专利名称：一种氮川三乙酸亲和分子层的制备方法
技术领域：
本发明属于生物学方法中的亲和分子层制备方法技术领域，具体涉及氮川三乙酸 (NTA)亲和分子层的制备方法。
背景技术：
具有亲和分子层表面的载体介质如亲和树脂、生物膜和生物芯片等，因其可以特异结 合带特定标签的蛋白或多肽序列，已被广泛应用于蛋白质组学、细胞生物学、微生物学等 领域，成为生物学的重要分析方法和手段之一。在众多的亲和分子层中，具有氮川三乙酸 分子结构的亲和分子层是4交为常用的一种，它能特异性地结合带有6个组氨酸标签的蛋白 或多肽序列。但目前大多数商品化的NTA亲和分子层产品均存在亲和分子层结合能力不高 或多次使用后结合能力下降的缺点，主要原因是现有的制备方法无法控制NTA分子之间的 距离，使得6个组氨酸标签在有限的距离内只能结合3个位点中的1-2个，结果导致蛋白 或多肽序列与NTA分子结合强度不够，容易在使用过程中发生脱落。《中国生物工程杂志》 (2009， 29. 1: 44-49 )所报道的本发明人课题组先前制备NTA亲和芯片的方法，只是通过 活化芯片表面的羧基基团将NTA分子偶联于芯片表面而得到单层的NTA亲和分子层，该方 法仅停留在商品化亲和芯片的水平，未能解决亲和分子层结合能力不足的问题。至今未见 有其它制备NTA亲和分子层方法的报道。
发明内容
本发明提出一种氮川三乙酸(NTA)亲和分子层的制备方法，以有效增强NTA亲和分 子层的结合能力并可适用于各种载体介质，克服现有NTA亲和分子层结合能力不高或多次 使用后结合能力下降的缺点。
本发明氮川三乙酸亲和分子层的制备方法，其特征在于包括如下步骤
(1) 将具有羧基基团的分子层置于含有0. 01-10M N-羟基丁二酰亚胺和0. 01-10M乙 基-二曱氨基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡不少于1分钟；
(2) 将经步骤(1)浸泡活化的分子层置于含有0. OlmM-10M氮川三乙酸水溶液中浸 泡不少于1分钟；
(3 )重复步骤(1)和步骤(2 )不少于1次；
(4 )将分子层置于含有0. 01-10M盐酸乙醇胺水溶液中浸泡不少于1分钟。 本发明利用 一个NTA分子具有3个羧基基团的特点，采用羧基活化试剂和NTA溶液先
后浸泡的方式，通过二次或多次活化-偶联NTA分子，从而制备出具有两层或多层NTA分
子结构的亲和分子层。
与现有已公开的制备NTA亲和芯片的方法相比较，由于本发明采取二次或多次活化-
偶联NTA分子，所制备的NTA亲和分子层具有更高的NTA分子密度，并能在空间上与6个
组氨酸标签相适应，确保了 6个组氨酸在相应的空间范围内可以与NTA分子全部结合，从
而有效地增强了 NTA亲和分子层的结合能力。
图1为实施例1制备的和现有商品化的NTA亲和芯片分别结合相同浓度PH蛋白的表
面等离子共振信号曲线；
图2为实施例2制备的和现有商品化的NTA亲和芯片分别结合相同浓度SET蛋白的表
面等离子共振信号曲线。
图3为实施例3制备的和现有商品化的NTA亲和芯片分别结合相同浓度Trmb蛋白的 表面等离子共振信号曲线；
图4为实施例4制备的和现有商品化的NTA亲和芯片分别结合相同浓度CFlm25蛋白 的表面等离子共振信号曲线。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明方法作进一步具体说明。 实施例1:
(1)将具有羧基基团的分子层置于含有0. 2MN-羟基丁二酰亚胺与0. 8M乙基-二甲氨 基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡12分钟以进行分子活化；
(2 )将活化的分子层置于含有4mM NTA水溶液中浸泡20分钟以偶联NTA分子； (3 )重复步骤(1 )和(2 ) 1次，以二次活化-偶联NTA分子；
(4 )将分子层置于含有2M盐酸乙醇胺水溶液中浸泡6分钟以封闭活化基团，取出后 用水洗净并在室温下氮气吹干，便得到氮川三乙酸亲和分子层。
图1为采用本实施例制备的和现有商品化的NTA亲和芯片(表面为氮川三乙酸亲和分 子层)分别结合浓度均为9mg/L的PH蛋白的表面等离子共振信号曲线；其中处于上面的 曲线a为采用本实施例制备的NTA亲和芯片结合PH蛋白的表面等离子共振信号曲线，处 于下面的曲线b为商品化的NTA亲和芯片结合PH蛋白的表面等离子共振信号曲线。
从图1可以证明本实施例中上述制备得到的是氮川三乙酸亲和分子层。
从图中的曲线可以看到，采用本实施例制备的NTA亲和芯片与现有商品化的NTA亲和 芯片相比较，前者结合蛋白的量明显高于后者，且结合蛋白后，前者曲线平稳，说明蛋白 结合牢固不解离，而后者曲线明显下滑，说明蛋白结合不稳定而发生解离，由此可见，采 用本实施例制备的NTA亲和芯片有效增强了 NTA亲和分子层的结合能力，克服了现有商品 化的NTA亲和分子层结合能力不高的缺点。
实施例2:
(1 )将具有羧基基团的分子层置于含有0. OlMN-羟基丁二酰亚胺与0. 01M乙基-二曱 氨基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡15分钟以进行分子活化；
(2 )将活化的分子层置于含有0. OlmM NTA水溶液中浸泡25分钟以偶联NTA分子； (3 )重复步骤(1 )和(2 ) 5次，以多次活化-偶联NTA分子；
(4 )将分子层置于含有0. 01M盐酸乙醇胺水溶液中浸泡15分钟以封闭活化基团，取 出后用水洗净并在60。 C的温度下烘干，便得到氮川三乙酸亲和分子层。
图2为采用本实施例制备的和现有商品化的NTA亲和芯片(表面为氮川三乙酸亲和分 子层)分别结合浓度均为15mg/L的SET蛋白的表面等离子共振信号曲线；其中处于上面的曲线c为采用本实施例制备的NTA亲和芯片结合SET蛋白的表面等离子共振信号曲线， 处于下面的曲线d为现有商品化的NTA亲和芯片结合SET蛋白的表面等离子共振信号曲线。 从图2可以证明本实施例中上述制备得到的是氮川三乙酸亲和分子层。 从图中的曲线可以看到，采用本实施例制备的NTA亲和芯片与现有商品化的NTA亲和 芯片相比较，前者结合蛋白的量明显高于后者，且结合蛋白后，前者曲线平稳，说明蛋白 结合牢固不解离，而后者曲线明显下滑，说明蛋白结合不稳定而发生解离，由此可见，采 用本实施例制备的NTA亲和芯片有效增强了 NTA亲和分子层的结合能力，克服了现有商品 化的NTA亲和分子层结合能力不高的缺点。 实施例3:
(1 )将具有羧基基团的分子层置于含有10MN-羟基丁二酰亚胺与10M乙基-二曱氨基 丙基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡1分钟以进行分子活化；
(2 )将活化的分子层置于含有10M NTA水溶液中浸泡1分钟以偶联NTA分子； (3 )重复步骤(1 )和(2 ) 3次，以多次活化-偶联NTA分子；
(4)将分子层置于含有10M盐酸乙醇胺水溶液中浸泡1分钟以封闭活化基团，取出 后用水洗净并在室温下自然晾干，便得到氮川三乙酸亲和分子层。
图3为采用本实施例制备的和现有商品化的NTA亲和芯片(表面为氮川三乙酸亲和分 子层)分别结合浓度均为llmg/L的Trmb蛋白的表面等离子共振信号曲线；其中处于上面 的曲线e为采用本实施例制备的NTA亲和芯片结合Trmb蛋白的表面等离子共振信号曲线， 处于下面的曲线f为现有商品化的NTA亲和芯片结合Trmb蛋白的表面等离子共振信号曲 线。
从图3可以证明本实施例中上述制备得到的是氮川三乙酸亲和分子层。 从图中的曲线可以看到，采用本实施例制备的NTA亲和芯片与现有商品化的NTA亲和 芯片相比较，前者结合蛋白的量明显高于后者，且结合蛋白后，前者曲线比后者平稳，说 明前者蛋白结合更牢固更稳定，由此可见，采用本实施例制备的NTA亲和芯片有效增强了 NTA亲和分子层的结合能力，克服了现有商品化的NTA亲和分子层结合能力不高的缺点。 实施例4:
(1 )将具有羧基基团的分子层置于含有4M N-羟基丁二酰亚胺与3M乙基-二曱氨基丙 基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡7分钟以进行分子活化；
(2 )将活化的分子层置于含有0. 2M NTA水溶液中浸泡12分钟以偶联NTA分子； (3 )重复步骤(1 )和(2 ) 2次，以多次活化-偶联NTA分子；
(4 )将分子层置于含有0. 8M盐酸乙醇胺水溶液中浸泡10分钟以封闭活化基团，取 出后用水洗净并在25。 C的温度下空气吹干，便得到氮川三乙酸亲和分子层。
图4为采用本实施例制备的和现有商品化的NTA亲和芯片(表面为氮川三乙酸亲和分 子层)分别结合浓度均为6mg/L的CFlm25蛋白的表面等离子共振信号曲线；其中处于上 面的曲线g为采用本实施例制备的NTA亲和芯片结合CFlm25蛋白的表面等离子共振信号 曲线，处于下面的曲线h为现有商品化的NTA亲和芯片结合CFlm25蛋白的表面等离子共 振信号曲线。从图4可以证明本实施例中上述制备得到的是氮川三乙酸亲和分子层。 从图中的曲线可以看到，采用本实施例制备的NTA亲和芯片与现有商品化的NTA亲和 芯片相比较，前者结合蛋白的量明显高于后者，且结合蛋白后，前者曲线平稳，说明蛋白 结合牢固不解离，而后者曲线略呈下滑趋势，说明蛋白结合没有前者稳定，由此可见，采 用本实施例制备的NTA亲和芯片有效增强了 NTA亲和分子层的结合能力，克服了现有商品 化的NTA亲和分子层结合能力不高的缺点。
由上可知本发明方法的特点之一是可以采取二次或多次活化-偶耳关NTA分子。因此， 若NTA亲和分子层多次使用后结合能力下降，可以再次使用本发明方法直接对结合能力下 降的亲和分子层进行活化-偶联NTA分子，从而恢复其结合能力。可见，本发明方法不仅 能克服现有NTA亲和分子层结合能力不高的缺点，还能解决NTA亲和分子层多次使用后结 合能力下降的问题。
还有，本发明方法适用于具有羧基基团的分子层，且操作简易、反应条件温和。因此， 本发明方法除了可以用来制备上述实施例中载体介质的NTA亲和芯片，亦可适用于其它具 有羧基基团分子层的各种载体介质，如亲和树脂、生物膜等。
权利要求
1、一种氮川三乙酸亲和分子层的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将具有羧基基团的分子层置于含有0.01-10M N-羟基丁二酰亚胺和0.01-10M乙基-二甲氨基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡不少于1分钟；(2)将经步骤(1)浸泡活化的分子层置于含有0.01mM-10M氮川三乙酸水溶液中浸泡不少于1分钟；(3)重复步骤(1)和步骤(2)不少于1次；(4)将分子层置于含有0.01-10M盐酸乙醇胺水溶液中浸泡不少于1分钟。
全文摘要
本发明公开了一种氮川三乙酸亲和分子层的制备方法，特征是将具有羧基基团的分子层置于含有0.01-10M N-羟基丁二酰亚胺和0.01-10M乙基-二甲氨基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡不少于1分钟，再将活化的分子层置于含有0.01mM-10M氮川三乙酸水溶液中浸泡不少于1分钟；重复上述步骤不少于1次后，再将分子层置于含有0.01-10M盐酸乙醇胺水溶液中浸泡不少于1分钟。本发明可有效增强亲和分子层的结合能力，制备成本低、操作简易，适用于各种载体介质；克服了现有商品化芯片氮川三乙酸亲和分子层结合能力不高或多次使用后结合能力下降的缺点，为现有氮川三乙酸亲和分子层产品提供了改进方法和可重复利用的途径。
文档编号C07C229/16GK101486662SQ200910116240
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月25日 优先权日2009年2月25日
发明者周宏敏, 浩 姜, 欧惠超, 江海峰, 罗昭锋 申请人:中国科学技术大学