增强荷电分析物穿过跨膜蛋白孔的移位的方法

专利名称：增强荷电分析物穿过跨膜蛋白孔的移位的方法
技术领域：
本发明涉及增强荷电分析物穿过跨膜蛋白孔的移位(translocation)。移位是通过增加所述孔的桶或通道和/或入口的净相反电荷来进行增强。本发明还涉及根据本发明增强的孔。
背景技术：
随机检测是一种依赖于对分析物分子与受体之间个体结合事件的观察结果的传感方法。随机传感器可通过如下方式形成将纳米尺寸的单孔置入绝缘膜中，并且在存在分析物分子的情况下测量电压驱动的穿过所述孔的离子转运。电流波动的发生频率可揭示在所述孔中结合的分析物的浓度。分析物的种类是通过其特征性电流特征，特别是电流阻断的持续时间和程度而揭示(Braha, 0. ,Walker,B.，Cheley，S. ,Kasianowicz, J. J.，Song，L.， Gouaux, J.Ε., and Bayley, H. (1997)Chem. Biol. 4,497-505 ；and Bayley, H. , and Cremer, P.S. (2001)Nature 413,226-230) 形成细菌孔的毒素α-溶血素(α-HL)的基因工程改造形式已用于对许多类型的分子进行的随机检测(Bayley，H.，and Cremer, P. S. (2001)Nature 413,226-230 ；Shin, S. -H. , Luchian, Τ. , Cheley, S. , Braha, 0. , and Bayley, H. (2002)Angew. Chem. Int. Ed. 41, 3707-3709 ；Guan, Χ. ,Gu,L.-Q. ,Cheley,S. ,Braha,0.,and Bayley,H. (2005)ChemBioChem 6,1875-1881)。在这些研究的过程中，已发现，对α-HL进行改造以直接结合小的有机分析物的尝试是很费力的，并且鲜有成功的实例(Guan, X.，Gu, L. -Q.，Cheley，S.，Braha, 0.， and Bayley, H. (2005)ChemBioChem 6，1875-1881)。

发明内容
当分析物移位穿过跨膜蛋白孔时，它们能够以该分析物特异性的方式影响流经所述孔的电流。这使得能够使用随机传感来检测所述分析物。所述分析物一般通过与所述孔相互作用来影响流经所述孔的电流。每当所述分析物与所述孔相互作用时就有特征性电流流经所述孔。发明人意外地证明了增加孔的桶或通道和/或入口的净相反电荷可增强荷电分析物移位通过所述孔。例如，增加孔的桶或通道和/或入口的净正电荷可增强荷负电分析物穿过所述孔的移位。增加所述桶或通道和/或入口的净相反电荷可增加荷电分析物穿过所述孔的移位频率。它还可降低所述分析物穿过所述孔的移位阙值电压。它还可降低所述分析物移位穿过所述孔的移位速度。此外，其中所述分析物进入所述孔但未被移位的事件几乎被消除。以该方式增强的孔是可用于对荷电分析物的随机传感的有用工具，尤其是用于测序核酸。因此，本发明提供了一种增强荷电分析物移位穿过跨膜蛋白孔的方法，所述方法包括(a)增加所述孔的桶或通道和/或入口的净相反电荷；并且
(b)确定所述分析物穿过所得孔的移位是否被增强。本发明还提供了 -跨膜蛋白孔的桶或通道和/或入口的净相反电荷的增加用于增强荷电分析物穿过所述孔的移位的用途；-一种由本发明的方法增强的跨膜蛋白孔；-一种跨膜蛋白孔，其中所述桶或通道和/或入口的净相反电荷已被增加以增强荷电分析物穿过所述孔的移位；-编码本发明的跨膜蛋白孔的多核苷酸；-编码具有序列SEQID NO :6、8或10或者它们的变体序列的跨膜蛋白孔亚基的多核苷酸；-一种确定在样本中是否存在分析物的方法，所述方法包括(a)使所述样本与本发明的跨膜蛋白孔在以下条件下接触允许所述分析物(若存在)移位穿过所述孔并与所述孔相互作用；并且(b)测量在相互作用过程中通过所述孔的电流，从而确定所述分析物的是否存在；-一种测序目标核酸序列的方法，包括(a)将所述目标序列推过或拉过本发明的跨膜蛋白？L，使所述目标序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用；并且(b)测量在每个相互作用过程中通过所述孔的电流，从而确定所述目标序列的序列；以及-一种测序核酸的试剂盒，包含本发明的跨膜蛋白孔和核酸处理酶(nucleicacid handling enzyme)。


图1示出了通过α -溶血素(α -HL)纳米孔(PDB 7AHL)的截面。(a)所述WT α -HL 纳米孔中的电荷分布。α-HL的荷正电氨基酸被涂成蓝色，荷负电氨基酸被涂成红色。(b) 在该工作中被修饰的α -HL纳米孔中的位点。Lys-8为紫色。由离子对Glu_lll/LyS-147形成的缩窄处(constriction)被涂成绿色。Met-113、Thr-115、Thr_117，Gly-119、Asn_121、 Asn-123和Thr-125被涂成橙色。图2示出了在+120mV下DNA穿过所述α -HL孔的移位。(a)DNA与所述WT α -HL 孔的五种类型的相互作用。A类型事件简单低振幅事件(被解释为DNA直接通过所述孔)； B类型简单中振幅事件(DNA被捕获在前厅(vestibule)中并从入口一侧——顺侧—— 出孔)；C类型在同一事件中的中振幅信号，之后是低振幅信号(DNA先停留在前厅中，之后通过所述β桶从反侧出去)；D类型在同一事件中的中低振幅信号，之后是中振幅信号 (DNA直接进入β桶，然后缩回前厅并从顺侧出孔)；E类型在同一事件中的中振幅信号， 之后是低振幅信号，之后是第二中振幅信号(DNA进入前厅，穿过β桶，但又缩回至前厅并从顺侧出孔)。(b)事件柱状图，显示2500个事件的平均残余电流，表示为穿过WTa-HL 孔的开孔电流的分数。代表A类型和B类型事件的峰被标识。特征为其平均事件电流的 C、D和E类型事件出现在所述两个主峰之间。(C)A类型事件的DNA移位时间的柱状图。DNA (0. 95 μ Μ)在 IM KClUOOyM EDTA、25mM Tris. HCl (pH 8.0)中从所述顺侧腔室呈现。图3示出了通过突变引入或除去的荷电侧链对+120mV下DNA移位频率的作用。(a)M113R-WT (0. 46 μ M DNA,顺侧)，(b)ElllN-ffT (0. 47 μ Μ), (c)WT (0. 53 μ Μ), (d) M113R-RL2 (0. 74 μ Μ), (e) RL2 (0. 60 μ Μ)和(f)M113D_RL2 (2· 0 μ Μ)。M113D-RL2 显示出在最高达+300mV下无电流阻断。其他条件记载在图2的说明中。图4示出了 α -HL的β桶中的精氨酸置换对DNA在+120mV下穿过所述孔的移位频率的作用。DNA移位的频率被标准化为ΙμΜ DNA。线是DNA移位频率相对于表示为残基数目的精氨酸置换距缩窄处的距离的单指数拟合。所述突变以所述RL2为背景。其他条件记载在图2的说明中。图5示出了 DNA捕获率的电压依赖性。将所述DNA移位频率以对数标度绘图并且标准化为1 μ M DNA。仅所述移位事件(即A类型和C类型)包含在所述分析中。M113R-WT (红圈)、E11IN-WT (蓝色菱形)、M113R-RL2 (黑方块)、WT (绿色下三角)和RL2 (蓝色上三角)。 所述线示出了用方程式1对数据的拟合。图6示出了 DNA穿过所述α -HL孔的移位的模型。为了穿过所述孔(V)，DNA必须首先与所述孔的顺侧入口碰撞(II)，被转运穿过所述前厅(III)并且进入所述β桶 (IV)。所述DNA可延长它在所述前厅中的停留时间并且产生对应于VI和VII的中振幅和低振幅事件。可通过实验方法观察到的过程被标识为事件并且用慢的事件间速率显示。除移位外，所有步骤都是可逆的。在A类型事件中，DNA与所述孔碰撞，进入所述前厅，然后直接移位穿过所述β桶，从所述孔的反侧出去。在该过程中对所述桶(IIIe IV)的采样太快而无法观察。在B类型事件中，DNA进入所述孔，但不穿过所述β桶，它与前厅进行长时间的相互作用以产生所述中振幅事件(I — II — III — VI)。在这种情况下，DNA 从其进入时的同一顺侧入口出孔(VI —III —II —I)。如B类型事件一样，C类型事件首先显示出中振幅电流((I —II —III —VI)，但是之后DNA的一个末端进入所述β桶 (VII)并且出现移位事件(VII —V—I)。在D类型事件中，所述DNA最可能进入所述β 桶(I — II — III — IV)，但随后停止移位(VII)，缩回到所述前厅中(VI)并且从顺侧出孔 (VI — III — II — I)。最后，在E类型事件中，所述DNA如在C类型事件中所述开始移位通过所述β桶(I —II —III —VI —VII —V)，但是随后缩回至所述前厅中(V —VII —VI)， 然后如D类型事件中所述从所述顺侧出孔(VI — III — II — I)。预计给出中振幅事件的中间体被以黄色编号，但是II和III太短促而无法观察。预计给出低振幅事件的中间体以红色编号，但是IV太短促而无法观察。图7示出了同七聚体突变体α -HL孔E111N-WT和M113R-WT的DNA阻断。 (a)+200mV下在DNA诱导的阻断过程中通过ElllN-WT的电流，表示为相对于在半对数标度上展示的事件持续时间的所述开孔电流的分数。(b)M113R-WT的对应图。(C)ElllN-WT(菱形)和M113R-WT (圆形)的长时阻断，作为所施加的从+100至+200mV的电势的总数的百分数。将约0. 5 μ M的DNA加至所述顺侧腔室；在每个实验后确定所述提取物的浓度。其他的条件参见图2的说明。图8示出了多种α -HL孔的DNA阻断的平均事件电流的振幅柱状图。主峰代表A 类型事件(DNA移位)。每图均包含1000个事件。条件记载在图2的说明中。图9示出了将DNA(LOyM)加入到反侧腔室后(a)M113R-RL2和(b)N121R-RL2的电流阻断。施加的电势是_120mV。对于这些突变体，通过所述开孔的电流在负电势下比在正电势下噪声更大。其他条件记载在图2的说明中。图10示出了+120mV下穿过WT-α-HL纳米孔的DNA移位的罕见(<1%)电流阻断事件，显示出在所述中振幅和低振幅状态之间的多重转变。条件记载在图2的说明中。图 11 显示了 :a)通过 7R 纳米孔的截面。使用 PyMOL (DeLano Scientific LLC, ν 1.0)软件将所述WT纳米孔(PDB :7AHL)中位点113、115、117、119、121、123和125处的氨基酸用精氨酸置换。荷负电的残基被涂成红色，荷正电的残基被涂成蓝色。b)在所述腔室的顺侧加入1 μ M的ssDNA后在+120mV下7R(上面)和RL2- α -HL纳米孔(下面)的单通道记录。实验是在包含IOOuM EDTA(ρΗ 8)的IM KCl 25mMTris. HCl中进行。图12示出了穿过7R纳米孔的DNA移位。a)显示在所述腔室的顺侧加入0. 7 μ M 的ssDNA(9aner)时穿过7R孔的移位时间分布的事件柱状图。事件< 5ms被归为7R纳米孔的短暂门控(参见Si)。b)在DNA移位过程中DNA移位事件(τ > 5ms)相对于剩余电流的2-D分布图。颜色代表如插图所示的事件的密度。c)DNA穿过7R纳米孔的最可能的 DNA移位速度对所施加的电压的依赖性。红线显示单指数拟合。图13示出了 +120mV下ssDNA移位过程中通过WT和经修饰的α -HL纳米孔的剩余电流。误差表示标准偏差。除了 WT和2Ν，所有纳米孔都以RL2为背景。从左起第四个至最后一个柱涉及荷额外正电荷的纳米孔。图14示出了所述DNA移位速度对7R异聚体的内部电荷的依赖性。将数据拟合至单指数曲线(上图)。异聚体纳米孔是通过混合RL2的单体(空心圆)和7R的单体(紫色圆)来获得。以该方式，可形成含有7至49额外正电的八种不同类的七聚体(7RmRL2n-m ； η = 7，亚基总数，m = 0. · · 7)(下图)。图15示出了 7R纳米孔的潜在用途。a)通过读出通道电流对单链进行测序。所述7R通道被纳入用通道探针功能化的固相纳米孔中。测量通过ssDNA的横向通道电流以识别单个碱基，所述ssDNA移位穿过所述孔。7R将控制每个核苷酸在所述通道探针之间的停留时间。b)使用电生理学技术的链测序。将含有内部正电荷的β桶连在所述α-HL纳米孔的顺侧入口，用于控制ssDNA的速度。单个核苷酸之间的差异是通过由所述DNA移位所生成的所述纳米孔电导率变化来测量。序列表说明SEQ ID NO=I示出了编码野生型(WT) a -溶血素的一个亚基的多核苷酸序列。SEQ ID NO :2示出了 WT a -溶血素的一个亚基的氨基酸序列。氨基酸2至6、73 至75、207至209、214至216和219至222形成a -螺旋。氨基酸22至30、；35至44、52至 62、67 至 71、76 至 91、98 至 103、112 至 123、137 至 148、154 至 159、165 至 172、229 至 235、 243至洸1、266至271、285至286和291至293形成β -折叠(β-strand)。所有其他非末端氨基酸，即 7至21、31 至；34、45至51、63至 66、72、92 至 97、104 至 IllUM 至 136、149 至 153,160 至 164,173 至 206,210 至 213、217、218、223 至 228,236 至 242,262 至 265,272 至274和287至290形成环区。氨基酸1和294是末端氨基酸。SEQ ID NO :3示出了编码α -溶血素RL2的一个亚基的多核苷酸序列。RL2是半合成基因的产物，所述半合成基因是设计为使编码所述跨膜β桶的序列发生盒式诱变(Cheley, S.，Braha, 0.，Lu，X.，Conlan, S.，and Bayley, H. (1999) Protein Sci. 8，1257-U67)。它在所编码的多肽序列中包含6个沉默限制性位点和5个改变的氨基酸(K8A、 VlML、G130S、m39Q和I142L)。D8RL2是具有八天冬氨酸尾的RL2。SEQ ID NO :4示出了 α -溶血素RL2的一个亚基的氨基酸序列。与上文针对SEQ ID NO :2讨论的氨基酸相同的氨基酸形成α-螺旋、β-折叠、环区和末端氨基酸。SEQ ID NO 5示出了编码α -溶血素M113R-WT的一个亚基的多核苷酸序列。SEQ ID NO 6示出了 α -溶血素M113R-WT的一个亚基的氨基酸序列。SEQ ID NO 7示出了编码α -溶血素E111N-WT的一个亚基的多核苷酸序列。SEQ ID NO 8示出了 α -溶血素E111N-WT的一个亚基的氨基酸序列。SEQ ID NO 9示出了编码在实施例中使用的α -溶血素A8R-RL2的一个亚基的多核苷酸序列。SEQ ID NO
酸序列。SEQ ID NO
的多核苷酸序列。SEQ ID NO
基酸序列。SEQ ID NO
的多核苷酸序列。SEQ ID NO
基酸序列。SEQ ID NO 15示出了在实施例中使用的DNA序列。
具体实施例方式应理解，可根据本领域内的具体需要对所公开的产物和方法的不同应用进行调整。还应理解，本文所用的术语只是为了描述本发明的具体实施方案的目的，而非意在进行限制。此外，除非上下文另有清楚的指明，否则本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也包括复数指代物。因此，例如，提及“一种分析物”包括“多种分析物”，提及“一个跨膜蛋白孔”包括两个或更多个这类孔，提及“核酸序列”包括两种或多种这样的序列，等等。本文中——无论在上文还是下文——引用的全部出版物、专利和专利申请均以引用的方式全文纳入本文。增强移位的方法本发明提供了一种增强荷电分析物穿过跨膜蛋白孔的移位的方法。所述跨膜蛋白孔一般被用于通过随机传感来检测所述分析物。随着所述分析物移位通过所述孔，它一般与所述孔相互作用并且以该分析物特异性的方式影响流经所述孔的电流。只要所述分析物与所述孔相互作用，特征性的电流就流经所述孔。这使得可使用随机传感检测所述分析物。所述方法可以任何方式增强所述分析物的移位。所述方法优选可(1)增加所述分析物移位通过所述孔的频率，(2)降低所述分析物移位通过所述孔的阙值电压，(3)降低所
:10示出了在实施例中使用的α-溶血素A8R-RL2的一个亚基的氨基 11示出了编码在实施例中使用的α-溶血素M113K-RL2的一个亚基 :12示出了在实施例中使用的α-溶血素M113K-RL2的一个亚基的氨 :13示出了编码在实施例中使用的α-溶血素M113R-RL2的一个亚基 :14示出了在实施例中使用的α-溶血素M113R-RL2的一个亚基的氨述分析物移位通过所述孔的速度，或者(4)降低所述分析物和所述孔之间非移位相互作用的数目。非移位相互作用是其中所述分析物进入所述孔并且与所述孔相互作用，但是没有移位通过所述孔的事件。在一些情况下，所述非移位相互作用被消除。所述方法优选可增强⑴和⑵；⑴和⑶；⑴和⑷；⑵和⑶；⑵和⑷；⑶和⑷；⑴、⑵和⑶； ⑴、(3)和⑷；⑴、(2)和⑷；或(2)、(3)和⑷。所述方法最优选可增强⑴、(2)、(3) 和G)。换言之，所述方法最优选增强所述分析物移位通过所述孔的频率、降低所述分析物移位通过所述孔的阙值电压、降低所述分析物移位通过所述孔的速度并且降低所述分析物和所述孔之间非移位相互作用的数目。本领域技术人员很容易确定净相反电荷的增加是否会增强所述分析物穿过所述孔的移位。例如，所述分析物可与未增强的或野生型的孔以及其中其桶或通道和/或入口的净相反电荷已增强的相同类型孔相接触，并且可以确定所述两种孔之间分析物移位的任何差异。分析物移位可使用本领域已知的任何方法来测量。一种方法记载于实施例中。通过增强所述分析物移位穿过所述孔的移位，本发明的方法提供了用于随机传感所述分析物的改良孔。增强的穿过所述孔的移位可导致更敏感的系统，所述系统(1)使得在高浓度和低浓度下均可检测所述分析物；( 使得可检测甚至在杂质中的所述分析物； (3)使得可更快速地检测所述分析物；(4)减少由非移位相互作用产生的背景噪音；并且 (5)使得可在较低电压下检测所述分析物。对于测序核酸序列最重要的是，增强的移位尤其是增加的移位频率，可导致对所述序列中连续核苷酸的读取之间的停滞时间减少。这使得可以更快地对核酸进行测序。降低穿过所述孔的移位速度会增加对所述核酸序列中连续核苷酸的读取时间，并因此使得所述核酸的序列可以被更准确地确定。分析物所述分析物可以是任何荷电物质。如果分析物带有净电荷则它是荷电的。所分析物可以荷负电也可以荷正电。如果分析物带有净负电荷则它是荷负电的。如果分析物带有净正电荷则它是荷正电的。合适的分析物包括但不局限于金属离子、无机盐、多聚物(如聚合酸或碱)、染料、 漂白剂、药物、诊断剂、消遣性药物(recreational drug)、爆炸物和环境污染物。所述分析物可以是从细胞中分泌的分析物。或者，所述分析物可以是存在于细胞内因此必须将其从所述细胞中提取出来的分析物。所述分析物优选是多聚物。所述多聚物优选是核酸序列。核酸是荷负电的。核酸是包含两个或多个核苷酸的大分子。由酶处理的核酸可包含任意核苷酸的任何组合。所述核苷酸可以是天然存在的或人工的。核苷酸一般包含核碱基(nuclecAase)、糖和至少一个磷酸基团。所述核碱基一般是杂环的。核碱基包括但不局限于嘌呤和嘧啶，更具体地是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖一般是戊糖。核苷酸糖包括但不局限于核糖和脱氧核糖。所述核苷酸一般是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述核苷酸一般包含一磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸可连接在核苷酸的5’或3’侧。合适的核苷酸包括但不局限于一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷 (ATP)、一磷酸鸟苷(GMP)、二磷酸鸟苷(⑶P)、三磷酸鸟苷(GTP)、一磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、一磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、 一磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、一磷酸脱氧腺苷(dAMP)、二磷酸脱氧腺苷(dADP)、三磷酸脱氧腺苷(dATP)、一磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、二磷酸脱氧鸟苷(dGDP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、一磷酸脱氧胸苷(dTMP)、二磷酸脱氧胸苷(dTDP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、一磷酸脱氧尿苷(dUMP)、二磷酸脱氧尿苷(dUDP)、三磷酸脱氧尿苷(dUTP)、一磷酸脱氧胞苷(dCMP)、二磷酸脱氧胞苷 (dCDP)和三磷酸脱氧胞苷(dCTP)。所述核苷酸优选选自AMP、TMP、GMP、UMP、dAMP、dTMP、 dGMP 或 dCMP。所述核酸优选为双链，如DNA。所述核酸可以是单链，如cDNA或RNA。所述多聚物可以是肽、多肽或蛋白质。所述肽、多肽或蛋白质可以是天然存在的或非天然存在的。所述多肽或蛋白质可在其中包括合成的或经修饰的氨基酸。对氨基酸的很多不同类型的修饰是本领域中已知的。对于本发明，应理解所述分析物可通过本领域中可用的任何方法进行修饰。所述蛋白质可以是酶、抗体、激素、生长因子或生长调节蛋白，如细胞因子。所述细胞因子可选自白细胞介素，优选IFN-1、IL-2、IL-4、IL_5、IL_6、IL-10、IL-12或IL-13 ；干扰素，优选IL-Y ；或其他细胞因子，如TNF-α。所述蛋白质可以是细菌蛋白、真菌蛋白、病毒蛋白或寄生物衍生的蛋白。在所述蛋白与所述孔接触之前，可将它展开(unfold)以形成多肽链，从而使其进入所述孔的桶或通道并且与所述孔相互作用。所述分析物可以是氨基酸。荷电氨基酸是本领域中公知的并且将在下文详细讨论。所述氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的。所述氨基酸可以是合成的或经修饰的。 对氨基酸的很多不同类型的修饰是本领域中已知的。所述分析物可以是个体核苷酸或单核苷酸。个体核苷酸是未与另一个多核苷酸通过核苷酸键结合的核苷酸。核苷酸键使核苷酸的一个磷酸基团与另一个核苷酸的糖基团连接。个体核苷酸一般是未与具有至少5个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、 至少200个、至少500个、至少1000个或至少5000个核苷酸的另一个多核苷酸序列通过核苷酸键结合的核苷酸。例如，所述个体核苷酸已被从目标多核苷酸序列如DNA或RAN链中消化出来。核苷酸是荷负电的。所述核苷酸可以是上文讨论的任何核苷酸。所述核苷酸可来自对核酸序列例如核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸的消化。核酸序列可使用本领域中已知的任何方法消化。合适的方法包括但不局限于使用酶或催化剂的方法。对核酸的催化消化公开于Decketal.，Inorg. Chem.，2002 ；41 :669-677中。来自单核酸序列的个体核苷酸可与所述孔以连续的方式接触，以对所述核酸的全部或一部分进行测序。按照本发明第二个实施方案进行的核酸测序在下文更详细讨论。所述核苷酸一般是未经修饰的，如当所述核苷酸是来自对核酸序列的消化时。或者，所述核苷酸可以是经修饰的或被破坏的。所述核苷酸一般是甲基化的或氧化的。所述核苷酸可用显示性标签标记。所述显示性标签可以是使得所述核苷酸可被检测到的任何合适的标签。合适的标签包括荧光分子、放射性同位素，例如125I、35S，以及接头例如生物素。所述核苷酸一般存在于任意合适的生物样本中。合适的生物样本在下文描述。跨膜蛋白孔跨膜蛋白孔是允许离子顺着施加的电势从所述膜的一侧流到另一侧的多肽。所述孔优选允许所述分析物顺着施加的电势从所述膜的一侧流到另一侧。所述孔一般是低聚物。所述孔优选由一些重复亚基组成，如6个、7个或8个亚基。所述孔更优选是七聚体。所述孔一般包含所述离子可从其中流过的桶或通道。所述孔的亚基一般围绕一个中心轴并且提供跨膜桶或管道或者跨膜α-螺旋束或通道的链。根据本发明使用的孔可以是β -桶孔或α -螺旋束孔。β -桶孔包含由β -折叠形成的桶或通道。合适的β-桶孔包括但不局限于β-毒素，如α-溶血素和杀白细胞素； 和细菌的外膜蛋白质/通道蛋白(porin)，如耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)通道蛋白A(MspA)、外膜通道蛋白F(OmpF)、外膜通道蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A和奈瑟氏球菌属(Neisseria)自转运脂蛋白(NalP)。α-螺旋束孔包含由α-螺旋形成的桶或通道。 合适的α-螺旋束孔包括但不局限于内膜蛋白和α-外膜蛋白，如WZA。本发明中使用的最优选的孔是α-溶血素或其变体。所述α-溶血素孔是由7个相同亚基形成(即它是七聚体)。野生型α-溶血素的一个亚基的序列在SEQ ID Ν0:2中示出。α -溶血素RL2的一个亚基的序列在SEQ IDNO :4中示出。变体是七聚体孔，所述七聚体孔的七个亚基中的一个或多个具有从SEQ ID NO :2或4变化而来并且保持孔活性的氨基酸序列。变体可包括有利于与所述分析物相互作用的修饰。变体α-溶血素中的1、2、3、4、5、6或7个所述亚基可具有从SEQID Ν0:2或4变化而来的氨基酸序列。变体孔中的全部7个亚基一般相同但也可以不同，特别是如果一个或多个所述亚基被修饰以有利于与所述分析物相互作用。所述变体可以是由生物体——例如由葡萄球菌属Staphylococcus)细菌——表达的天然存在变体。变体还包括由重组技术产生的非天然存在变体。在SEQ ID N0:2或4 的氨基酸序列的全长中，以氨基酸同一性计，变体的亚基优选与所述序列具有至少50%的同源性。以氨基酸同一性计，所述亚基多肽更优选在全长上可以与SEQ ID NO :2或4的氨基酸序列具有至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、 至少90%并且更优选至少95%、97%或99%的同源性。在200个或更多，例如230、250、 270或280个或更多连续氨基酸的片段中可以有至少80%，例如至少85%、90%或95%的氨基酸同一性(“硬同源性(hard homology)”)。优选的变体在SEQ ID NO :6、8、10、12和 14中示出。可对SEQ ID NO :2或4的氨基酸序列进行氨基酸置换，例如最多达1、2、3、4、5、10、 20或30个置换。可进行保守置换，例如，根据下表1进行。表1-保守置换在第二列同一格，优选在第三列同一行中的氨基酸可相互置换。
权利要求
1.一种增强荷电分析物穿过跨膜蛋白孔的移位的方法，所述方法包括(a)增加所述孔的桶或通道和/或入口的净相反电荷；并且(b)确定所述分析物穿过所得孔的移位是否被增强。
2.权利要求1的方法，其中增加净相反电荷会增加所述分析物穿过所述孔的移位频率。
3.权利要求1或2的方法，其中增加净相反电荷会降低用于所述分析物穿过所述孔的移位阙值电压。
4.前述权利要求任一项的方法，其中增加净相反电荷会降低所述分析物穿过所述孔的移位速度。
5.前述权利要求任一项的方法，其中增加净相反电荷会降低所述分析物和所述孔之间非移位相互作用的数目。
6.前述权利要求任一项的方法，其中所述分析物是多聚物。
7.前述权利要求任一项的方法，其中所述分析物是核酸序列
8.前述权利要求任一项的方法，其中所述孔包含7个亚基，所述每个亚基含有SEQID NO 2或其变体。
9.权利要求1-7任一项的方法，其中所述孔包含7个亚基，所述每个亚基包含SEQID NO 4或其变体。
10.前述权利要求任一项的方法，其中所述分析物荷负电并且步骤(a)包括增加所述净正电荷。
11.权利要求10的方法，其中所述净正电荷是通过将一个或多个荷正电的氨基酸引入所述孔的桶或通道和/或入口中来增加。
12.权利要求11的方法，其中所述引入通过置换进行。
13.权利要求12的方法，其中所述一个或多个荷正电的氨基酸是组氨酸(H)、赖氨酸 (K)和/或精氨酸(R)。
14.权利要求10的方法，其中所述净正电荷是通过用一个或多个不荷电的氨基酸、非极性氨基酸和/或芳香族氨基酸置换所述孔的桶或通道和/或入口中的荷负电的氨基酸来增加。
15.前述权利要求任一项的方法，其中所述入口是分析物进入所述桶或通道时所穿过的所述孔的部分。
16.所述跨膜蛋白孔的桶或通道和/或入口的净相反电荷的增加用于增强荷电分析物穿过所述孔的移位的用途。
17.—种权利要求1-15任一项的方法增强的跨膜蛋白孔。
18.—种跨膜蛋白孔，其中它的桶或通道和/或入口的净相反电荷已被增加，以增强荷电分析物穿过所述孔的移位。
19.权利要求17或18的跨膜蛋白孔，其中所述孔包含(a)至少一个包含SEQID NO 6或其变体的亚基；(b)至少一个包含SEQID NO 8或其变体的亚基；或(c)至少一个包含SEQID NO 10或其变体的亚基。
20.权利要求19的跨膜蛋白孔，其中所述孔是包含7个亚基的同七聚体，所述亚基为SEQ ID NO :6、8或10或它们的变体。
21.编码权利要求17-20任一项的跨膜蛋白孔的多核苷酸。
22.编码具有SEQID NO :6、8或10或它们的变体序列的跨膜蛋白孔亚基的多核苷酸。
23.权利要求22的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID NO :5、7或9或它们的变体中显示的序列。
24.一种确定样本中是否存在分析物的方法，包括(a)将所述样本与权利要求17-20任一项的跨膜蛋白孔在如下条件下接触如果存在所述分析物则使其移位穿过所述孔并与所述孔相互作用；并且(b)在所述相互作用过程中测量通过所述孔的电流，从而确定所述分析物是否存在。
25.一种测序目标核酸序列的方法，包括(a)将所述目标核酸推过或拉过权利要求17-20任一项的跨膜蛋白孔，使得所述目标序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用；并且(b)在每个相互作用过程中测量通过所述孔的电流，从而确定目标序列的序列。
26.一种用于测序核酸的试剂盒，包含权利要求17-20任一项的跨膜蛋白孔和核酸处理酶。
全文摘要
本发明涉及增强荷电分析物通过跨膜蛋白孔的移位。移位是通过增加所述孔的桶或通道和/或入口的净相反电荷来增强。本发明还涉及根据本发明增强的孔。
文档编号C07K14/31GK102317310SQ200980154651
公开日2012年1月11日 申请日期2009年11月13日 优先权日2008年11月14日
发明者G·玛格里亚, J·H·P·贝利 申请人:Isis创新有限公司