β-内酰胺类抗生素残留检测的受体分析法与试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于兽药残留分析领域，具体涉及一种β-内酰胺类抗生素残留检测的受体分析方法与试剂盒及应用。本发明的试剂盒含可同时检测15种β-内酰胺类药物残留的受体蛋白。本发明的受体蛋白BlaR-CTD是由大肠杆菌(Escherichia?coli)BlaRC所表达，包含受体蛋白BlaR-CTD的大肠杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?NO：M2013173。本发明还公开了受体蛋白、酶标药物的制备方法和受体分析方法。本发明的试剂盒可同时检测青霉素类和头孢菌素类药物，拓宽了现有技术的检测对象，具有简便、快速、灵敏和准确等突出优点。
【专利说明】β-内酰胺类抗生素残留检测的受体分析法与试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于兽药残留分析、基因工程和受体分析【技术领域】。具体涉及一种能识别β-内酰胺类抗生素残留的受体蛋白的制备、同时检测15种β-内酰胺类抗生素残留的受体分析法的建立及试剂盒研制。
【背景技术】
[0002]分子结构中含有内酰胺环的一类药物称为内酰胺类抗生素，主要包括青霉素类和头孢菌素类。低廉而有效的杀菌效果使它成为目前使用最广泛的一类兽药。此类药物不仅可以用来治疗动物细菌感染性疾病，同时还可以作为促生长饲料添加剂使用。
[0003]由于未按照休药期规定使用兽用β -内酰胺类抗生素或者将人用β -内酰胺类抗生素使用在动物上，导致其在畜产品中残留严重。通过研究证实，即使是低剂量的此类药物在动物食品中残留，长期接触也可能使对其敏感的人群发生过敏反应，严重者会发生过敏性休克甚至死亡。制定相应的措施对抗生素残留进行监控和管制刻不容缓。为了保障各国利益及食品安全，各国对β_内酰胺类抗生素在动物性食品中的残留制定了最高残留限量(MRL)。
[0004]目前内酰胺类抗生素残留的检测方法主要分为理化分析法、微生物法、免疫分析法及受体分析法。理化分析法主要用于确证，亦可用于筛选，但需要昂贵的仪器作为检测的保证，且其前处理程序较复杂并不适合大量检测。后面三种方法主要用于筛选，其中微生物法成本低廉、操作简便，但其精确度、准确度还无法适应目前抗生素残留检测的需要；免疫分析方法灵敏度 高、特异性强，但它不能同时检测青霉素类和头孢菌素类药物；受体分析法可以同时识别青霉素类和头孢菌素类药物，可实现多残留检测。此外，内酰胺环容易发生水解而失活，而MRL标准中规定的残留物为有活性的残留物，受体能特异性地检测到活性组分。因此，对于快速准确筛选内酰胺类抗生素在动物组织中的残留，受体分析方法更具优势。
[0005]目前已有一些文献和专利报道了内酰胺类抗生素的受体分析法。例如，美国专利(专利号4762782)利用枯草芽孢杆菌PBP2a蛋白建立了 β _内酰胺类抗生素的受体分析法，但该方法需要用到抗体，操作过程复杂。基于肺炎链球菌ΡΒΡ2χ蛋白所建立的受体检测方法已有数项报道，这些方法有的需要用到昂贵的生物传感器(Cacciatore et al.，Analytica Chimica Acta, vol520,2004,ppl05_115),有的需要用到抗体(Lamar and Petz,Analytica Chimica Acta, 586, 2007, pp296_303),且能识别的 β-内酰胺类药物种类不多，尚不能满足需要。地衣芽孢杆菌BlaR蛋白是一种β-内酰胺酶调控蛋白，其C端区域即BlaR-CTD位于细胞膜外，能特异性的识别β-内酰胺类抗生素(Joris et al.，FEMSMicrobiology Letters，vol.70，1990，ppl07_114)。美国专利(专利号 6524804B2)在大肠杆菌中重组表达获得地衣芽孢杆菌749的BlaR-CTD受体蛋白，来检测食品中残留的β _内酰胺类抗生素。此专利共设计了4种检测生物液体中的β_内酰胺类抗生素的方式:第一种为生物素标记的BlaR-CTD的胶体金试纸条方法，这种方法能检测牛奶中10种β -内酰胺类药物，且检测限均低于欧盟规定的MRL，但不能进行定量分析；第二种方式是利用融合蛋白BlaR-CTD-β内酰胺酶，可以检测青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、氯唑西林、头孢匹林和头孢噻呋这6种药物，但青霉素、氨苄西林、阿莫西林的检测限高于欧盟规定的MRL ;第三种方式是用碱性磷酸酶和过氧化物酶分别标记BlaR-CTD的酶标板方法，这种方法检可以测青霉素、氯唑西林、头孢噻呋这3种药物；第四种方法同样以酶来标记受体蛋白的试管方法，这种方法可检测青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、氯唑西林、头孢匹林和头孢噻呋，其中前三种低于美国规定的MRL但高于欧盟规定MRL。纵观上述方法，建立一种能同时检测多种β -内酰胺类药物、其检测限须要低于欧盟规定的MRL且组织样品处理和操作步骤简单的受体分析方法非常有必要。基于该方法建立的试剂盒在检测动物源性食品中的β_内酰胺类药物残留中具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，制备一种能识别多种β -内酰胺类抗生素的受体蛋白。
[0007]本发明的第二个目的是利用该受体蛋白，建立一种能用于组织样品中多种β_内酰胺类抗生素残留检测的受体分析法，该方法的组织样品前处理过程简单，涵盖的组织样品范围广(包括牛奶、牛肉和鸡肉)，操作简便快捷。
[0008]本发明的第三个目的是在组织样品中的β_内酰胺类药物种类已知时，可以对其进行定量分析。
[0009]本发明的第四个目的是该受体蛋白在内酰胺类抗生素残留检测试剂盒中的应用。
[0010]本发明的第五个目的是本发明制备的试剂盒在β-内酰胺类抗生素残留检测中的应用。
[0011]本发明通过以下技术方案实现:
[0012]为了实现本发明的任务，发明人克隆了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏号ATCC14580的BlaR蛋白的C端区域(BlaR-CTD)的基因，构建相应的原核表达质粒pET-28a-BlaR-CTD，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，得到表达该受体蛋白的大肠杆菌(Escherichia coli)BlaRC,于2013年5月6日将该菌株送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2013173，然后诱导受体蛋白BlaR-CTD的重组表达。
[0013]具体地，本发明通过以下技术方案实现:
[0014] 申请人:制备得到一种β -内酰胺类抗生素残留检测试剂盒，其核心在于该试剂盒的固相载体包被有受体蛋白BlaR-CTD，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
[0015]进一步，上述试剂盒，还包含包含下列组分:
[0016](1)由受体蛋白BlaR-CTD包被的固相载体，即酶标板；
[0017](2)头孢喹厢标准溶液6瓶，浓度分别为O μ g/L、0.5 μ g/L、I μ g/L,2 V- g/L、4y g/L、8 μ g/L ；
[0018](3)辣根过氧化物酶标记氨苄西林的储存液；
[0019](4) IOX磷酸盐缓冲液，用下列方法制备得到:NaC180.0g, ΚΗ2Ρ042.0g,Na2HPO4.12H2029.0g, KC12.0g,加去离子800mL充分溶解，调节pH值至7.4，补充去离子水定容至1000mL ；
[0020](5) IOX洗涤液，用下列方法制备得到:NaC180.0g，ΚΗ2Ρ042.0g，Na2HPO4.12Η2029.0g, KC12.0g, Tween205mL,加去离子水约800mL,补充去离子水定容至1000mL ；[0021](6)底物A液，用下列方法制备得到:准确称取四甲基联苯胺160mg，加入IOmL 二甲基乙酰胺，搅拌完全溶解；
[0022](7)底物B液，用下列方法制备得到:准确称取柠檬酸13.70g、柠檬酸三钠10.14g和过氧化氢脲282.0Omg，用少量超纯水溶解，定容至1000mL ；
[0023](8)终止液，用下列方法制备得到:准确量取浓硫酸100mL,缓慢滴加到800mL超纯水中；
[0024]使用时，将10X磷酸盐缓冲液和10X洗涤液分别用去离子水稀释十倍得到样品稀释液和洗涤液，将辣根过氧化物酶标记氨苄西林的储存液用磷酸盐缓冲液稀释300倍得到酶标药物工作液，将底物A液和底物B液按体积比为1: 10混匀得到底物混合液。
[0025] 申请人:提供了一种同时检测β -内酰胺类抗生素残留的受体分析方法，包括下列步骤:
[0026](I)以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏号ATCC14580的基因组为模板，利用PCR扩增得到受体蛋白BlaR-CTD的基因片段，将该基因片段插入到表达载体pET-28a中，得到重组表达质粒pET-28a-BIaR-CTD ；
[0027](2)将步骤(1)所述的重组表达质粒pET-28a-BlaR_CTD转化大肠杆菌BL21 (DE3)得到重组的大肠杆菌(Escherichia coli) BlaRC,进一步诱导表达得到受体蛋白BlaR-CTD,对该受体蛋白进行亲和纯化；
[0028](3)采用碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)法合成酶标药物，即辣根过氧化物酶标记的氨苄西林HRP-AMP ；
[0029](4)用步骤⑵所述的受体蛋白BlaR-CTD包被固相载体，即酶标板；
[0030](5)将待测样品用弱碱性的磷酸盐缓冲液提取，离心取上清为待测物；
[0031](6)对步骤(5)所述的待测物进行受体分析检测。
[0032]其中:
[0033]步骤⑴中受体蛋白BlaR-CTD的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0034]步骤⑵所述的重组的大肠杆菌(Escherichia coli)BlaRC于2013年5月6日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2013173 ；
[0035]步骤(5)中磷酸盐缓冲液按如下步骤制得:NaC18.0g, KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H202.9g，KC10.2g，加去离子水800mL充分溶解，调节pH值至7.4，补充去离子水定容至1000mL。
[0036]本发明的主要优点是:
[0037]1、本发明的受体能够识别15种β -内酰胺类药物，而现有文献和专利报道尚不能识别如此多种β-内酰胺类药物；
[0038]2、本发明建立的受体分析可以检测牛奶中规定了残留限量的11种内酰胺类药物的残留情况，检测限均在欧盟规定的MRL以下；
[0039]3、本发明还可以用来检测牛肉和鸡肉中的内酰胺类药物残留，适用范围广；
[0040]4、本发明在组织样品中的β -内酰胺类药物种类已知时，还可以对其进行定量分析；
[0041]5、本发明涉及的样品处理方法简便，易操作，准确度和精密度好。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的BlaR-CTD蛋白的基因片段的核苷酸序列，序列长度为765bp。
[0043]图1为本发明的技术路线图。
[0044]图2为重组表达质粒pET-28a_BIaR-CTD的图谱。
[0045]图3为本发明其中一个实施例的SDS-PAGE图，显示了受体蛋白BlaR-CTD表达和纯化的SDS-PAGE图。图中:泳道I为大肠杆菌BL21 (DE3)/pET_28a空载体诱导全菌蛋白，泳道2、3分别为大肠杆菌BlaRC诱导全菌蛋白和纯化后的重组蛋白。M为蛋白质分子量标准。
[0046]图4为本发明其中一个实施例的紫外扫描图谱，显示了辣根过氧化物酶标记的氨苄西林(HRP-AMP)的紫外吸收特征。
[0047]图5为本发明的受体蛋白与头孢喹肟标准品的受体分析法的反应曲线，其中X轴为头孢喹肟标准品溶液浓度的对数值，Y轴为对头孢喹肟标准品溶液的光密度值除以零孔光密度值(6/?)。
【具体实施方式】
[0048]下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
[0049]实施例1受体蛋白的制备
[0050]提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏号ATCC14580 (购于中国江苏省无锡市江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，为商业菌株和公开使用的菌株)的基因组，用引物 5' -cgcGGATCCATGCAAAGAGATACGCACTT-3'和 5' -ccgCTCGAGTTATCGGGAAGCGGATGG-Si进行PCR扩增(PCR扩增的方法为常用方法，参见:J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，北京，科学出版社，2002版)目的蛋白BlaR-CTD的基因。将该基因片段用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，插入到表达载体pET-28a的BamH 1-Xho I多克隆位点中，通过构建得到重组表达载体pET-28a-BlaR-CTD，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到表达该受体蛋白的重组大肠杆菌BlaRC。
[0051]将过夜培养的重组大肠杆菌BlaRC的液体培养物以体积比为1: 100的接种量加入到LB液体培养基(含终浓度为50 μ g/mL的卡那霉素)中，在37°C和250r/min的振荡培养箱中培养到菌液的0D_值为0.6-1.0 (对数生长期)，加入lmmol/L的IPTG，18°C下200r/min低温诱导12h。离心收集菌 体，用预冷的磷酸盐缓冲液(NaC18.0g，KH2PO40.2g,Na2HPO4.12H202.9g，KC10.2g，加去离子约800mL充分溶解，调节pH值至7.4，加去离子水定容至1000mL)洗涤两次后，经过压力破碎或者超声破碎得到含有目的蛋白的上清液。利用亲和层析纯化技术，在咪唑洗脱浓度为lOOmmol/L时重组受体蛋白纯度最高。收集IL的菌液可以纯化得到受体蛋白BlaR-CTD约20mg。经过透析除去咪唑，蛋白纯度能达到95%以上。
[0052]实施例2辣根过氧化物酶标记氨苄西林的制备
[0053]称取4.40mg辣根过氧化物酶(HRP)，溶于ImL的ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液中，倒入含有磁性粒子的棕色瓶中。称取2.40mg的碳化二亚胺(EDC)溶于500 μ L的磷酸盐缓冲液中，混匀后逐滴加入到棕色瓶中。随后称取1.SOmg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于500 μ L的磷酸盐缓冲液中，逐滴加入到棕色瓶中，在4°C条件下避光搅拌2h。以上反应液标记为A液。称取6.18mg的氨苄西林钠(AMP)，溶于ImL的磷酸盐缓冲液中，标记为B液。随后将B液缓缓的加入A液中，4°C条件下避光搅拌5h。
[0054]反应完成后，将上述反应液加入到透析袋中，在4°C置于磷酸盐缓冲液中透析3~4d。分别测定氨苄西林钠，辣根过氧化物酶和反应合成物的紫外全波长图谱，得到各物质的最大吸收波长，以此鉴定是否偶联成功。透析后的反应液加入等体积的甘油，置_20°C保存。
[0055]实施例3 β -内酰胺类抗生素多残留受体分析方法的建立
[0056]3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配置)
[0057]磷酸盐缓冲液( PBS):NaC18.0g, KH2PO40.2g，Na2HPO4.12Η202.9g，KC10.2g，加去离子约800mL充分溶解，调节pH值至7.4，加去离子水定容至1000mL。
[0058]洗涤液(PBST):NaC18.0g, KH2PO40.2g, Na2HPO4.12H202.9g, KC10.2g,Tween200.5mL,加去离子水约800mL,调节pH值至7.4,加去离子水定容至1000mL。
[0059]碳酸盐缓冲液(CBS) =NaCO3L 59g，NaHCO; 93g，加去离子水约800mL，调节pH值至9.6,加去离子水定容至1000mL。
[0060]BSA封闭液:准确称取牛血清白蛋白10g，加入1000mL的磷酸盐缓冲液，搅拌混匀
至蛋白完全溶解。
[0061]OVA封闭液:准确称取卵清白蛋白10g，加入1000mL的磷酸盐缓冲液，搅拌混匀至
蛋白完全溶解。
[0062]底物A液:准确称取四甲基联苯胺(TMB) 160mg,加入IOmL 二甲基乙酰胺(DMF)，搅
拌至完全溶解。
[0063]底物B液:准确称取柠檬酸13.70g、柠檬酸三钠10.14g和过氧化氢脲282.0Omg,超纯水溶解，定容至1000mL。
[0064]底物混合液:准确量取底物B液10mL，加入100 μ L底物A液，混匀，现配现用。
[0065]终止液:准确量取浓硫酸IOOmL,缓慢滴加到800mL超纯水中。
[0066]3.2包被原浓度的确定
[0067]采用方阵滴定法初步选择包被的蛋白浓度。选择标准以OD45tl值位于2.0附近，且相邻两孔OD值有较大变化的包被原浓度和对应的酶标药物稀释度为最佳组合。微量分光光度计测定蛋白浓度为0.5mg/mL,以该蛋白溶液为母液，以碳酸盐缓冲液配置不同浓度的蛋白，每孔100 μ L,置于4°C包被12h。甩出包被液,每孔加250 μ L洗漆液,静置2min后，尽量甩掉孔内的液体，并在吸水纱布上拍干；如此重复洗涤3次，拍干。每孔加入250 μ L封闭液，放入37°C湿盒中孵育2h。甩出孔内封闭液后，用洗涤液洗涤3次，拍干。每孔加入50 μ L的磷酸盐缓冲液，加入50 μ L不同浓度的倍比稀释的酶标药物HRP-AMP，最终每孔的体积1OOyL,混匀。37°C湿盒孵育lh。甩尽孔内液体后，洗涤液洗涤3次，拍干。加底物混合液100 μ L/孔，37°C湿盒中孵育15min。每孔加50 μ L终止液，用酶标仪测定OD45tl值。方阵滴定法结果如表1所示。
[0068]以OD45tl值在2.0左右，且相邻孔间差异较大时的最大稀释倍数作为受体蛋白效价，并以蛋白和酶标药物的使用量最少为原则，故可供选择的最优组合为蛋白稀释400倍，酶标药物稀释300倍。
[0069]表1受体蛋白的方阵滴定
[0070]
【权利要求】
1.一种能够识别β-内酰胺类抗生素的受体蛋白BlaR-CTD，其特征在于，该受体蛋白BlaR-CTD克隆在表达质粒pET_28a_BIaR-CTD中，表达受体蛋白BlaR-CTD的大肠杆菌(Escherichia coli)BlaRC保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M2013173，所述的受体蛋白Bl aR-CTD的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
2.—种β-内酰胺类抗生素残留检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的固相载体包被有如权利要求1所述的受体蛋白BlaR-CTD。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征包含下列组分: (1)由权利要求1所述的受体蛋白BlaR-CTD包被的固相载体，即酶标板； (2)头孢喹肟标准溶液6瓶，浓度分别为Oμ g/L、0.5 μ g/L、I μ g/L、2 μ g/L、4 μ g/L、8 μ g/L ； (3)辣根过氧化物酶标记氨苄西林的储存液； (4)IOX磷酸盐缓冲液，用下列方法制备得到:NaC180.0g，KH2P042.0g,Na2HPO4.12H2029.0g, KC12.0g,加去离子800mL充分溶解，调节pH值至7.4，补充去离子水定容至1000mL ；
(5)IOX 洗涤液，用下列方法制备得到:NaC180.0g, ΚΗ2Ρ042.0g, Na2HPO4.12Η2029.0g,KC12.0g, Tween205mL,加去离子水约800mL,补充去离子水定容至1000mL ； (6)底物A液，用下列方法制备得到:准确称取四甲基联苯胺160mg，加入IOmL二甲基乙酰胺，搅拌完全溶解； (7)底物B液，用下列方法制备得到:准确称取柠檬酸13.70g、柠檬酸三钠10.14g和过氧化氢脲282.0Omg，用少量超纯水溶解，定容至1000mL ； (8)终止液，用下列方法制备得到:准确量取浓硫酸IOOmL,缓慢滴加到800mL超纯水中； 使用时，将IOX磷酸盐缓冲液和IOX洗涤液分别用去离子水稀释十倍得到样品稀释液和洗涤液，将辣根过氧化物酶标记氨苄西林的储存液用磷酸盐缓冲液稀释300倍得到酶标药物工作液，将底物A液和底物B液按体积比为1: 10混匀得到底物混合液。
4.一种同时检测β_内酰胺类抗生素残留的受体分析方法，其特征包括下列步骤: (1)以地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ATCC14580的基因组为模板，利用PCR扩增得到受体蛋白BlaR-CTD的基因片段，将该基因片段插入到表达载体pET_28a中，得到重组表达质粒pET-28a-BIaR-CTD ； (2)将步骤(1)所述的重组表达质粒pET-28a-BlaR-CTD转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组的大肠杆菌(Escherichia coli) BlaRC,进一步诱导表达得到受体蛋白BlaR-CTD,对该受体蛋白进行亲和纯化； (3)采用碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)法合成酶标药物，即辣根过氧化物酶标记的氨节西林HRP-AMP ； (4)用步骤(2)所述的受体蛋白BlaR-CTD包被固相载体，即酶标板； (5)将待测样品用弱碱性的磷酸盐缓冲液提取，离心取上清为待测物； (6)对步骤(5)所述的待测物进行受体分析检测。 其中: 步骤(1)中受体蛋白BlaR-CTD的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；步骤(2)所述的重组的大肠杆菌(Escherichia coli)BlaRC保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M2013173 ； 步骤(5)中磷酸盐缓冲液，按如下步骤制得:NaC18.0g, KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H202.9g，KC10.2g，加去离子水800mL充分溶解，调节pH值至7.4，补充去离子水定容至1000mL。
5.权利要求1所述的受体蛋白BlaR-CTD在制备同时检测β-内酰胺类抗生素的受体分析试剂盒中的应用。
6.权利要求2或 3所述的试剂盒在β-内酰胺类抗生素残留检测中的应用。
【文档编号】C07K14/32GK103897046SQ201310196144
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年5月23日 优先权日:2013年5月23日
【发明者】袁宗辉, 彭娟, 程古月, 王晨曦, 王玉莲, 彭大鹏, 郝海红, 黄玲利, 陶燕飞, 陈冬梅, 戴梦红, 王旭, 谢书宇, 刘振利, 谢长清 申请人:华中农业大学