(b)在步骤(a)后，从可再生植物细胞 中再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c) 测定该转基因植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种 农学特性的改变。该方法还可包括(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植 物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)测定该子代植物在与未包含该重组DNA 构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。测定植物农学特性改变的方法，该方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动 子)，所述调控序列可操作地连接以下序列的全部或部分(i)核酸序列，该核酸序列编码 多肽，该多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、 27、29、31、或 34 进行比较时具有至少 50% ,51 % ,52% ,53% ,54% ,55% ,56% ,57% ,58%, 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，或 ( )所述(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后从可再生植物细胞再生出 转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)测定该转基 因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的 改变。该方法可另外包括(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基 因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)测定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的 对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。测定植物农学特性改变的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中 有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID N0:15、17、19、 21、23、25、27、29、31、或34比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至 少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，(b)在步骤(a)后，从可再生植物细胞 中再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得 源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体； 并且(d)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少 一种农学特性的改变。测定植物中农学特性改变的方法可进一步包括测定所述转基因植 物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少 一种农学特性的改变。 测定植物农学特性改变的方法，该方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动 子)，所述调控序列可操作地连接以下序列的全部或部分(i)核酸序列，该核酸序列编码 多肽，该多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、 27、29、31、或 34 进行比较时具有至少 50% ,51 % ,52% ,53% ,54% ,55% ,56% ,57% ,58%, 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，或 ( )所述(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物 在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子 代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)测定该子代植物在与未包含该重组 DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可 再生的植物细胞，该抑制DNA构建体包括至少一种调控元件，该调控元件可操作地连接至 源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义 链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至 少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100 %的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码 EXST或EXST样多肽；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该 转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物在与未包 含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。所述方法 可进一步包括(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组 中包含所述抑制DNA构建体；以及(e)测定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对 照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可 再生的植物细胞，该抑制DNA构建体包括至少一种调控元件，该调控元件可操作地连接至 源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义 链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100 %的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码 EXST或EXST样蛋白；(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所 述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子 代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)测定该子代植 物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。产生种子(优选可作为提供改变的根构造的产品销售的种子)的方法，该方法包 括任一上述的优选方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组 中包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。在任一前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，测定转基因植物中 农学特性改变的步骤(如果适用的话)可优选地包括测定在改变的环境条件下与不包含重 组DNA构建体的对照植物进行比较时该转基因植物是否表现出至少一种农学特性的改变。在任一前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，测定子代植物中农 学特性改 变的步骤(如果适用的话)可优选地包括测定在改变的环境条件下与不包含重组 DNA构建体的对照植物进行比较时该子代植物是否表现出至少一种农学特性的改变。在任何前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，在所述导入步骤中 所述可再生的植物细胞优选地包括愈伤组织细胞(优选胚胎)、配子细胞、分生细胞或未成 熟胚芽细胞。可再生的植物细胞优选来自近交系玉米植物。在任一上述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，所述再生步骤优选 包括(i)在包含促进胚发生的激素的培养基中培育所述转化的植物细胞直至观察到愈伤 组织；(ii)将所述步骤(i)的转化的植物细胞转移至包含促进组织机体形成的激素的第一 培养基；以及(iii)在第二培养基上传代培养步骤(ii)后的所述转化的植物细胞，以允许 嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。在任一前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，存在供选择的替代 方案用于将包含可操作地连接至少一种调控序列上的多核苷酸的重组DNA构建体导入可 再生的植物细胞。例如，可将调控序列(例如一种或多种增强子、优选地作为转位因子的部 件)导入可再生的植物细胞，然后筛选其中将所述调控序列可操作地连接至编码本发明多 肽的内源基因的事件。将本发明的重组DNA构建体引入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包 括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转 移、轰击或农杆菌介导转化。在任一上述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，至少一种农学特性 优选选自绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产 量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果 实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、 果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、抗涝性、氮摄取、根倒伏、茎倒伏、 植株高度、穗长、茎倒伏以及收获指数。产量、绿度、生物量和根倒状是尤其优选进行改变的农学特性(优选增加)。在任一上述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，在与对照植物比较 时，植物优选表现出至少一种与环境条件无关的农学特性的改变。将本发明的重组DNA构建体引入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包 括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转 移、轰击或农杆菌介导转化。优选的技术如下文实施例所示，用于转化玉米植物细胞和大豆植物细胞。用于转化双子叶植物(主要通过利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) (以及获得转基因植物的其他优选方法包括公开的用于棉的那些(美国专利5，004, 863、 美国专禾IJ 5，159，135、美国专利5，518，908)；用于大豆的那些(美国专利5，569，834、 美国专禾Ij 5，416，011、McCabe 等人，Bio/Technology 6 923(1988), Christou 等人， PlantPhysiol. 87 =671674 (1988))；用于芸苔属植物(Brassica)的那些(美国专利 5，463，174)；用于花生的那些(Cheng 等人，Plant Cell Rep. 15 653657 (1996), McKently 等人，Plant Cell Rep. 14 699 703 (1995))；用于番木瓜的那些；以及用于豌豆的那些 (Grant 等人，Plant Cell Rep. 15 =254258, (1995))。用电穿孔、粒子轰击和农杆菌转化单子叶植物也已有报道并且作为优选的方法 包括(例如)如在天门冬属(asparagus)中实现的转化和植物再生(Bytebier等人， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 84 :5354，(1987))；在大麦中实现的转化和植物再生(Wan 和Lemaux, PlantPhysiol. 104 37(1994))；在玉米中实现的转化和植物再生(Rhodes等 人，Science 240:204(1988) ；Gordon-Kamm 等人，Plant Cell 2:603 618(1990) ；Fromm 等人，Bio/Technology 8 833(1990) ；Koziel 等人，Bio/Technology 11 :194，(1993)； Armstrong等人，CropScience 35:550-557(1995))；在燕麦中实现的转化和植物再生 (Somers等人，Bio/Technology 10:1589(1992))；在鸭茅中实现的转化和植物再生(Horn 等人，Plant Cell Rep. 7 =469(1988))；在稻中实现的转化和植物再生(Toriyama等人， Theor. Appl. Genet. 205 34, (1986) ；Part 等人，Plant Mol. Biol. 32 1135 1148，(1996)； Abedinia 等人，Aust. J. Plant Physiol. 24 133 141 (1997) ；Zhang 和 Wu，Theor. Appl. Genet. 76 :835 (1988) ；Zhang 等人，Plant Cell Rep. 7 379, (1988) ；Battraw 和 Hall, Plant Sci. 86:191 202(1992) ；Christou 等人，Bio/Technology 9:957(1991))；裸麦(De la Pena等人，Nature 325:274(1987))；在甘蔗中实现的转化和植物再生(Bower和Birch， Plant J. 2 =409(1992))；在高羊茅(tall fescue)中实现的转化和植物再生(Wang等人， Bio/Technology 10 =691(1992))和在小麦中实现的转化和植物再生(Vasil等人，Bio/ Technology 10:667(1992)；美国专利 5，631，152)。存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组 织以及要再生的具体植物物种。从单植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本 领域所熟知的(Weissbach 禾口 Weissbach(编辑)，载于Methodsfor Plant Molecular Biology, Academic Press, Inc. San Diego, CA, (1988))。该再生和生长方法通常包括如下 步骤选择转化的细胞、培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植 株阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类的合适植物生长培养基中。含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本 领域所熟知的。优选地，将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得 自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些重 要品系的植物用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽 的本发明的转基因植物。在另一方面，本发明也涉及与改变根构造和/或改变植物至少一种农学特性有关 的对基因变异 进行作图的方法，所述方法包括(a)使两种植物品种杂交；并且(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异⑴选自 SEQ ID NO :14、16、18、20、22、24、26、28、30 或 33 的核酸序列；或(ii)编码选自 SEQ ID NO :15 ;17、19、21、23、25、27、29、31 或 34 的多肽的核酸序 列，其中所述评价是使用选自下组方法进行的RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分 析。在另一个实施方案中，本发明涉及改变根构造和/或改变植物至少一种农学特性 的分子育种方法，所述方法包括(a)使两种植物品种杂交；并且(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异⑴选自 SEQ ID NO 14、16、18、20、22、24、26、28、30 或 33 的核酸序列；或(ii)编码选自 SEQ ID NO :15 ;17、19、21、23、25、27、29、31 或 34 的多肽的核酸序 列；其中所述评价是使用选自下组方法进行的RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分 析。术语“对基因变异进行作图，，或“对基因变异性进行作图，，可互换使用，并且定义 了鉴定DNA序列中在不同植物品系、栽培变种、品种、家族、或物种之间存在差异的基因区 域内天然发生或诱导发生的变化的方法。甚至由于极少的碱基变化导致的在特定位点(基 因)的基因变异性能够改变可能生成的限制酶消化片段的形式。病原体变成基因型可能是 由于被分析基因内的删除或插入导致，或者甚至只是由于能够产生或删除限制酶识别位点 的单个核苷酸取代导致。RFLP分析利用这一方法并且利用具有对应于受关注的分离核酸片 段的探针的Southern印迹法。因此，如果多态性(即，基因或DNA片段中普遍存在的变型；也指在相同物种内 存在若干形式的基因(等位基因))产生或破坏一个限制性核酸内切酶裂解位点，或者如 果它导致DNA丢失或插入(例如可变的核苷酸串联重复(variable nucleotide tandem repeat, VNTR)多态性)，将改变能用限制性核酸内切酶消化生成的DNA片段的大小或特征。 同样地，通过限制性片段分析能将具有变异序列的个体与那些具有初始序列的个体区分开 来。将能用该方法鉴定的多态性称为“限制性片段长度多态性(“RFLP”)。RFLP已经被广 泛应用于人类和植物基因分析(Glassberg，UK专利申请2135774 ；Skolnick等人，Cytogen. Cell Genet. 32 :58_67 (1982) ；Botstein 等人，Ann. J. Hum. Genet. 32 :314_331 (1980)；Fischer 等人(PCT 专利申请 WO 90/13668 ；Uhlen，PCT 专利申请 WO 90/11369)。“单核苷酸多态性”或“SNP”的中心属性是多态性位点位于单个核苷酸上。据报 道，SNP具有对RFLP或VNTR的某些优点。首先，SNP比其它类型的多态性更稳定。它们的 自发突变率为大约 IO-9 (Romberg, DNAR印 Ii cat ion，W. H. Freeman & Co.，San Francisco, 1980)，比VNTR(美国专利公开5，679，524)的频率低了大约1，000倍。其次，SNP的发生频 率更高，并且比RFLP和VNTR更一致。因为SNP由序列变异产生，可通过随机基因组测序或 cDNA分子测序来鉴定新的多态性。SNP也能由删除、点突变和插入产生。任何单个碱基改 变，无论其起因，均可能是SNP。SNP的更高频率意味着它们可能比其它类别的多态性更易 于鉴定。SNP能够使用多种方法中的任何一种进行鉴定。此类方法包括直接的或间接的位 点测序、使用限制性酶(其中位点相应的等位基因产生或破坏限制性位点)、使用等位基 因特异性杂交探针、使用由多态性的不同等位基因或者其它生化物质编码的蛋白的特异抗 体。SNP能通过许多方法进行测序。可使用两种基本方法进行DNA测序，Sanger等人的链 终止法，Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. Α.) 74 :5463_5467 (1977)，以及 Maxam 和 Gilbert 的化 学降解法，Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. Α.) 74 :560_564 (1977)。 此外，可通过改进的PCR技术检测单点突变，例如连接酶链反应(“LCR”)和 PCR-单链构象多态性(“PCR-SSCP”)分析。也能使用PCR技术鉴定极少量样本中的基因 表达水平，例如来自主体的组织或细胞。该技术称为反转录_PCR( “RT-PCR”)。术语“分子育种”定义了在育种过程期间跟踪分子标记的方法。将分子标记与所期 望的表型特征相连是普遍的。通过跟踪分离的分子标记或基因特征，而不是对表型进行评 分，育种过程能通过种植更少的植物并免于对表型变型进行检测分析或目测而加快。该过 程中有用的分子标记包括但不限于鉴定前文提到的可作图的基因变异时可用的任何标记， 以及显示跨植物物种的同线性的任何紧接的基因。术语“同线性”指不同生物之间的基因 组上的保守基因位置/顺序。这意味着发现两个或更多个基因位点(可以是紧接的，或者 可以是不紧接的)位于不同物种间的相同基因组上。同线性的另一个术语是“基因组共线 性”。基因作图的目的是为了鉴定产生受关注的表型的基因。作图的第一阶段通常是定 位染色体的普通区域，该区域与受关注的表型的传送有关。接下来鉴定该基因和最后的特 定等位基因是否具有诱发作用。关联作图一般分成两大类1)候选基因关联作图，它与选择的候选基因的多态性 有关，所述候选基因声称对控制特定性状的表型变异具有作用；和2)全基因组关联作图， 或者基因组扫描，它检测整个基因组的基因变异以寻找关联多个复杂特性的信号。在候选基因关联作图中，基于以前来自突变分析、生物化学途径、或所关注特性的 关联分析的知识来选择候选基因。需要对一组独立的随机标记评分以推断基因关系。全基因组关联作图是用于系统搜索基因组的因果基因变异的综合方法。测试大量 标记以关联多个复杂特性，并且不需要预先知道关于候选基因的信息。(Zhu等人(2008)The Plant Genome，1 :5_20)。实施例本发明将在下面的实施例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅 是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发 明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修 饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文 所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也 旨在属于所附权利要求书的范围内。实施例1艦‘棚舌椒？細构建18. 5kb 的 T-DNA 基二元构建体，pHSbarENDs2 (图 1 ；SEQ IDNO 1 ；)包含四 个来源于花椰菜花叶病毒35S启动子的四个多聚增强子元件，对应于序列-341至-64，如 Odell等人(1985)Nature 313 :810_812所述。该构建体也包含允许质粒救援的载体序列 (pUC9)、再动员T-DNA的转座子序列(Ds)、以及允许草胺磷选择转基因植物的bar基因。仅 将从右边界(RB)至左边界(LB)包含的10. 8kb片段转移到寄主植物基因组中。因为增强 子元件位于靠近RB处，它们可诱导T-DNA整合后的基因组位点顺式激活。将pHSbarENDs2构建体转化到根癌农杆菌菌株C58中，在25°C下在LB中培养至 0D600 1.0。然后离心沉淀细胞，并重悬在相等体积的5%蔗糖/0.05% Silwet L-77 (0SI Specialties, Inc)中。在早期抽薹时，培育拟南芥属生态型Col-O的土壤使用农杆菌悬 浮液进行顶部灌溉。一周后，相同植株再次用在蔗糖/Silwet中的相同农杆菌菌株进行 顶部灌溉。然后将该植物的种子设为标准。所得T1种子在土壤中播种，通过喷洒草胺磷 (Finale ； AgrEvo ；Bayer Environmental Science)选择转基因幼苗。从大约 35，000 个 单个草胺磷抗性Tl植株中收集T2种子。培养T2植株并收集来自96个分离T2品系的相同 体积的T3种子。这组成了 360个亚群。选择了总计100，000个草胺磷抗性T1幼苗。分开保存来自每个品系的T2种子。实施例2A 帝诛似鉴定H有gt变根构造的品系(制件氮K牛)在与早期发育期间来自如实施例1所述的种群的对照幼苗进行比较时，可分析在 不限制氮条件下培养的具有激活标记的拟南芥属幼苗的根系构造。来自每个96，000个分离Tl激活标记品系的十个T2种子可用氯气进行灭菌并种 植在培养皿上,培养皿包含以下培养基0. 5x N-FreeHoagland' s,60mM KNO3,0. 1 %蔗糖， ImM MES和l^Phytagel 。通常将10个平板置于架子中。平板在4°C下保存三天以使种 子分层，然后在22°C光照和20°C黑暗垂直保持11天。光周期为16h ；8h黑暗，平均光照强 度为 180ymol/m2/S。架子(通常每个装有10个平板)在每个搁板中每日旋转。在第14 天，评价平板的幼苗状态，拍摄整个平板的数字图像并分析根面积。将平板随机分成10个 水平区域。在板上10个水平区域的每个区域中的根面积以总面积百分比表示。仅仅使用 区域3至9的面积进行品系根总面积计算。可使用ICORIA开发的Rootbot图像分析工具 (专有)评价根面积。根总面积以mm2表示。期望具有增加的根生长特性的品系位于根分布区域的上端。假定架子有最多两个异常值，可使用滑动窗方法评价给定架子的根区域的变化。包括生长培养基、温度、和湿度在内的多个因素的环境变量可引起根生长的显著改变，尤其是在播种期间更是如此。因此 根据播种日期和搁板来将所述品系分组以用于数据分析。然后通过平均根面积来拣选特定 播种日期/搁板组中的架子。通过将架子α的数据与来自下一个最低架子Ov1，以及下一 个最高平均根面积，IV1)的数据进行合并来执行滑动窗根面积分布然后使用Grubbs型方 法(Barnett 等人，Outliers in Statistical Data, Johnffiley & Sons,第 3 版(1994)来 分析组合分布的变量以鉴定ri中的异常值。将通过上文所述方法测定的具有显著增加的根生长的品系命名为Phasel hits。 在相同分析条件下进行Phase 1 hits的重复试样再筛选。当任一个或两个Phase 2重复 试样显示与平均值的显著差异时，认为该品系是经验证的根构造品系。在Phase 2的至少一个平板中再次发现是异常值的那些品系经过室内进行的 Phase 3筛选以验证Phase 1和Phase 2中获得的结果。使用下文所述的Rootboot图像分
析(如上所述)和WinRHIZO 验证Phase 3的结果。在第一轮筛选中进行相同方式的确 认。T2种子用50%家用漂白剂，0. 01% triton X-100溶液灭菌，并以10颗种子/平板的密 度置于与第一轮筛选所述的相同平板培养基上。在4°C下保存平板三天以使种子分层，并在 与首次实验相同的温度和光周期下培养种子，光照强度为 160ymol/m2/S。将平板垂直放 入10平板架的八个中心位置，第一个和最后一个位置放空白平板。每隔一天旋转架子和架 子中的平板。每隔平板拍摄两组照片。第一组在14-16天拍摄，此时大多数品系的初生根 已经到达平板底部，第二组照片在发育出更多侧根两天后拍摄。通常用后面的一组照片进 行数据分析。用软件WinRHIZO (Regent Instruments Inc)分析在垂直平板上生长的这 些幼苗的根生长，该软件是特别设计的一种进行根测量的图像分析系统。WinRHIZO 利用 像素对照来从较暗的背景辨别出根构造。为了在不拍摄背景情况下鉴定的根的最大量，所 述像素级别是150-170，并且使用滤光器移除长度/宽度比率小于10. O的物体。进行分析
的平板上的面积为从植物叶片边缘至距离平板底部约Icm处。使用完全相同的WinRHIZO
设置和分析面积分析一批的所有平板。WinRHIZO 给出的一个平板的总根长度得分除以 已经萌发并沿平板生长一半的植物数目。每个品系培养三个平板，取它们的得分均值。然 后将该平均值与同时培养的包含野生型种子的三个平板的平均值比较。然后使用通过与野生型相比具有更高根生长数值进行再确认的拟南芥属激活标 记品系，用于分子鉴定侧接T-DNA插入序列的DNA。实施例2B在突变种群中鉴定具有改变的根表型的突变品系(氮限制条件)可使用两步筛选程序，该程序包括(1)用垂直平板检测分析法鉴定改变的根生长表型；(2)在拯救的突变体品系中确认抗除草剂性和根表型；初次筛选基于垂直平板，该平板包含无氮的Hoagland盐，0. 3%蔗糖和ImM KNO30 该培养基也包含0. 8%至1. 0% PhytaGel作胶凝剂。具有1. 0% Phytagel的培养基有时难 以灌注，因为它凝固迅速，然而低于0.8%时当垂直放置时培养基将滑出平板。来自激活标 记种群的突变体，其中100个单个品系的集合可用于总计36000个品系的筛选。在每个平板上，种植12个突变体和2个野生型Columbia种子。平板置于具有26°C恒温的培养室中， 培养室为16小时-日循环，平板顶部的平均光照强度为110yE/m2S。这些平板在2. 5周期 限内拍照3-4次。当观察到清楚的根表型时拯救单个幼苗。拯救的幼苗在生长室(24°C，每 日16小时，250至300 PEAi2s)中生长至成熟以采集种子。就次级筛选而言，将来自在初次筛选中鉴定的推定hits的种子播种于包含与上 文相同的培养基(加上6mg/L双丙氨磷)的平板上。野生型Columbia种子在相同时间、但 无双丙氨磷的相同培养基上播种。每个平板具有10个种子。每个突变体品系有3个平板， 而野生型Columbia有2个平板作为重复试样。这些平板置于培养室中，生长条件与上文所 述相同。剔除那些认为是假阳性的不具有抗除草剂性或无明显 的根表型的品系。保存次级 筛选验证的品系用于进一步研究。实施例3鉴定激活标记基因使用下述两个标准程序中的一个或两个鉴定侧接导致根构造改变的T-DNA插入 序列的基因(1)热不对称交错 PCR(TAIL) PCR(Liu 等人，(1995)，Plant J. 8 :457_63)；以 及(2) SAIFF PCR (Siebert 等人，(1995) Nucleic Acids Res. 23 1087-1088)。至于复杂的 多聚T-DNA插入序列，TAIL PCR和SAIFF PCR可能均不足以鉴定候选基因。在这些情况下， 可使用包括反式PCR、质粒拯救和/或基因组文库构建在内的其他程序。成功的结果是其中单个TAIL或SAIFF PCR片段包含T-DNA边界序列和拟南芥属 基因组序列。一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记，通过与公开可用的拟南芥属基 因组的序列比对来鉴定候选基因。具体地讲，最靠近35S增强子元件/T-DNA RB的注释基因是激活的基因的候选基因。为了验证鉴定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合伪克隆的可 能性，用一个T-DNA中的寡核苷酸和一个候选基因特异性的寡核苷酸进行对基因组DNA的 诊断PCR。将提供PCR产品的基因组DNA样本理解为表示T-DNA插入序列。该分析也验证 了其中一种以上的插入事件发生在相同品系中的情况，例如，在TAIL和/或SAIFF PCR分 析中鉴定是否有多个不同基因组片段。实施例4鉴定激活标记exst基因通过如实施例2A所述的筛选程序获取exst基因。如实施例3所述进行激活标记 基因的鉴定。进一步分析显示具有改变的根构造的一个品系(112299)。提取来自品系的 DNA，使用T-DNA左边界内的引物通过连接介导PCR(Siebert等人，(1995)Nucleic Acids Res. 23 =1087-1088)建立T-DNA插入序列。一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标 记，通过与完全拟南芥属基因组的序列比对鉴定候选基因。将其中一个鉴定的插入位点鉴 定为嵌合插入；左边界的T-DNA序列经测定位于T-DNA插入序列的两端。这仍然是可能的 位于靠近T-DNA右边界的增强子元件足够靠近以对附近的候选基因产生效应。在这种情况 下，假定右边界位置位于插入位点，并将侧接插入位点的两个基因选作候选基因。其中一个 最靠近嵌合插入序列的35S增强子的基因是AT3G03650 (核苷酸245-1744，对应于ORF (SEQID NO: 33)，它编码 EXST 蛋白(SEQ ID NO :34)，本文称为 EXOSTOSIN 家族或 EXST。实施例5A 骀证候诜拟南芥属某因(AT3G03650)经由转仆Jl丨拟南芥属Φ 曾强棺物根构诰的 能力可将候选基因转化到拟南芥属中并在35S启动子作用下过表达。如果在转基因品 系中观察到与亲本激活标记品系相同或相似的表型，则将该候选基因认为是拟南芥属中验 证过的“前导基因”。可直接测试拟南芥属AT3G03650基因促进拟南芥属中的根构造的能力。拟南芥属AT3G03650cDNA用寡核苷酸进行PCR扩增，寡核苷酸导入attBl (SEQ ID NO 39)序列，其上游为ATG起始密码子的共有起始序列(CAACA)和AT3G03650DNA (SEQ ID NO 57)的蛋白编码区的前25个核苷酸，以及attB2 (SEQ ID NO :40)序列和包括所述 cDNA终止密码子的蛋白编码区的最后25个核苷酸。使用invitrogenTMGateway 技术，用 pD0NRT7Zeo(InvitrogenTM，图 2 ;SEQ ID NO 2)进行 MultiSite Ga teway BP 重组反应。 这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pD0NRTM/ZeO移除并定向地克 隆了该在旁侧具有attBl (SEQ IDNO 39)和attB2 (SEQ ID NO 40)位点的PCR产物而得到 入门克隆PHP28732。用紧接Invitrogen Ga teway Cl转化插入序列上游的1. 3-kb35S启动子构建 称为pBC-yellow(图4，SEQ ID NO 4)的16. 8_kb T-DNA基的二元载体，所述插入序列包 含侧接attRl和attR2序列的ccdB基因和氯霉素抗性基因(CAM)。该载体也包含在Rd29a 启动子控制下的YFP标记用于选择转化过的种子。使用InvitrogenTMGateway :技术，对包含定向克隆PCR产物和pBC-yellow 的入门克隆进行MultiSite Gateway LR重组反应。这使得能够迅速地和定向地克隆 pBC-yellow中在35S启动子后的AT3G03650基因。使用如实施例1所述的相同农杆菌介导的转化程序将35S-AT3G03650基因构建体 导入野生型拟南芥属生态型Col-O中。通过存在的荧光YFP标记选择转基因Tl种子。按照如实施例2A所述的程序对荧 光种子进行根构造检测分析。每个构建体使用6个平板对转基因Tl种子进行再筛选。包 含从荧光种子中分选出的未转化的Columbia种子的两个平板(每个架子)作为对照。每个构建体有六个平板进行统计学分析，并检测平板上生长的植物数量和它们的
平均WinRHIZO 得分t间的趋势。WinlUIIZO 得分进行趋势归一化处 ，对应于构建体的 根得分除以野生型根得分。实施例5B在氮限制条件下筛选候选基因也可筛选如上文实施例5A所述通过存在的荧光标记YFP选择的转基因Tl种子在 氮限制条件下生长的抗性。为此目的，32个转基因个体可在一个有0. 4mM謂03或601111 KNO3 的平板上紧邻着32个野生型个体生长。如果一个品系显示与对照的统计意义上的显著差 异，可认为该品系是经验证的氮缺乏抗性品系。在掩蔽该平板图像以移除背景颜色后，每个 个体收集两个不同的测量数据总罗赛塔面积和进入绿色区的颜色百分比。使用色调、饱和度和强度数据(HIS)，绿色区由色调50至66组成。总罗赛塔面积用作植物生物量的量度， 而绿色区通过剂量-响应研究已经显示指示氮同化作用。实施例5C 骀证候诜拟南芥属某因(AT3G03650)经由转化讲入拟南芥属后改善棺物氮为丨用 率的能力如实施例5B所述来筛选能够在氮限制条件下生长的转基因种子。在第10、11、12和13天评价植物。与野生型植物相比，表达拟南芥属候选基因 (AT3G03650)的转基因个体当在包含有限浓度的氮(0. 4mMKN03)的培养基上生长时，不被 验证为氮缺乏抗性植物。实施例5Df帝舰鄉‘前口口口胃就每个过表达品系而言，将十二个Τ2植株播种在96孔微滴定板上，所述微滴定板 包含 2mM MgSO4,0. 5mM KH2PO4, ImM CaCl2, 2. 5mM KC1,0. 15mM Sprint 330,0. 06mM FeSO4, 1 μ M MnCl2 · 4H20,1 μ M ZnSO4 · 7H20, 3 μ M H3BO3,0. 1 μ M NaMoO4,0. 1 μ M CuSO4 · 5H20,0. 8mM 硝酸钾，0. 蔗糖，ImM MES，200 μ M 溴酚红和 0. 40 % Phytage 1 (ρΗ 测定 培养基)。培养基PH使得溴酚呈红色，ρΗ指示染料是黄色的。将四个品系种植于每个平板中，每个平板上包含12个野生型个体和来自某一已 经显示具有改善的硝酸盐摄取(阳性对照)的品系的12个个体，在每个96孔微滴定板上 总计有72个个体可使用基于网络的随机序列发生器测定每个平板上的品系顺序。不将种 子种植在96孔微滴定板上的Row A或Row H中。每个实验使用四个平板，使得每个品系 分析最多48株植物。在暗处、4°C条件下保持平板三天以使种子分层，然后在22°C，光照 和黑暗交替条件下水平放置六天。光周期为16小时光照；8小时黑暗，平均光照强度为 200mmol/m2/S。旋转并振动每个架子中的平板。在第八或第九天(生长五天或六天)，通过 记录培养基颜色为粉红色、桃色、黄色或无发芽来评价幼苗状态。然后移除每孔上的植物和 /或种子。将每个培养基块状物转移到1. 2mL微滴定管中，并置于96孔深微滴定板中的相 应孔中。将包含2μ M荧光素的等体积水加入每个1.2mL微滴定管中。用土壤覆盖平板并 用液体循环高压灭菌。将每个管充分混合，从每个管中移除等分试样并分析培养基中保留 的硝酸盐的量。如果t检验显示某个品系与野生型对照具有显著差异(ρ < 0. 05)，则可认 为所述品系是验证过的具有改善的硝酸盐摄取品系。实施例5E验证包含候选拟南芥属基因(AT3G03650)的转基因品系氮摄取增加。如实施例5D所述筛选氮摄取增加的转基因种子。与不过表达拟南芥属候选基因的野生型植物相比，过表达拟南芥属候选基因 (AT3G03650)的转基因个体经验证不是具有改善的硝酸盐摄取品系。实施例6cDNA文库的组成；cDNA克隆的分离和测序cDNA文库可通过许多可用的方法中的任一种制备。例如，通过首先根据生产商的 说明书(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)制备 Uni-ZAP XR 载体中的 cDNA文库，可将cDNA引入质粒载体中。根据Stratagene提供的说明书，将Uni-ZAP XR文库转 换成质粒文库。转换后，cDNA插入序列将会包含在质粒载体pBluescript中。此外，可用 T4DNA 连接酶(New England Biolabs)将 cDNA 直接引入预切的 BluescriptII SK(+)载体 (Stratagene)中，然后根据生产商的说明书(GIBCO BRLProducts)将其转染进DHlOB细胞 中。一旦cDNA插入序列处于质粒载体中，从随机选取的含重组pBluescript质粒的细菌菌 落制备质粒DNA，或者用对插入的cDNA序列旁侧的载体序列特异性的引物，通过聚合酶链 式反应扩增插入的cDNA序列。将扩增的DNA插入序列或质粒DNA在引物标记法测序反应 (dye-primer sequencing reaction)中进行测序，以产生部分cDNA序列(表达序列标记或 “EST”；参见 Adams 等人，1991，Science252 1651-1656)。用 Perkin Elmer Model 377 荧 光测序仪分析所得的EST。用改进的转座规程产生全长插入序列(FIS)数据。从归档的甘油原种作为单一菌 落回收确定了 FIS的克隆，并通过碱性裂解分离质粒DNA。将分离的DNA模板在基于PCR的 测序反应中与载体引物M13正向和反向寡核苷酸反应并上样至自动化的测序仪上。通过与 对其进行FIS查询的初始EST序列进行序列比对来确认克隆鉴定。将确认的模板通过基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Tyl转座因子 (Devine和Boeke，1994，Nucleic Acids Res. 22 :3765_3772)的Primer Island转座试剂盒 (ΡΕ Applied Biosystems, Foster City, CA)进行转座。该体外转座系统在整个一组大DNA 分子中随机地放入独特的结合位点。随后将转座的DNA用于通过电穿孔转化DHlOB电-感 受态细胞(Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。转座因子含有另外的可选标 记(称为 DHFR ;Fling 和 Richards，1983，Nucleic Acids Res. 11 :5147_5158)，使得能在琼 脂平板上仅双重筛选含有整合的转座子的那些亚克隆。从每次转座反应随机地选择多个亚 克隆，通过碱性裂解制备质粒DNA，并用对转座子内的结合位点特异性的独特引物从转座事 件位点向夕卜进行测序(ABI Prism dye-terminator ReadyReaction mix)。收集序列数据(ABIPrism Collectiohs)并用 Phred和 Phrap (Ewing，等人，1998， Genome Res. 8 175—185 ；Ewing 禾口 Green，1998，Genome Res. 8 186-194)进 亍装配。Phred 是一种公用软件程序，该程序再次读取ABI序列数据，再次调出(recall)碱基，赋质量值， 并将碱基序列(base call)和质量值写入可编辑的输出文件中。Phrap序列组装程序使用 这些质量值来增加组装的序列重叠群的准确度。通过Consed序列编辑器(Gordon等人， 1998，Genome Res. 8 :195_202)检查装配序列。在一些克隆中，cDNA片段对应基因的3’ -端的一部分并且不会涵盖整个开放阅 读框。为了获得上游信息，使用两种不同规程中的一者。这两种方法中的第一种方法导致 产生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二种方法导致产生含有整个开放阅读框的 片段。这两种方法均使用两轮PCR扩增以从一个或多个文库获得片段。有时基于以前的知 识(特定的基因应该存在于某些组织中)选择文库，有时则进行随机地选择。获得相同基 因的反应可平行地在若干文库中进行，或者在文库池中进行。文库池通常用3至5个不同 的文库制备并且使其归一化而成为一致的稀释度。在第一轮扩增中，两种方法均使用载体 特异性的(正向)引物，同时还使用基因特异性的(反向)引物，该正向引物对应位于克隆 5’_端处的载体的一部分。第一种方法使用与已知基因序列的一部分互补的序列，而第二种 方法使用与3’-非翻译区(也称为UTR)的一部分互补的基因特异性引物。在第二轮扩增中，两种方法均使用套式引物组。按照生产商的说明书，用市售试剂盒将所得DNA片段连接 SpBluescript 载体中。该试剂盒选自可得自包括 Invitrogen (Carlsbad，CA)、Promega Biotech (Madison，WI)和 Gibco_BRL(Gaithersburg，MD)在内的一些供应商的许多试剂盒。 如上所述，将质粒DNA通过碱性裂解方法分离并进行测序和用Phred/Phrap进行装配。实施例7cDNA克降的鉴定编码EXST样多肽的cDNA克隆能通过这样鉴定进行BLAST (基本的局部比对搜索 工具)；Altschul等人，1993，J. Mol. Biol. 215 403-410 ；还可参见国立卫生研究院国家医 学图书馆的国家生物技术信息中心的万维网址上对BLAST算法的解释)，寻找与BLAST"nr” 数据库中所包含序列(包括所有非冗余GenBank CDS翻译序列、源自3-维结构Brookhaven 蛋白质数据库(Protein Data Bank)、SWISS-PROT蛋白质序列数据库的最新的主要版本、 EMBL和DDBJ数据库的序列)的相似性。采用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN 算法，能分析如实施例6中获得的cDNA序列与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的 DNA序列的相似性。在所有的阅读框中翻译DNA并用NCBI提供的BLASTX算法(Gish和 States, 1993,Nat. Genet. 3 266~272)比较与“nr”数据库中包含的所有可公开获得的蛋白 质序列的相似性。为方便起见，通过BLAST计算仅仅偶然观察到cDNA序列与所搜索的数据 库中所包含序列的匹配的P-值(概率)在本文报导为“pLog”值，它代表所报导的P值的 负对数。因此，PLog值越大，cDNA序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。将受分析的EST与上述Genbank数据库进行比较。通过使用BLASTn算法 (Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402.)对杜邦专利数据库比较具有序 列同源共有区域或重叠区域的核苷酸序列，可找到含更5'端或3'端序列的EST。在两个 或更多个核酸片段之间存在共有或重叠序列时，该序列可装配成单一的连续核苷酸序列， 从而使最初的片段在5'或3'初始方向上延伸。一旦确定了最5'的EST后，可如实施例6 中所述，通过全长插入序列来确定其完整的序列。可用tBLASTn算法，通过将已知基因(来 自专有来源或公开数据库的已知基因)的氨基酸序列对EST数据库进行比较，可找到属于 不同物种的同源基因。tBLASTn算法对所有6个阅读框都翻译了的核苷酸数据库进行氨基 酸查询的搜索。该搜索允许不同物种之间的核苷酸密码子使用的差异，并且允许密码子简 并。实施例8制备cDNA文库并且鉴定编码EXST样多肽的cDNA克隆如实施例6所述制备提供来自玉米、大豆、稻、向日葵、瓜尔、小麦、佛罗里达苦树 (Florida bitterbush)、燕麦、棉、苋属植物和卡诺拉的不同组织的mRNA的cDNA文库，下文 描述了该文库。下面描述了该文库的特征。M 2来自玉米、大豆、稻、向日 葵、瓜尔、小麦、佛罗里达苦树(Floridabitterbush)、燕 麦、棉、苋属植物和卡诺拉的cDNA文库 使用来自表1中列出的克隆的EST序列进行的BLASTX搜索揭示所述多肽与来自 稻的 EXST 样多肽的相似性(GI No. 115476598、115487106、115452759 和 115441893 分别对 应于SEQ ID NO :35、36、37、和38。表3显示了表2列出的克隆的全长cDNA插入序列(“全 长插入序列”或“FIS”)的BLASTP结果。每个cDNA插入序列编码完整蛋白或功能性蛋白 (“完全基因序列”或“CGS”)。表3和表4也显示了使用Clustal V比对方法、使用默认参 数计算的每对氨基酸序列的序列同一性百分比值^t 3编码EXST样多肽同源物的多肽序列的BLAST结果和同一性百分比 图15A-15I示出以下全长氨基酸序列的多重比对SEQ ID NO :15、17、19、21、23、
25、27、29、31、34、以及 SEQ IDNO :35、36、37、和 38。图 16 给出图 15A-15I 中给出的每对序 列的序列同一性百分比和趋异值。
用LASERGENE 生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的 Megalign 程序 进行序列比对和同一性百分比计算。用带默认参数(空位罚分=10，空位长度罚分= 10)的 Clustal 比对方法(Higgins 和 Sharp，1989，CAB I OS. 5 :151_153)进行序列的多重 比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数为KTUPLE 1，空位罚分=3，窗口 = 5， DIAGONALSSAVED = 5。序列比对和BLAST打分以及概率显示包含本发明cDNA克隆的核酸片段编码EXST样多肽。编码与EXST和EXST样多flt同源的多flt的序歹U的BLAST结果 实施例9制各含有拟南芥属前导某因(AT3G03650)的同源物的棺物表汰裁体可使用诸如BLAST(基本的局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool) ；Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215 :403_410，1993 ；也参见美国国家卫生研究院 (National Institutes ofHealth)国立医学图书馆(National Library of Medicine)的 国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的万维网网 址上对BLAST算法的解释)之类的序列比较算法，鉴定与前导EXST基因同源的序列。同源 EXST样序列，如实施例8所述的序列，可通过任何一种以下方法进行PCR扩增。方法1 (基于RNA的方法)如果EXST同源物的蛋白编码区域的5’和3’序列信 息是可用的，可如实施例5A所述设计基因特异性引物。可将RT-PCR用于植物RNA来获得 含有EXST蛋白编码区的核酸片段，该EXST蛋白编码区旁侧为attBl (SEQ ID NO 39)和 attB2 (SEQ ID NO 40)序列。引物可含有起始密码子上游的共有Kozak序列(CAACA)。方法2 (基于DNA的方法)作为另外一种选择，如果编码EXST多肽同源物的基因 的cDNA克隆是可用的，可以PCR扩增完整cDNA插入序列(含有5'和3'非编码区)。可 设计正向引物和反向引物，使它们分别或者含有attBl序列和在该cDNA插入序列前面的载 体特异性序列或者含有attB2序列和在该cDNA插入序列后面的载体特异性序列。对于克 隆进载体pBluescript SK+中的cDNA插入序列，可使用正向引物VC062 (SEQ IDNO 41)和 反向引物 VC063(SEQ ID NO :42)。方法1和方法2可根据本领域技术人员已知的步骤进行修改。例如，方法1的引物 可含有限制性酶切位点而不是attBl和attB2位点，用于后来将PCR产物克隆进含有attBl 和attB2位点的载体内。另外，方法2可涉及从cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因组DNA 扩增。可利用BP重组反应将通过任一种上述方法获得的PCR产物与Gateway 供体载体(例如 pDONRTM/Zeo(InvitrogenTM， 2 ；SEQ ID NO 2)或 pD0NR 221 (Invitroge ， 图3;SEQ ID NO 3)组合。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从 pD0NR 221移除并定向地克隆了该在旁侧具有attBl和attB2位点的PCR产物而得到入门 克隆(entryclone)。使用Invitrogen Ga teway Clonase 技术，然后可将来自入门克
隆的同源EXST样基因转移到合适的目的载体中以获得植物表达载体，所述载体用于拟南芥属、玉米和大豆，如 pBC-Yellow (图 4 ;SEQ IDNO :4)、PHP27840 (图 5 ;SEQ ID NO :5)或 PHP23236(图6 ；SEQ IDNO 6)，以获取植物表达载体，分别用于拟南芥属、大豆和玉米。作为另外一种选择，可进行多个入门克隆和合适的目的载体之间的 MultiSite Ga teway LR重组反应以产生表达载体。该程序的一个实例在实施例14A中有
所描述，该实施例描述了用于转化玉米品系的玉米表达载体的构建。实施例10用验证过的拟南芥属前导基因及其同源物制备大豆表汰载体并转化大豆为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属 (Arabidopsis)基因(AT3G03650)和来自不同物种的对应同源物。可将实施例5A和9中所述的入门克隆用于将每个基因定向克隆进PHP27840载体 (图5，SEQ ID NO 5)中，使得该基因的表达处于SCPl启动子的控制下。然后可用包含编码本多肽的序列的表达载体转化大豆胚。为了诱导体细胞胚，可将子叶(长度为3_5mm，从大豆品种A2872的表面灭菌的未 成熟种子解剖出来)于26°C在光下或黑暗下培养6-10周。然后切取体细胞胚(其产生次 生胚)并将其置于合适的液体培养基内。在重复选择增殖为早期球形阶段胚的体细胞胚的 簇后，按下面的描述保持该悬浮液。可将大豆胚发生悬浮培养物在26°C下在摇床(150rpm)上的35mL液体培养基中 保持，荧光光照采用16 8小时(白天/黑夜)的时间表。通过将大约35mg组织移植进 35ml液体培养基中，每两周将培养物进行传代培养。然后可通过基因枪轰击方法(Klein等人，Nature (London) 327 =70-73,1987 ；美国 专利4，945，050)转化大豆胚发生悬浮培养物。杜邦公司的BiolistiCTMPDS1000/HE仪器 (氦气改进型)可用于这些转化。可用于帮助大豆转化的可选标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子 (Odell 等人，Nature 313 :810_812，1985)、来自质粒 pJR225 (来自大肠杆菌；Gritz 等人， Gene 25 :179_188，1983)的潮霉素磷酸转移酶基因以及胭脂碱合成酶基因的3'区构成的 嵌合基因，该胭脂碱合成酶基因来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) Ti质粒的 T-DNA。可用于帮助大豆转化的另一种可选标记基因是来自大豆或拟南芥属的除草剂抗性 乙酰乳酸合成酶(ALS)基因。ALS是支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成中 的第一共用酶。已经鉴定出ALS中的突变导致对三类ALS抑制剂中的某些或全部具有抗性 (美国专利5，013，659 ；其全部内容以引用的方式并入本文)。除草剂抗性ALS基因的表达 可处于SAM合成酶启动子(美国专利申请US-2003-0226166-A1 ；藉此将其全部内容以引用 的方式并入本文)的控制下。将如下物质(依次)加入50 μ L 60mg/mL的1 μ m金颗粒悬浮液5 μ LDNA (1 μ g/ μ L),20 μ L亚精胺(0. 1Μ)和50 μ L CaCl2 (2. 5Μ)。然后搅拌该颗粒制备物三分钟，在微量离心机(microfuge)中离心10秒并移除上清液。然后将DNA包覆的颗粒在400 μ L 70%乙醇中洗涤一次并再悬浮于40 μ L无水乙醇中。可将DNA/颗粒悬浮液用超声波处理三次，每 次一秒钟。然后将5 μ L该DNA-包覆的金颗粒装载至每个宏载体盘上。将大约300_400mg两周大的悬浮培养物置于60X 15mm的空培养皿中并用吸管将 残留的液体从组织移除。对于每次转化实验，大约5-10板的组织受到正常轰击。膜破裂压 力设定为IlOOpsi并将腔室抽成28英寸汞柱的真空。将组织置于离阻挡网大约3. 5英寸 的地方并轰击三次。轰击后，可将组织分成两份并放回液体培养基中，如上所述进行培养。轰击后五至七天，用新鲜培养基更换该液体培养基，并在轰击后七至十二天，用含 有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基更换。可每周更换这种选择培养基。轰击后七至八周，可 观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚芽发生簇长出来。移出分离的绿色组织并将其 移植进单独的烧瓶中以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系 当成是独立的转化事件。然后可将这些悬浮培养物作为未成熟胚进行传代培养和维持，或 者通过使单独体细胞胚成熟并萌发而再生成整株植株。可通过在土壤中培养植物并在用WinRHIZO 分析总根质量前洗涤根部来测量大 豆增大的根构造。然后可分析用验证过的基因转化大豆植株以研究相对于对照或参照植株的农学 特性。例如，在多种环境条件(如氮限制条件、干旱等)下的氮利用效率、产量增强和/或 稳定性。实施例11立轰击用验i!a寸白射以南芥属前导基因转化玉米为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来 自不同物种的对应同源物。可将实施例5A中所述的Gateway 入门克隆用于将每种基因定向克隆进玉 米转化载体中。玉米基因的表达可处于组成型启动子的控制下，例如玉米泛素启动子 (Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 12 :619_632，1989，以及 Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 18 675-689,1992)。然后可通过下面的方法将上述重组DNA构建体引入玉米细胞中。可从源于近交玉 米系H99和LH132杂交的发育中的颖果切取未成熟的玉米胚。在授粉后10至11天分离 胚，这时它们长为1. 0至1. 5mm。然后将胚以轴线侧朝下放置并与琼脂糖硬化的N6培养基 (Chu等人，Sci. Sin. Pekingl8 :659-668，1975)接触。将胚在27°C下保持在黑暗中。从这 些未成熟胚的胚鳞增生出易脆的胚发生愈伤组织，该愈伤组织由未分化的细胞块构成，在 胚柄结构上长有体细胞原胚状体和胚状体。可将从该原外植体分离的胚发生愈伤组织在N6 培养基上培养，并每两至三周在这种培养基上进行传代培养。可将质粒 p35S/Ac (得自 Peter Eckes 博士，Hoechst Ag, Frankfurt, Germany) 用于转化实验以便提供可选标记。该质粒含有pat基因(见欧洲专利公布0242236)，该基 因编码草胺膦乙酰转移酶(PAT)。酶PAT赋予对除草性谷氨酰胺合成酶抑制剂例如草胺膦 的抗性。p35S/Ac的pat基因处于来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，Nature 313:810-812(1985))和胭脂碱合成酶基因的3'区的控制下，该胭脂碱合成酶基因来自根 癌农杆菌Ti质粒的T-DNA。
可将粒子轰击法(Klein等人，Nature 327 :70_73 (1987))用于将基因转移至愈伤 组织培养细胞。根据该方法，利用下面的技术用DNA包覆金颗粒(直径Iym)。将IOyg质 粒DNA加入到50 μ L金颗粒悬浮液(每mL60mg)中。将氯化钙(50 μ L的2. 5Μ溶液)和亚 精胺游离碱(20 μ L的1. OM溶液)加入到该颗粒中。再加入这些溶液过程中涡旋该悬浮液。 10分钟后，将试管粗略地离心(以15，OOOrpm进行5秒钟)并移除上清液。将该颗粒再悬 浮于200 μ L的无水乙醇中，再次离心并移除上清液。再次进行乙醇冲洗并将颗粒再悬浮于 终体积为30 μ L的乙醇中。可将DNA包覆的金颗粒等分试样(5yL)置于Kapton 飞行圆 盘(Bio-Rad Labs)的中心。然后使用Biol is t ic PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA)，采用IOOOpsi的氦气压、0. 5cm的间隙距离以及1. Ocm的飞行距离，将颗粒加 速射入玉米组织中。对于轰击，将胚发生组织置于琼脂糖硬化的N6培养基上的滤纸上。组织布置成薄 薄一层，并覆盖直径为约5cm的圆形区域。然后可将包含组织的培养皿置于离阻挡网大约 8cm的PDS-1000/He的腔室内。然后将该腔室中的空气抽出至28英寸汞柱的真空。利用在 击波管中氦气压力达到IOOOpsi时破裂的可破裂膜，宏载体被氦气冲击波加速。
轰击后七天，可将组织转移至N6培养基中，该培养基含有双丙氨磷(每升5mg)并 缺少酪蛋白或脯氨酸。组织继续在这种培养基上缓慢生长。另外两周后，可将组织转移至含 有bialaphos的新鲜N6培养基上。六周后，在某些装有补充了双丙氨磷的培养基的盘上， 可辨别直径约Icm的区域上有活性生长的愈伤组织。当在选择培养基上传代培养时，这些 愈伤组织可继续生长。通过首先将组织簇转移到补充有0. 2mg每升的2，4_D的N6培养基中，可从该 转基因愈伤组织再生出植物。两周后，可将组织转移至再生培养基中(Fromm等人，Bio/ Technology 8:833-839(1990))。可再生出转基因的TO植株并按照下面的HTP步骤确定它们的表型。可收集Tl种子。可栽培Tl植株并分析表型变化。利用图像分析可定量下面的参数可收集并定量 植株面积、体积、生长速率以及颜色分析。与合适的对照植物比较，导致根构造改变或上文 列出的任何一种农学特性改变的表达构建体可被认为是拟南芥属前导基因在玉米中发挥 功能以改变根构造或植物构造的证据。此外，可通过直接转化或者从单独转化的品系基因渗入而将含有证实的拟南芥属 基因的重组DNA构建体导入玉米品系内。可对转基因植株(或者是近交的或者是杂交的)进行更有力的基于田间的实验来 研究在多种环境条件下(如营养物质的改变和水的可利用性)的根构造或植物构造、产量 提高和/或抗根倒伏性。也可进行后续的产量分析，以测定含有验证过的拟南芥属前导基因的植物与不包 含验证过的拟南芥属前导基因的对照(或参照)植物相比较时是否具有改善的产量表现。 包含验证过的拟南芥属前导基因的植物相对于对植物将具有改善的产量，优选地在不利环 境条件下产量损失减少50%，或在不同环境条件下相对于对照植物将具有提高的产量(例 如，与对照植物相比，在不限制氮的条件下产量提高。实施例12
电穿孔根癌农杆菌LBA4404
将电穿孔感受态细胞(40 μ 1)，例如根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) LBA4404 (含有ΡΗΡ10523)在冰上解冻(20-30分钟)。ΡΗΡ10523含有用于T-DNA转移的VIR 基因、农杆菌属的低拷贝数质粒复制起始区、四环素抗性基因以及用于体内DNA生物分子 重组的cos位点。同时，将电穿孔管(electroporation cuvette)在冰上冷却。将该电穿 孔仪的设置调节至2. lkV。将DNA等分试样(0. 5 μ L JT (US 7，087, 812)亲代DNA，在低盐缓冲液或双蒸H2O 中的浓度为0.2 μ g-1. Oyg)与解冻的农杆菌细胞混合，同时仍然保持在冰上。将该混合 物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1-2分钟。通过按下“pulse (脉冲)”键两次 (理想的是获得4. 0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后， 将0.5ml 2xYT培养基(或SOCmedium)加入到电穿孔管并转移至15ml Falcon管中。将细 胞在28-30°C、200-250rpm下培养3小时。将250 μ 1的等分试样散布在#30Β (ΥΜ+50 μ g/mL奇放线菌素)板上并在28_30°C 下培养3天。为了增加转化体的数目，可进行如下两个可选步骤中的其中一个选择1 用30 μ 1 15mg/ml的利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体 抗性基因。这种附加的选择消除了在使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时观察到的一 些污染克隆。选择2 进行两次重复的电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。转化体的鉴定选取四个独立的克隆并划痕接种在AB基本培养基+50mg/mL奇放线菌素的平板 (#12S培养基)上用于分离单个克隆。将平板在28°C下培养2-3天。对于每个推定的共整合体选取单个克隆并将其接种在4ml具有50mg/l的奇放线 菌素的#60A中。将该混合物在28°C下摇动培养24小时。采用Qiagen Miniprep+可选的 PB洗涤，从4ml培养物分离出质粒DNA。将DNA在30 μ 1中洗提。如上所述，将2 μ 1的等 分试样用于电穿孔20 μ 1 DH10b+20 μ 1 ddH20。可任选地，可将15 μ 1等分试样用于转化75-100 μ 1的Invitrogen Library Efficiency DH5 α。将细胞散布在LB培养基+50mg/mL奇放线菌素的平板(#34T培养基) 上并将其在37°C下培养过夜。对于每个推定的共整合体选取3至4个独立的克隆并将其接种在4ml具有50 μ g/ ml奇放线菌素的2xYT(#60A)上。将细胞在37°C下摇晃培养过夜。使用QIAprep Minipr印，用任选PB洗涤液(稀释成50 μ 1)从4mL培养物中分 离质粒DNA，并且8 μ 1质粒DNA用SalI (使用JT亲本和ΡΗΡ10523作对照物)进行消化。对于4个质粒利用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化(使用 亲代DNA和PHP10523作为对照)，这4个质粒代表2种具有正确SalI消化模式的推定共整 合体。推荐电凝胶(Electronic gel)用于比较。作为另一种选择，对于高通量应用，例如针对Gaspe Flint衍生的玉米品系(实施 例15-17)所描述的，代替通过限制性酶切分析来评价所得的共整合载体，可将三个克隆同 时用于如实施例13所述的感染步骤。实施例13
农杆菌介导的玉米的转化为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来 自不同物种的对应同源物。农杆菌介导的玉米转化基本上按照Zhao等人，Meth. Mol. Biol. 318 315-323(2006)中描述的方法进行(还可参见Zhao等人，Mol. Breed. 8 :323_333 (2001)和 1999年11月9日公布的美国专利5，981，840，以引用的方式将该文献并入本文)。该转化 过程涉及细菌接种、共培养、静止期、选择以及植株再生。1.未成熟胚的制备从颖果切取未成熟胚并置于装有2mL PHI-A培养基的2mL微型管中。2.胚的农杆菌感染以及共培养2. 1感染步骤用ImL微量吸移管移出PHI-A培养基并加入ImL农杆菌悬浮液。轻轻倒置该管进 行混合。将该混合物在室温下培养5分钟。2. 2共培养步骤用ImL微量吸移管将农杆菌悬浮液从感染步骤中移出。使用无菌刮刀将胚从管中 刮出并转移到IOOX 15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。确定胚的朝向，使得胚轴在 培养基表面上朝下。将具有胚的平板在20°C下于黑暗中培养3天。L-半胱氨酸可用于共 培养阶段。采用标准二元载体，补充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对于回收 稳定的转基因事件是至关重要的。3.推定他转基因事件的诛雇向IOOX 15mm培养皿中的PHI-D培养基的每平板中转移10个胚，保持朝向，并用 parafilm将培养皿密封。将平板在黑暗中于28°C培养。预计在6_8周将看见活性生长的 推定事件(作为浅黄色胚组织)。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的，并且几乎看不见脆 性组织生长。取决于生长速率，以2-3周的间隔将推定的转基因胚组织转移到新鲜的PHI-D 平板上进行传代培养。记录事件。4. TO植株的再生将在PHI-D培养基上增殖的胚组织转移至100 X 25mm培养皿中的PHI-E培养基 (体细胞胚成熟培养基)进行传代培养并在28°C下，在黑暗中培养约10-18天，直至体细胞 胚成熟。将具有良好限定的盾片和胚芽鞘的个体成熟体细胞胚芽转移到PHI-F胚芽发芽培 养基中，并且在28°C于光中(约80μΕ，来自冷光灯或同等荧光灯)培养。在7-10天，将约 IOcm高的再生植株盆载于园艺混合物中，并使用标准园艺方法使其受冷而变得耐寒。用于植物转化的培养基1. PHI-A :4g/L 的 CHU 基础盐、1. OmL/L 的 1000X Eriksson 维生素混合物、0. 5mg/L 的盐酸硫胺素、1. 5mg/L的2，4-D、0. 69g/L的L-脯氨酸、68. 5g/L的蔗糖、36g/L的葡萄糖， PH为5. 2。在使用前加入100 μ M的乙酰丁香酮，过滤灭菌。2. PHI-B 无葡萄糖的PHI_A，2，4_D增加至2mg/L，蔗糖减少至30g/L并且补充有 0. 85mg/L的硝酸银(过滤灭菌)，3. Og/L的固化剂(gelrite)，100 μ M的乙酰丁 香酮(过滤 灭菌)，ρΗ为5. 8。3. PHI-C 无固化剂和乙酰丁香酮的PHI-B，2，4-D减少至1. 5mg/L并且补充有8. Og/L的琼脂，O. 5g/L的Ms-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，100mg/L的羧苄青霉素(过滤灭 菌)。4. PHI-D 补充有3mg/L的双丙氨磷bialapho (过滤灭菌)的PHI-C。5. PHI-E 4. 3g/L 的 Murashige and Skoog(MS)盐(Gibco，BRLl 1117-074)、0· 5mg/ L的烟酸、0. lmg/L的盐酸硫胺素、0. 5mg/L的盐酸吡哆醇、2. Omg/L的甘氨酸、0. lg/L的肌 醇、0. 5mg/L的玉米素(Sigma，商品目录号:Z_0164)、lmg/L的吲哚乙酸(IAA)、26· 4μ g/L 的脱落酸(ABA)、60g/L的蔗糖、3mg/L的双丙氨磷(过滤灭菌)、100mg/L的羧苄青霉素(过 滤灭菌)、8g/L的琼脂，pH为5. 6。6. PHI-F 不含玉米素、IAA, ABA的PHI-E ；蔗糖减少至40g/L ；用1. 5g/L的固化剂 代替琼脂；pH*5.6。通过首先将组织簇转移到补充有0. 2mg每升的2，4_D的N6培养基中，可从该转 基因愈伤组织再生出植物。两周后，可将组织转移至再生培养基(Fromm等人，(1990)Bio/ Technology 8 :833_839)中。
可进行对转基因TO植株和Tl植株的表型分析。可分析Tl植株表型的变化。利用图像分析，可在植株生长过程中在多个时间点， 分析Tl植株在植株面积、体积、生长速率方面的表型变化并且可进行颜色分析。可如实施 例20中所述分析根构造的改变。可对农学特性的改变进行后续分析，以测定含有验证过的拟南芥属前导基因的植 株在与不含有验证过的拟南芥属前导基因的对照(或参照)植株比较时是否具有至少一种 农学特性的改善。还可在多种环境条件下研究改变。导致根构造显著改变的表达构建体将被认为是拟南芥属基因在玉米中发挥功能 以改变根构造的证据。实施例14A禾U用农杆If介导的转仆j勾建H有拟南芥属前导基因(AT3G03650)的玉米表达裁 体用拟南芥属EXST 基因(AT3G03650)在 NAS2 (SEQ ID NO 44)和 G0S2 (SEQ ID NO 45)启动子控制下制备玉米表达载体。PINII是终止子(SEQID NO 48)使 用Invitrogen Gateway 技术，如实施例5A所述制备的、包含拟南芥属EXST基因 (AT3G03650)的入门克隆PHP 28739被用于独立的Gateway LR反应1)组成型玉米G0S2启动子入门克隆(PHP28408，图11,SEQ IDNO 11)和PinII终 止子入门克隆(PHP20234，图9，SEQ IDNO 9)形成目的载体PHP28529 (图10，SEQ ID NO 10)。将所得载体命名为PHP28976。2)根玉米NAS2启动子入门克隆(PHP22020,图12，SEQ ID NO 12)和PinII终止 子入门克隆(PHP20234，图 9，SEQ ID NO 9)形成目的载体 PHP28529 (图 10，SEQ ID N0: 10)。将所得载体命名为PHP28913。目的载体PHP28529被加到每个最终载体(PHP28983和PHP28984)中，也是1)RD29A启动子黄色荧光蛋白=PinII终止子盒，用于拟南芥属种子分选。2)泛素启动子moPAT/红色荧光蛋白融合基因=PinII终止子盒，用于转化选 择和玉米种子分选。
实施例14Bm^H^m^m EXST某因及ι同源物的玉米表汰力如聿体 可使用实施例5Α和14Α所述的程序将拟南芥属EXST基因及其来自玉米和其他物 种的对应同源物(表1)转化到玉米品系中。能如实施例5Α和14Α所述制备具有拟南芥属 EXST基因及其来自玉米和其他物种的对应同源物(表1)的玉米表达载体。除了 G0S2或 NAS2启动子，其他启动子，例如(但不限于)泛素启动子、S2A和S2B启动子、玉米R00TMET2 启动子、玉米Cyclo、CR1BI0、CRWAQ81以及玉米ZRP2. 4447，可用于引导EXST和EXST样基 因在玉米中的表达。此外，多种终止子，例如但不限于PINII终止子，可用于完成所关注基 因在玉米中的表达。实施例14C#用农杆菌介导转化，用拟南芥属前导某因(AT3G03650)禾Π来自1；他,物禾中的对应 同源物来转化玉米品系然后可将最终载体(玉米中表达的载体，实施例14Α和B)分别电穿孔进入 包含 ΡΗΡ10523 的 LBA4404 农杆菌(图 7 ；SEQ ID NO :7，Komari 等人，Plant J 10 165-174(1996), NCBI GI :59797027)中，以产生用于玉米转化的共整合载体。该共整合载 体是通过最终载体(玉米表达载体)与PHP10523的重组(通过每个载体上含有的COS重 组位点)而形成。除了实施例14A-B中所述的表达盒，该共整合载体还含有农杆菌菌株以 及农杆菌介导转化所需的基因(ΤΕΤ、ΤΕΤ、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR Cl、VIR C2、 VIR G、VIR B)。转化玉米品系可如实施例13所述进行。实施例15用于转化Gaspe Flint衍生的玉米品系的目的载体PHP23236和PHP29635的制备目的载体 PHP23236(图 6，SEQ ID NO :6)是通过用质粒 PHP23235 (图 8，SEQ ID NO 8)转化包含质粒PHP10523(图7，SEQ ID NO 7)的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的 共整合产物而获得。目的载体PHP23236可被用于如实施例16所述的与入门克隆的重组反 应，以产生用于转化GaspeFlint衍生的玉米品系的玉米表达载体。所关注的基因的表达是 处于泛素启动子(SEQ ID NO 46)的控制之下。PHP29635(图 13，SEQ ID NO :13)是通过用质粒 PII0XS2a_FRT87 (ni)m(图 14，SEQ ID NO 43)转化包含质粒PHP10523的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获 得。目的载体PHP29635可被用于如实施例16所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于 转化Gaspe Flint衍生的玉米品系的玉米表达载体。所关注的基因的表达是处于S2A启动 子(SEQ ID NO 47)的控制之下。实施例16用于转化Gaspe Flint衍生的玉米品系的质粒的制备使用Invitrogen Gateway 重组技术，可如实施例5A和9所述制备包含拟南 芥属EXST基因(AT3G03650)或玉米EXST样同源物的入门克隆，该克隆用于定向克隆每 个基因进入目的载体PHP23236 (实施例15)用于在泛素启动子下表达，或进入目的载体 PHP29635(实施例15)用于在S2A启动子下表达。每一种表达载体都是用于农杆菌介导玉 米转化的T-DNA 二元载体。Gaspe Flint衍生的玉米品系可如实施例17中所述用表达构建体转化。
实施例17用骀iifi寸的拟南芥属前导某因和来自1；他,物种的对应同源物转化GasDeFlint衍牛的玉米品系为了检查所得表型，玉米植株可如实施例16所述进行转化以过表达拟南芥属 AT3G03650基因和来自其他物种的同源物，如表1列出的基因。除了如实施例16所述的启 动子之外，其他启动子，例如S2A和S2B启动子、玉米R00TMET2启动子、玉米Cyclo、CRlBI0、 CRffAQ81以及玉米ZRP2. 4447，可用于引导EXST和EXST样基因在玉米中的表达。此外，多 种终止子，例如但不限于PINII终止子，可用于完成所关注基因在Gaspe Flint衍生的玉米 品系中的表达。受体棺株受体植株细胞可来自具有短的生活周期(“快速循环”)、大小减少以及转化潜能高 的单一玉米品系。对玉米典型的这些植株细胞是来自可公开获得的Gaspe Flint(GF)品系 品种的植株细胞。一种可能的候选植株品系变种是GFXQTM(Quick Turnaround Maize (快 速周转玉米)，选择用于在温室条件下生长的Gaspe Flint的可公开获得形式)的Fl杂交 种，其在Tomes等人的美国专利申请公开2003/0221212中有所公开。从该品系获得的转基 因植株具有如此小的大小使得它们可在4英寸的盆中生长(是正常大小的玉米植株所需空 间的1/4)并且它们在少于2. 5个月时间内成熟。(传统上，一旦转基因植株适应温室后需 要3. 5个月来获得转基因TO种子。)另一合适的品系是GS3(高度可转化的品系)XGaspe Flint的双单倍体品系。还有另一种合适的品系是携带引起较早开花、高度减小或这两者的 转基因的可转化的优良近交系。转化规程任何合适的方法可用于将转基因引入玉米细胞中，包括但不限于利用基于农杆菌 载体的接种类型的步骤，如实施例9所述。转化可在受体(靶标)植株的未成熟胚上进行。精确的生长和植株跟踪将由转化的玉米胚产生的转基因(TO)植株的事件群体在受控的温室环境中栽 培，该温室使用改良的随机分块(block)设计以降低或消除环境误差。随机分块设计是这 样一种植株布局，在该布局中，实验植株被分成组(如，每组30株植株)，称为块，而每株植 株随块被随机分配一个位置。对于一组30株植株，24株转化的实验植株和6株对照植株(具有设定好的表型 的植株)(总起来说称为“重复组”)被置于盆中，这些盆在位于温室内的桌子上布置成阵列 (也叫做重复组或块)。每株植株(对照植株或实验植株)随块被随机分配一个位置，所述 的块映射一个唯一的、温室物理位置以及映射该重复组。在单次实验中多个30株植株的重 复组中的每一个可栽培在相同的温室中。应该确定重复组的布局(布置方式)以使对空间 的要求最小以及温室内的环境影响最小。这样一种布局可称为压缩的温室布局。对于加入特定的对照组的一种替代方法是鉴定不表达所关注基因的那些转基因 植株。可将诸如RT-PCR之类的多种技术应用于定量评价引入基因的表达水平。可将不表 达转基因的TO植株与表达转基因的那些植株进行比较。在整个评价过程中鉴定和跟踪事件群体中的每株植株，并且从那些植株收集的数 据自动与那些植株相关联，使得所搜集的数据可与由该植株携带的转基因关联。例如，每个植株容器具有机器可读的标签(例如通用货单代码(UPC)条形码)，该标签包含了关于植物 身份的信息，身份信息继而又与温室位置相关，使得从植物获得的数据可自动与该植物相 关联。作为另外一种选择，可使用任何有效的、机器可读的植物识别系统，例如二维矩阵代码或甚至是射频识别标签(RFID)，其中数据被接收并由射频接收器/处理器进行翻译。 参见美国公布的专利申请2004/0122592，其以引用方式并入本文。利用三维成像讲行表型分析对TO事件群体中的每株温室植株(包括任何对照植株)分析所关注的农学特性， 并且以这样一种方式记录或存储每株植株的农学数据，该方式使得数据与该植株的辨识数 据(见上面)相关联。可利用与上述类似的实验设计，可在Tl代中完成对表型(基因效 应)的确认。在植物的整个温室生活周期中，利用定量的非破坏性成像技术在表型水平上来分 析TO植株以评价所关注的性状。优选的是，将数字成像分析仪用于整株植物的自动多维分 析。成像可在温室内进行。将两个摄像系统(位于顶部和侧面)和用于旋转植物的装置用 于从所有侧面观察植物和成像。从每株植物的顶部、前面和侧面采集图像。所有的三个图 像一起提供了足够的信息用于评价每株植物的生物量、大小和形态。由于植物在第一片叶片从土壤显现出来时到植物处于它们发育的末期时大小的 改变，最好是从顶部以较高的放大倍率记录植物发育的早期。这可通过利用完全由成像软 件控制的自动变焦镜头系统来完成。在单次成像分析操纵中，进行如下事件(1)将植株传送至分析仪区域内，旋转 360度以便其机器可读标签可被读取，并且让其保持静止直至其叶片停止移动；(2)获取侧 面图像并将其输入数据库；(3)将植株旋转90度并再次让其保持静止直至其叶片停止移 动，以及(4)将该植株传送出分析仪。每24小时的周期让植物至少6个小时处于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。成像仪器可使用任何合适的成像仪器，包括但不限于可从LemnaTec GmbH (ffurselen， Germany)商购获得的光谱数字成像仪。获取图像并用具有1/2" IT Progressive Scan IEE CCD成像设备的LemnaTec Scanalyzer HTSLT-0001-2进行分析。该成像照相机可配备有自 动变焦、自动调节光圈和自动聚焦。可利用LemnaTec软件设定所有的照相机设置。优选的 是，对于主要组成成像分析仪的仪器差异小于约5%，对于次要组成成像分析仪的仪器差异 小于约10%。软件成像分析系统包括用于颜色和构造分析的LemnaTec HTS Bonit软件程序和用于 存储约500，000次分析的数据(包括分析数据)的服务器数据库。原始图像和分析过的图 像储存在一起以允许用户根据需要进行再次分析。可将数据库连接至成像硬件用于自动的 数据收集和存储。可将多种市售的软件系统(如Matlab等)用于定量判读成像数据，并且 这些软件系统中的任何一种均可应用于图像数据集。传送系统具有植物旋转装置的传送系统可用于将植物传送至成像区域并在成像过程中选择植物。例如，将最多4株植物(每株最高高度为1.5m)装上汽车，该汽车在循环的传送系 统上行进并通过成像测量区域。在这种情况下，该单位(成像分析仪和传送环线)的总占 有面积为约5mX5m。可扩大传送系统以同时容纳更多植物。将植物沿传送环线传送至成像区域并对每 株植物分析最多50秒。获取植物的三个视图。传送系统以及成像设备应该能够用于温室 环境条件。舰任何合适的照明模式可用于图像采集。例如，可在暗背景上使用顶部照明。作为 另外一种选择，可采用使用白色背景的顶部照明和背部照明的组合。应该将被照亮的区域 围起来以确保恒定的照明条件。遮蔽物应该长于测量区域使得能保持恒定的光条件而不需 要打开和关闭门。作为另一种选择，可以变化照明以引起转基因(如，绿色荧光蛋白(GFP)、 红色荧光蛋白(RFP))的激发或者引起内源性(如叶绿素)荧光基团的激发。
基于三维成像的牛物量评价为了更好地评价生物量，应该从至少三个轴(优选顶部视图和两个侧面(侧面1 和侧面2)视图)获取植物图像。然后分析这些图像以将植物从背景(盆和花粉控制袋(如 果适用的话))分离。可通过如下计算来评价植物的体积
体积(体素)=V顶部面积(像素)X^侧面1面积(像素)侧面2面积(像素)在上面的等式中，体积和面积的单位是“任意单位”。在该体系中，任意单位完全足 以检测基因对植物大小和生长影响，因为所需的是检测与实验平均值或对照平均值的差值 (正较大和负较小两者)。大小(如面积)的任意单位可通过将物理参照加入到成像过程 而轻易地转化成物理量度。例如，可在顶部成像过程和侧面成像过程两者中均包括已知面 积的物理参照。基于这些物理参照的面积，可测定转换因子以允许从像素转换为面积单位， 例如平方厘米(cm2)。物理参照可以是或可以不是独立的样本。例如，具有已知直径和高度 的盆足可用作物理参照。颜饩分类成像技术还可用于确定植物颜色以及用于将植物颜色归为各种衍生类型。将图像 颜色归属于颜色类型是LemnaTec软件的固有特色。使用其他图像分析软件系统，可通过多 种计算方法确定颜色分类。对于植物大小和生长参数的测定，一种有用的分类方案是定义一种单一颜色方 案，包括绿色的两种或三种色调，此外，还有关于缺绿病、坏死和漂白(在这些条件出现时) 的颜色类型。还使用了背景颜色类型，其包括图像中的非植物颜色(例如盆和土壤颜色)， 并将这些像素特别地从测定大小中排除。在受控的恒定照明下分析植物，使得可以定量一 株植物内随时间推移的任何改变，或者植物之间或植物不同分枝之间的任何改变(如季节 差异)。除了其在测定植物的大小、生长中的有效性，颜色分类还可用于评价其他产量构 成性状。对于这些其他产量构成性状，可使用另外的颜色分离方案。例如，称为“保绿度 (staygreen) ”的性状(已经将其与产量的提高相关联)可通过颜色分类来评价，该颜色分类将绿色色调与黄色和棕色色调(其指示老化的组织)相分离。通过将这种颜色分类应用 于在TO或Tl植物生活周期末获取的图像，可鉴定绿色的量相对于黄色和棕色(例如，可表 示为绿色/黄色比率)增加的植物。这种绿色/黄色比率具有显著差异的植物可被鉴定为 携带影响这种重要农学特性的转基因。熟练的植物学家将认识到可指示植物健康或应激反应的其他植物颜色(花青素) 的出现，以及认识到其他颜色分类方案可提供对基因在与这些响应相关的性状方面的作用 的进一步度量。棺物构造分析改变植物构造参数的转基因也可用本发明鉴定，包括诸如最大高度和宽度、节间 距离、叶与茎之间的角度、在节处开始的叶片数以及叶片长度。LemnaTec系统软件可如下用 于测定植物构造。在第一成像步骤中将植物简化至其主要的几何构造，并且随后基于该图 像可进行不同构造参数的参数化鉴定。或者是单独地或者是组合地修改任何这些构造参数 的转基因可通过应用此前所述的统计方法来鉴定。花粉脱落日期花粉脱落日期是转基因植物中要分析的一个重要参数，并且可通过活性雄花第一 次出现在植物上来测定。为了找到雄花目标，通过颜色对茎的上端进行分类以检测黄色或 紫色花药。然后将这种颜色分类分析用于定义活性花，活性花继而可用于计算花粉脱落日 期。作为另外一种选择，花粉脱落日期和其他易于在视觉上检测到的植物属性(如授 粉日期、第一穗丝日期)可由负责进行植物看护的工作任人员来记录。为了使数据完整性 和过程效率最大化，通过利用相同的由LemnaTec光谱数字分析设备利用的条形码来跟踪 该数据。可将具有条形码阅读器的电脑、掌上设备或笔记本电脑用于使记录观察时间、植物 标识符的数据捕捉变得容易，以及使捕捉数据的操纵者变得舒适。植物的取向以接近商业栽培的密度种植的成熟玉米植物通常具有平面的构造。也就是说，植 物具有一可清晰分辨的宽的侧面和窄的侧面。对来自植物宽侧的图像进行测定。对于每株 植物，给其赋予一个明确界定的基本取向以获得宽侧图像与窄侧(edgewise)图像之间的 最大差别。将顶部图像用于测定植物的主轴，而将额外的旋转装置用于在开始主图像采集 前将植物转至合适的取向。实施例18在氮限制条件下筛选Gaspe Flint衍生的玉米品系转基因植物将含有两个或三个剂量的Gaspe Flint-3与一个剂量的GS3 (GS3/ (GaSpe-3)2X或GS3/(Gaspe-3)3X)，并且对于显性转基因将会以1 1分离。将植物在 Turface中栽培，每天用ImM KNO3生长培养基和2mMKN03或更高的生长培养基浇洒四次(见 图23)。在ImM KNO3培养基中培养的对照植物的绿度较小，产生较少的生物 量并且在开花 期具有较小的穗(关于样本数据的示例请参见图24)。用统计学测定处理株之间所观察到的差异是否真有差异。图18示出了一种方法， 该方法将字母放在数值后面。同一列中其后具有相同字母(不是字母组)的那些值不具有 显著的差异。使用该方法，如果在一列中的值的后面没有字母，则该列中的这些值的任何之间不存在显著的差异，换句话讲，该列中的所有这些值是均等的。与无效转基因相比较，转基因的表达将导致植物在ImM KNO3中具有改善的植物生 长。因此生物量和绿度(如实施例17所述)将在生长期间进行监控，并与无效转基因植物 比较。生长、绿度、开花期穗的大小的改善将表明氮耐受性增强。实施例19 nm^mmm^mrn^m (AT3G03650)的玉米品系的产量分析可通过直接转化或者从单独转化的品系基因渗入而将含有证实的拟南芥属基因 的重组DNA构建体导入玉米品系内。可以将转基因植物(自交系或杂种)进行更强的基于田间的试验，以研究在不同 环境条件(例如改变水和营养物质可利用性)下的产量增加和/或稳定性。可对产量进行后续分析以测定含有验证过的拟南芥属前导基因的植株在与不含 有验证过的拟南芥属前导基因的对照植株比较时，在不同环境条件下是否具有产量的改 善。可以测得这两种植物的产量都有所减少。包含验证过的拟南芥属前导基因的植物具有 相对于对照植物更少的产量损失，优选50%更少的产量损失。实施例20测定玉米根构造改变的测定法测定转基因玉米植物在幼苗期、花期或成熟期的根构造改变。测量玉米植物的根 构造改变的测定法包括但不限于下面概述的方法。为了便于手动或自动地测定根构造改 变，可让玉米植物在透明的盆中生长。1)根量(干重)。让植物在Turface中生长。将烘干的根和根组织称重并计算根 冠比。2)侧根分枝的水平。侧根分枝的程度(如侧根数量、侧根长度)通过这样测定 从完整的根系进行二次取样，将样本用平面扫描器或数码相机成像并用WinRHIZO 软件 (Regent Instruments Inc.)分析。3)根带宽度的测量。根带是植物成熟时在温室栽培盆的底部形成的根带或根量。 测量成熟时根带的厚度(以mm为单位)，作为对根量的粗略评价。4)节生根的计数。从支持培养基(support medium)(如盆栽混合物(potting mix))中分离出根后，可测定上部节位处出现的冠根数。另外，可测量冠根和/或支柱根的 角度。对节生根和节生根的分枝量的数值分析形成对上述手动方法的另一种延伸。对提取的有关根表型的所有数据进行统计分析(通常为t检验)，以将转基因根与 非转基因姊妹株植株的根进行比较。在多个事件和/或构建体涉及该分析的情况下，还可 使用单因素方差分析。实施例21氮利用效率幼苗检测分析法使用颜色标记物将转基因事件的种子分成转基因种子(杂合子)和无效转基因 种子。进行两组不同的随机分配处理，使用所有处理的9个平行测定，使每个随机分块 (block)有排列成6排9列的54个盆。将每个处理的两个种子种在4英寸的方盆中，盆中包含在8英寸交错中心上的 Turface，每天用包含以下营养物质的溶液浇灌四次
ImM CaCl2 2mM MgSO4 0. 5mM KH2PO4 83ppm Sprint3303mM KClImM KNO31 μ M ZnSO41 μ M MnCl23 μ M H3BO4 1 μ M MnCl2 0. 1 μ M CuSO4 0. 1 μ M NaMoO4植物出苗后，将其减少到每盆一个种子。在收获时从盆中移除植物，并且将Turface从根部洗脱。使根与苗分开，把根置于纸袋中并且在70°C干燥70小时。将干燥后 的植物部分(根和苗)称重并置于50mL的圆锥管中，管中有大约205/32英寸的钢球，在 涂料振荡器中进行振荡研磨。将大约30mg研磨组织(记录重量用于后续的调节)在2mL 20% H2O2和6M H2SO4中水解30分钟，水解温度为170°C。冷却后加水至20mL，充分混合，移 除50 μ L等分试样并将其加入950 μ L IM Na2CO3中。通过将100 μ L该溶液置于96孔板的 每个孔中，然后加入50yL OPA溶液，使用该溶液中的氨评价减少的总植物氮。测定荧光强 度，激发(excitation) = 360nM/发射(emission) = 530nM，并且与溶解在相似溶液并用 OPA溶液处理过的NH4Cl标准品进行比较。OPA溶液-5 μ L巯基乙醇+ImL OPA储备液OPA 储备液-50mg 邻苯二醛(0PA_Sigma#P0657)溶解于 1. 5mL 甲醇 +4. 4mL IMBorate 缓冲液 pH9· 5 (3. 09g H3BO4+Ig NaOH，溶于 5OmL 水中)+0· 55mL 20% SDS使用这些数据，测量以下参数，并且使用Student t检验比较参数平均值与无效参 数平均值植物生物重量根生物量苗生物量根/苗比率植物氮浓度植物总氮在每个随机分块中使用最近邻计算以及使用完全随机设计(CRD)模型的方差分 析(Analysis of Variance，AN0VA)计算差异。使用F统计，通过将总随机分块处理平均 面积除以总随机分块误差平均面积计算每个随机分块的总处理效应。计算更大的Student t检验的概率用于比较每个转基因平均值与合适的无效转基因(或者批构建体或单个事件 的无效转基因平均值)平均值。使用最小值(P <t)0.1作为临界值。实施例22句,含拟南芥ilexostosin某因的玉米幼苗的根与来自不句,含exostosin某因的幼 苗的根的比较分析如实施例14A所述制备玉米表达载体，该载体包含玉米NAS2启动子(SEQ ID NO 44)和拟南芥属 exostosin 基因(SEQ ID NO :33)。如实施例14C所述经由农杆菌介导的转化，通过制备共合体载体(PHP29009)完成 玉米转化，并使用如实施例20所述的幼苗检测分析法对根进行检测。在温室实验中检测分析所有10个来自构建体PHP29009 ((ZM-NAS2 AT-EXST)的 事件，其中每个事件使9个植株在Turface培养基中生长至V4阶段。种子来自Tl代(来 自从TO植株收集的穗)。对照实验包括15株生长至相同阶段的批无效植物(非转基因的 分离植物)。使用完全随机分组设计种植种子。在种植后18天收获植株，此时它们达到V4阶段。洗涤根部并从苗中分开收集。在用分析天平称量干重之前，所有样本进行烘干。发现在与批无效对照植物进行比较时，总计4个事件具有显著的根干重变化、5个 事件具有显著的苗干重变化、7个事件具有显著的根苗比率变化，ata P值小于0.1。六个 事件，#4、#5、#6、#7、#9、和#10，具有显著的根/苗比率提高，并且1个事件，#1，具有显著 的根/苗比率降低。进行t检验分析以显示每个转基因事件和对照之间的显著差异。显示了每种特性 的P值 根干重、苗干重、以及根-苗比率。粗体字表示转基因植物具有比对照植物更高的 值。具有小于0. 1的P值的那些值用星号(*)指示。 表5转基因和对照幼苗的比较 实施例23在田间标准氮和低氮条件下的转基因杂交体产量测试在2007季，在Johnston，Iowa的农场中进行田间实验。实验包括表达由玉米NAS2启动子启动的exostosin基因的七个(7)转基因事件。 一个对照是批杂交7个事件的非无效转基因与无效转基因。其它对照是转化中使用的野生 型。所有植物是由常见自交系受试者生成的杂交体。施加两次处理，其中植物在“标准”氮条件下或在氮“耗尽”(stress)条件下进行 处理。“标准”处理包括以2501b每英亩的比率施加氮肥。氮“耗尽”条件通过在其中土壤 含氮量已经在以前多年的缺乏肥料条件下被作物耗尽的土地上种植转基因和非转基因对照玉米品系获得。氮耗尽与标准氮处理相比引起30%的产量减少，并且需要每英亩IOOlb的施肥比
率。用2排小块土地进行实验，其密度为每英亩32000株植物。在标准氮和氮耗尽处理中
分别包括四次⑷和六次(6)重复。在2007年5月21日种植植物，并在2007年9月26
日和27日一起收获。以每英亩蒲式耳测量产量。
表6以相对于无效转基因对照植物的产量增加百分比综述了实验的以每英亩蒲
式耳计算的总产量数据。由于缺少种子，事件#7不在标准氮条件下进行测试。总体上，在
低氮条件下的3个事件和在标准氮条件下的四个(4)事件显示与批无效转基因对照相比，
产量显著增加。所有测试的事件都显示了相对于无效转基因植物的产量增加趋势。&低复禾口碰氮劃牛〒絲酬勿獻式。 实施例24全基因组关联作图分析可使用关联作图方法来鉴定与玉米根构造改变有关的标记。在该关联分析中，能够通过对几千个基因(基因位点)进行DNA测序分析玉米品系的集合。所述品系能够包括优良种质、可商购获得的栽培变种、以及其它公开的品种。将获得对根构造改变或至少一种农学特性改变的表型评分。具有极端表型的品系 将相对于全基因组关联测试(使用2X2相依表的Fisher精确检验)中的基因型进行测试。 将使用基于结构的关联分析，其中使用标记数据控制群体结构。将使用基于模型的集分析 软件，Structure，该软件由 Pritchard 等人开发，(Genetics 155 :945_959 (2000))，同时使 用几百个标记的数百个玉米优良自交系的单倍型数据评价混合系数并且将自交系分配成 许多亚群。这降低了假阳性的发生概率，假阳性可能由对关联作图统计的群体结构效应引 发。使用Kuiper统计测试两个分配是否相同，并且测试给定标记与在给定亚群中的单倍型 禾口表型之间的关联(Press等人,Numerical Recipes in C,第二版,Cambridge University Press, NY(2002))。在至少一个亚群中的至少一个强峰值指示显著标记-性状关联(例如ρ <0.001)。CM中给出了标记位点，零点是染色体起始处的第一个(距着丝点最远端)已知 标记。这些图谱位点不是绝对的，而是提供基于内源遗传图谱的图谱位点预测。实施例25候诜基因关联作图设计引物以扩增来自单个自交系的一部分候选基因位点。获取该位点上的每个自 交系的基因型，并且测试多态基因座与根构造改变或至少一种农学特性改变相关的统计意 义上的显著性。
权利要求
在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出改变的根构造。
2.权利要求1的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
3.植物，所述植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含(a)可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多 肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、 或34进行比较时具有至少50 %的序列同一性，或(b)抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操 作地连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具有 至少50%的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或( )源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来 源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列 具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出至少一 种农学特性的改变。
4.权利要求3的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
5.权利要求3的植物，其中在不同的环境条件下与所述未包含所述重组DNA构建体的 对照植物比较时，所述植物表现出所述至少一种农学特性的所述改变。
6.权利要求5的植物，其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、或病害中的至少一种。
7.权利要求5的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
8.权利要求7的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
9.权利要求3的植物，其中所述至少一种农学特性选自绿度、产量、生长速率、生物 量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含 氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含 量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养 组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、茎倒伏、植株高度、穗长和收获指数。
10.权利要求9的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
11.权利要求3的植物，其中在与所述对照植物比较时，所述植物表现出所述至少一种 农学特性的增强。
12.权利要求11的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
13.改变植物根构造的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较 时具有至少50%的序列同一性；以及(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且在与未包含所述重组DNA构建体的对照植 物比较时表现出改变的根构造。
14.权利要求13的方法，所述方法还包括(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体，并且在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根 构造。
15.评价植物根构造的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较 时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时所述转基因植物的根构造。
16.权利要求15的方法，所述方法还包括(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体；以及(e)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时所述子代植物的根构造。
17.评价植物根构造的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较 时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体；以及(d)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时所述子代植物的根构造。
18.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较 时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(C)测定所述转基因植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现 出至少一种农学特性的改变。
19.权利要求18的方法，所述方法还包括(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体；以及(e)测定所述子代植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出 至少一种农学特性的改变。
20.权利要求19的方法，其中所述测定步骤包括测定所述转基因植物在不同的环境 条 件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的 改变。
21.权利要求19的方法，其中所述测定步骤(e)包括测定所述子代植物在不同的环 境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性 的改变。
22.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较 时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出 至少一种农学特性的改变。
23.权利要求22的方法，其中所述测定步骤包括测定所述转基因植物在多种环境条件 下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
24.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种 调控元件，所述调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具有 至少50%的序列同一性，或者(B)所述(a) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或( )源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来 源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列 具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现 出至少一种农学特性的改变。
25.权利要求24的方法，其中所述测定步骤包括测定所述转基因植物在不同的环境条 件下与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
26.权利要求24的方法，所述方法还包括(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 抑制DNA构建体；以及(e)测定所述子代植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出 至少一种农学特性的改变。
27.权利要求26的方法，其中所述测定步骤(e)包括测定所述子代植物在多种环境条 件下与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改 变。
28.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种 调控元件，所述调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具有 至少50%的序列同一性，或者(B)所述(a) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或( )源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来 源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列 具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体，并且当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植 物比较时表现出改变的根构造；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 抑制DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出 至少一种农学特性的改变。
29.权利要求28的方法，其中所述测定步骤包括测定所述转基因植物在多种环境条件 下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
30.改变植物根构造的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种 调控元件，所述调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具有 至少50%的序列同一性，或者(B)所述(a) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或( )源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来 源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列 具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；以 及(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体，并且其中当与未包含所述抑制DNA构建体的对 照植物比较时，所述转基因植物表现出改变的根构造。
31.权利要求30的方法，所述方法还包括(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体，并且其中当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时，所述子代植 物表现出改变的根构造。
32.评价植物根构造的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种 调控元件，所述调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具有 至少50%的序列同一性，或者(B)所述(a) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或( )源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来 源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列 具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)评价当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时所述转基因植物的根构造。
33.权利要求32的方法，所述方法还包括(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 抑制DNA构建体；以及(e)评价当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时所述子代植物的根构造。
34.评价植物根构造的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种 调控元件，所述调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 进行比较时具有 至少50%的序列同一性，或者(B)所述(a) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或( )源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来 源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列 具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 抑制DNA构建体；以及(d)评价当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时所述子代植物的根构造。
35.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码EXST或EXST样多肽的核酸序列或所述核酸序列的全长互补序列，所述EXST或EXST样多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法 在与SEQ ID NO :15、或31进行比较时具有至少80%的序列同一性，或者在与SEQ ID NO: 25进行比较时具有至少95 %的序列同一性。
36.权利要求35的多核苷酸，其中基于Clustal比对方法，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID N0:15、或31的氨基酸序列具有至少85%的序列同一性。
37.权利要求35的多核苷酸，其中基于Clustal比对方法，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID N0:15、或31的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
38.权利要求35的多核苷酸，其中基于Clustal比对方法，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO :15、或31的氨基酸序列具有至少95%的序列同一性。
39.权利要求35的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQIDN0:15、25、或31。
40.权利要求35的多核苷酸，其中所述核酸序列包含SEQID NO 14、24、或30。
41.载体，所述载体包含权利要求35的多核苷酸。
42.重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一种调控序列可操作地连接的权 利要求35的多核苷酸。
43.用于转化细胞的方法，所述方法包括用权利要求35的多核苷酸来转化细胞。
44.细胞，所述细胞包含权利要求42的重组DNA构建体。
45.用于生产植物的方法，所述方法包括使用权利要求35的多核苷酸来转化植物细胞 以及从转化过的植物细胞再生植物。在另一些实施方案中，包含任何前述多核苷酸的载体 和重组构建体以及包含所述重组构建体的细胞。
46.对基因变异进行作图的方法，所述基因变异表现出植物根构造的改变和/或植物 至少一种农学特性的改变，所述方法包括(a)使两种植物品种杂交；并且(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异选自SEQID 14、16、18、20、22、24、26、28、30、或 33 的核酸序列；或(ii)编码选自 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 的多肽的核酸序列;其中所述评价是使用选自下组的方法进行的RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分析。
47.用于改变植物根构造和/或改变植物至少一种农学特性的分子育种方法，所述方 法包括(a)使两种植物品种杂交；并且(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异⑴选自 SEQ ID NO :14、16、18、20、22、24、26、28、30、或 33 的核酸序列；或(ii)编码选自 SEQ ID NO :15、17、19、21、23、25、27、29、31、或 34 的多肽的核酸序列；其中所述评价是使用选自下组的方法进行的RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分析。
全文摘要
本发明描述了尤其可用于改变植物的根构造的分离的多核苷酸和多肽及重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组分(例如植物或种子)、以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接在植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码可用于改变植物根构造的多肽。
文档编号C07K14/415GK101848931SQ200880112248
公开日2010年9月29日 申请日期2008年10月30日 优先权日2007年10月31日
发明者D·托姆斯, G·塔拉米诺, H·萨凯, S·M·艾伦, S·V·廷盖, S·卢克, X·牛 申请人:纳幕尔杜邦公司;先锋高级育种国际公司