专利名称：提高棉花耐盐与干旱能力的GbWD1基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能够提高棉花耐盐与干旱能力的(ibWDl基因及其编码的多肽。
背景技术：
土壤盐渍化是一个世界性的资源问题和生态问题，越来越引起人们的重视。联合国粮农组织的调查结果显示，全球6 %的陆地面积遭受着土壤盐渍化的侵蚀，20 %的灌溉农业受到不同程度的盐害威胁。当前，全球盐碱地面积已达9.5X108hm2。中国盐渍土总面积约1亿hm2，其中已经盐渍化土壤约0. 37亿hm2，残余盐渍化土壤约0. 45亿hm2，潜在盐渍化土壤约0. 17亿hm2。土壤盐渍化吞噬着有限的土地资源，成为严重制约农业生产的一个全球性问题。大量研究证明，运用分子生物学手段从耐盐的种质(例如海岛棉)中分离耐盐基因，通过转基因分子育种手段获得耐盐作物新品种可以有效解决上述问题。土壤盐渍化对植物的伤害主要包括3个方面(1)对植物的萌发和生长产生抑制作用。(2)影响植物对营养物质的吸收与利用。(3)影响植物的细胞结构的稳定性。为了应对土壤盐渍化对植物的伤害，植物发展一系列的耐盐与避盐机制(1)平衡金属离子的吸收以减少毒性离子(Na+)的伤害；(2)形成大量的调节渗透物质如小分子的氨基酸(脯氨酸)、甘露醇、山梨醇等来调节细胞的渗透压力。近年来，通过分子生物学方法克隆了大量有关编码植物信号传导蛋白(例如碱性磷酸酶互作蛋白激酶cira等)、渗透物质合成酶(甜菜碱合成酶)以及离子转运蛋白(例如钠离子转运蛋白等)的基因，并通过转基因的手段将这些基因转化到不同的植物中，获得了具有一定耐盐水平的转基因植物。但遗憾地是，到目前为止还没有上述转基因作物的商业化报道。因此，分离新的耐盐/抗旱基因对于植物的耐盐和抗旱转基因育种仍然具有重要的意义。WD重复蛋白(WD repeats protein)是一类含有色氨酸-天门冬氨酸(WD)重复序列的蛋白。已有的研究证明WD重复蛋白参与植物液泡形成和运输，从而实现在细胞信号转导、蛋白质运输、细胞骨架的动态组装以及染色质的修饰及转录等不同的生物化学过程中的功能。尽管WD重复蛋白在植物发育方面的研究比较详细，但是有关WD重复蛋白如何参与植物抗逆性(耐盐与抗旱)的研究、以及WD重复蛋白是否具有耐盐和抗旱的功能没有报道。本申请利用分子生物学的方法从海岛棉中克隆了一个WD重复蛋白基因(ibWDl。在此基础上，进一步通过表达谱分析、蛋白质互作分析以及转基因植株的耐盐与抗旱能力分析证实WD重复蛋白基因(ibWDl具有抗旱和耐盐功能，从而构成此发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的能够提高棉花耐盐与干旱能力的基因，并得到所述基因表达的蛋白产物。本发明首次采用分子克隆方法，从构建的海岛棉根部cDNA文库中分离获得了新的(ibWDl基因，并且通过转基因实验证实了它具有提高棉花耐盐与干旱能力的功能，从而达到了发明目的。本发明利用渗透压诱导表达启动子在棉花中特异表达(^bWDl基因提高在干旱、高盐土壤条件下棉花合成新的液泡数目，从而提高棉花对有毒Na+离子的分配能力以及调节细胞渗透压力的能力。本发明包括以下内容1、提供了一种新的分离出的(ibWDl蛋白质多肽，包含具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽；(b)将 SEQ ID NO :2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐盐与干旱能力功能的(^bWDl蛋白质活性的由(a)衍生的多肽。2、提供了编码上述多肽的多核苷酸，选自(a)编码上述(ibWDl蛋白质多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO :1中160-1404位的序列；(b)具有SEQ ID NO :1中1-1591位的序列。3、提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。4、提供了制备上述(ibWDl蛋白质多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有活性的多肽。5、提供了上述多核苷酸和(ibWDl蛋白质多肽的用途，即，在培育提高棉花耐盐与干旱能力的棉花品种方面的应用。6、提供了一种提高棉花耐盐与干旱能力的方法，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有SEQ ID NO :1所示序列的多核苷酸，所述的(^bWDl选自下组(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐盐与干旱能力的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤⑴中的农杆菌接触，从而使(^bWDl基因编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入(ibWDl基因的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。在本发明中，术语“(ibWDl蛋白质”、“(ibWDl多肽”或者“提高棉花耐盐与干旱能力蛋白”可互换使用，都指具有提高棉花抗旱、耐盐能力的(^bWDl蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的(^bWDl蛋白质。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的(ibWDl蛋白或多肽”是指(ibWDl多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化GbffDl蛋白质。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括(ibWDl蛋白质的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、 “衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然(^bWDl蛋白质相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文所述，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“(ibWDl多肽”指具有能够与液泡形成蛋白质相互作用、能够提高棉花耐盐与干旱能力的SEQ ID NO. 2序列的多肽。该术语还包括具有与(ibWDl蛋白质相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内， 更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括(^bWDl蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨程度条件下能与(^bWDl杂交的DNA、cDNA所编码的蛋白、以及利用抗(ibWDl多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含(^bWDl多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 (^bWDl多肽的可溶性片段。 通常，该片段具有(^bWDl多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供(ibWDl蛋白质或多肽的类似物。这些类似物与天然(ibWDl多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。表 权利要求
1.一种能够提高棉花耐盐与干旱能力的多肽，包含具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.权利要求1所述的多肽，所述保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物是 SEQ ID NO :2序列被一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐盐与干旱能力功能的多肽。
3.权利要求1或2所述的多肽在提高耐盐能力方面的功能与应用。
4.权利要求1或2所述的多肽与液泡形成蛋白AtVCl互作的功能。
5.一种能够提高棉花耐盐与干旱能力的基因，包含(a)编码权利要求1或2所述多肽的多核苷酸；或(b)与(a)互补的多核苷酸。
6.权利要求5所述的基因，其特征在于，其序列选自(a)具有SEQID NO :1中160-1404位的序列；或(b)具有SEQ ID NO :1 中 1-1591 的序列。
7.权利要求5或6所述的基因在提高棉花耐盐能力方面的功能与应用。
8.一种载体，其特征在于含有权利要求5或6所述的基因。
9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于含有权利要求8所述的载体。
10.一种提高棉花耐盐与干旱能力的方法，包括(a)提供携带权利要求7所述的表达载体的农杆菌；(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所携带的表达载体中的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(c)选择出转入有(ibWDl蛋白质的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
全文摘要
本发明提供了一种能够在干旱、盐碱条件下促进棉花液泡形成GbWD1基因及其编码的GbWD1蛋白质多肽，本发明经实验证实了所述多肽与液泡形成蛋白AtVC1互作的功能，以及在棉花植株中超量表达GbWD1基因具有显著提高棉花耐盐与干旱能力的功能。
文档编号C07K14/415GK102399276SQ20111040692
公开日2012年4月4日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者代其林, 左开井, 王劲 申请人:左开井, 王劲