一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1及其应用，所述基因PeARF17.1的DNA序列如SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明通过将PeARF17.1基因转入杨树，过量表达PeARF17.1的转基因杨无明显主干，丛生状态，根茎结合部扁平，不定根数显著增多，说明杨树生长素响应因子基因PeARF17.1是控制杨树生长发育的关键调节因子，在林木基因工程领域有重要应用价值。
【专利说明】—种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因/7M/?厂/7.1及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程【技术领域】，具体涉及一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1及其应用。
【背景技术】
[0002]杨树是我国重要的速生工业用材树种和绿化造林树种，加快杨树育种的应用基础研究具有紧迫性和必要性。据第七次全国森林资源清查统计，截止2008年底，我国杨树人工林总面积已超过700万公顷，居世界第一，杨树木材产量占全国木材总量的30%左右。目前国内外杨树育种的发展趋势主要表现在两个方面，一方面继续以常规育种为主，不断完善育种技术，由过去的单一追求产量为育种目标发展到与工业用材相结合的生长、材性、干形、资源利用等多性状联合改良为目标的定向育种；另一方面加快生物技术在杨树育种中的应用，发展分子育种技术体系。
[0003]生长素调节植物生长发育的各个阶段。生长素响应因子(Auxin responsefactor, ARF)在生长素信号转导中起着转录“开关”作用，调控生长素响应基因的表达，促进或抑制植物的生长发育和形态建成。ARF转录因子，通过识别并结合生长素响应基因启动子区域的TGTCTC生长素响应元件(AuxRE)来激活或抑制该基因的表达。同其它转录因子一样，ARF具有一些特定结构域，一般包括氨基端DNA结合域(DBD)、中间激活区(AD)或抑制区(RD)及羧基末端的二聚体功能域(CTD)，其中CTD区域可与Auxin/IAA形成二聚体，抑制生长素响应基因表达。
[0004]ARF转录因子在植物体内以家族的形式存在，并且物种之间的^^基因存在一定的同源性。当前，有关基因家族功能的阐释主要来自于对拟南芥、水稻和玉米等草本植物的研究，加之基因家族成员之间存在功能冗余现象，因此并不是所有的基因功能都能得到很好的解析，而且草本植物中的基因家族分支不能完全代表高等植物中所有ARF的功能和特征，所以在多年生木本植物中对ARF家族进行研究将有助于人们深入认识和理解基因家族及其生长素信号在植物生长发育过程中的调控模式。
[0005]目前，在杨树中尚未有基因家族克隆和功能研究的相关报道。克隆和开发利用这些基因资源，不仅有助于阐明林木生长发育的分子调节机制，而且还能促进林木分子育种进程，对农、林与园艺业的发展具有不可估量的价值。
【发明内容】
[0006]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因7.1。本发明的另一目的是提供一种杨树生长素响应因子基因I的应用。
[0007]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因2，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0008]含有所述的杨树生长素响应因子基因PeARFl 7.1的载体。所述载体在PeARFl 7.1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S。所述载体在I基因的3’端组装有强终止子N0S。所述载体组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选。所述载体组装有能促使组装于其间的7基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中的LB和RB序列。
[0009]含有所述的杨树生长素响应因子基因7.1的宿主细胞。
[0010]所述的杨树生长素响应因子基因I在调控杨树生长发育过程中的应用。
[0011]所述的杨树生长素响应因子基因PeARFl 7.1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0012]本发明以南林895杨不定根为材料，通过RACE技术克隆了7基因。同时，采用通路克隆技术构建其杨树过量表达载体pH35GS-PeARF17.1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，I可在杨树体内高效表达，从而调控杨树的生长和发育。其中，I基因是调控杨树生长发育的关键基因。
[0013]有益效果:本发明通过将/^7^7 7.7基因转入杨树，过量表达作他朽7.1的转基因杨无明显主干，丛生状态，根茎结合部扁平，不定根数显著增多，说明7.7基因是控制杨树生长发育的关键调节因子，在林木基因工程领域有重要应用价值。 【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是植物表达载体pH5GS的结构示意图；
图2良PeARF17.1基因在杨树不定根发生发育过程中的表达模式图；
图3是过量表达7^4^27.1的转基因杨的分子检测图；
图4是过量表达I的转基因杨与未转基因杨的整体形态对比图，图中，左边为转基因杨，右边为未转基因杨；
图5是过量表达I的转基因杨与未转基因杨根系比较图，图中，左边为转基因杨，右边为未转基因杨。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中未进行详尽说明的操作可参照生物学实验手册、相关试剂盒使用说明以及生物领域中的常规操作实现。
[0016]实施例1通过RACE技术克隆PeARFl 7.7基因
以南林895杨初生不定根为材料，采用常规方法提取符合使用要求的cDNA、RNA。使用Oligo 6设计特异性引物扩增7基因短片段，其中，/^4^77.7短片段正向引物为:5’ -AGGGCAAAGTGAAGGTAGAG-3’，PeARF17.7短片段反向引物为:5’ -GTAGGAGGAAGTCAGTGAAAGT-3’。高保真 PCR 反应体系如下:10XLA PCR Buffer(Mg2+ free) 5.0 μ I ；2.5mM dNTP Mixture 8.0 μ I ；25mM Mg2+ 5.0 μ I ；LA Taq DNAPolymerase (5U/μ I) 0.5 μ I ;正向引物(10 μ Μ) 2μ1;反向引物(10 μ Μ) 2μ1;模板(895 杨 cDNA) I μ I ;加无菌 ddH20 补足 50 μ I。反应程序:预变性 94°C 3min ；94°C 30s，55°C 30s, 72°C 30s，35个循环；72°C IOmin0对产物测序，获得的7基因短片段序列如SEQ ID N0.3所示。
[0017]依据上述I基因短片段序列设计3’末端的RACE引物，进行3’ RACE,获得3’ cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序，Blast确认上述片段与其它植物相关的基因同源。以相同的方法，根据获得的正确的3’ cDNA末端片段序列设计5’末端的RACE引物，进行5’ RACE，获得5’ cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序。
[0018]3，RACE 正向引物:3’ RACE gene-spec i f i c outer primer:5’-AGGGCMAGTGAAGGTAGAGGAG-3’，3’ RACE gene specific inner primer:5’-GATCTMCTAATTCAACTATGGGGCACACG-3’； 3’ RACE Outer Primer: 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3’，3’ RACE Inner Primer: 5’-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG-3’ ； 5’ RACEOuter Primer:5’-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3’，5’ RACE Inner Primer:5'-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3’ ； 5’ RACE gene-specific outer primer:5’-AGTAGGACATGCTTCAACAGGTG-3’，5’ RACE gene specific inner primer:5' -ACAGGTGAAGCTCTTTGGCATTGGGCAT-3’。
[0019](1)3，RACE 反应
I)反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中:lyg TotalRNA,4μ L dNTP Μ?χ,2μ L 3’ RACE Adapter,2y L 10X RT Buffer, I μ L RNase Inhibitor,IuL M-MLV Reverse Transcriptase, Nuclease-free Water 补齐 20μL。轻轻混匀，短暂离心，42°C温育Ih ;进入PCR步骤，或_20°C保存反应物。
[0020]2)3’ RACE 巢式 PCR
反应体系:0uter 3’ RACE Component:5.0 μ L 10XLA PCR BufferCMg2+ Free), 5.0uLMgCl2C25mM), 8.0uL dNTP Mixtur`eCeach 2.5mM), 2.0 μ L 3’ RACE gene-specific outerprimer,2.0 μ L 3' RACE Outer Primer (10 μ M),I μ L RT reaction product,0.5 μ LTakaRa LA Taq (5U/ μ L), 26.5 μ L Nuclease-free Water, Total volume50liLo Inner 3’RACE Component:5.0μ L 10XLA PCR Buffer (Mg2+ Free), 5.0μ L MgCl2 (25mM),8.0μ LdNTP Mixture (each 2.5mM),2.0 μ L 3' RACE gene specific inner primer,2.0 μ L 3'RACE Inner Primer (10 μ M),I μ L Outer 3’ RACE PCR product,0.5 μ L TakaRa LA Taq(5U/ μ L), 26.5 μ L Nuclease-free Water, Total volume50uL。
[0021]反应程序:94°C,3min;94°C，30sec，60 °C，30sec，72 °C，1.5min, 35cycles ；72°C,7min。
[0022]3)纯化片段与克隆载体的连接反应:采用TaKaRa公司的pMD19_T simple Vetor克隆目的DNA分子，参考说明书，连接反应体系与程序稍有改进。反应体系(5 μ L):2.2 μ L纯化回收的 PCR 产物，0.3μ L pMD-19 Simple Vector, 2.5μ L Solution I。反应条件:16 °C2min ;4°C 过夜。
[0023]4)大肠杆菌转化:将新鲜制备或_70°C冻存的大肠杆菌T0P10感受态细胞在冰上融化；取5 μ L纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100 μ L感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；42°C水浴中热击90sec，迅速置于冰上3_5min ;加入800 μ L LB液体培养基，370C &100rmp摇菌Ih ；4000rmp离心3min，吸掉上层800 μ L培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37 °C倒置培养过夜。[0024]5)阳性克隆筛选及测序分析:从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37°C&250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。反应体系(20.0μ L):2.0μ L 10XPCR BufferCMg2+ free), 1.2μ L MgCl2 (25mM), 1.6μ L dNTPMixture (each 2.5mM),1.0 μ L 3’ RACE gene specific inner primer (10 μ M),1.0 μ L3’ RACE Inner Primer (10 μ M), 1.0 μ L 菌液，0.2 μ L rTaq, 12.0 μ L Mill1-Q Water0 反应程序:94°C,3min ;94°C，30sec，60°C，30sec，72°C，lmin，28cycles ；72°C,7min0 菌液 PCR检测为阳性的克隆送英骏生物技术公司(上海)测序鉴定。
[0025](2)5，RACE 反应
I) RNA 处理(RNA Processing)
CIP反应，将如下成分加入到RNase-free的小离心管中:10 μ g Total RNA, 2 μ LIOX CIP buffer,2 μ L Calf Intestine Alkaline Phosphatase (CIP), Nuclease-freeWater补齐20 μ L。轻混匀，短暂离心；37°C温育lh。加入以下试剂到CIP反应离心管:15 μ L Ammonium Acetate Solution,115 μ L Nuclease-free Water,150 μ L acidphenol: chloroform。充分润旋，室温高速离心(兰10000 g) 5min。转移上层水相到一个新的离心管中，加入150yL氯仿，充分涡旋，室温高速离心(兰10000 g) 5min。转移上层水相到一个新的离心管中，加入150 μ L异丙醇，充分润旋,冰浴lOmin。最大转速离心20min,用0.5mI预冷的70%乙醇冲洗沉淀,最大转速离心5min,小心弃乙醇,气干沉淀。以
11μ LNuclease-free Water重悬沉淀，即得CIP’ RNA,冰上放置进一步用于TAP反应，或者-20°C保存。TAP反应，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中:5 μ L CIP’ dRNA (from f above), IuL 10X TAP buffer, 2 μ L Tobacco Acid PyrophosphataseCTAP),2 μ L Nuclease-free Water。轻轻混匀，短暂离心，37°C温育 lh,即得 CIP/TAP-treatedRNA ;进入接头连接步骤，或_20°C保存反应物。5’ RACE接头连接，把以下成分加入到一个RNase-free 的小离心管中:2 μ L CIP/TAP-treated RNA, I μ L 5，RACE Adapter, I μ L 10XRNA Ligase Buffer, 2 μ L T4 RNA Ligase (2.5U/ μ L), 4 μ L Nuclease-free Water0 轻轻混匀，短暂离心，37°C温育Ih,即得Ligated RNA ;进入反转录步骤,或_20°C保存反应物。
[0026]2)反转录(Reverse Transcription):将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free 的小离心管中；2 μ L Ligated RNA, 4 μ L dNTP Mix, 2 μ L Random Decamers,
2μ L 10X RT Buffer,I μ L RNase Inhibitor,I μ L M-MLV Reverse Transcriptase,Nuclease-free Water 补齐 20μL。轻轻混匀，短暂离心；42°C 温育 lh,即得 RT reaction ；进入PCR步骤，或_20°C保存反应物。
[0027]3) 5’ RACE巢式PCR:反应体系、反应条件与3’ RACE的巢式PCR —致。
[0028]4) PCR产物克隆测序，操作与3’ RACE克隆一致，获得基因序列片段。Blast确认该片段与拟南芥基因高度同源。
[0029]采用BioEdit软件对3’ RACE和5’ RACE序列进行比对拼接，并使用 FGENESH (http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php7topic =fgen)予页测其阅读框。根据基因全长序列设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，再次进行PeARF17.7基因的全长扩增和测序验证。其中，PeARF17.1 ORF正向引物为:5’-ATGCCGCAACTGACGGAGCTCAGC-3’，PeARF17.1 ORF 反向引物为:5’ -TCAAGTAGGACATGCTTCAACAGGT-3’ ；高保真 PCR 反应体系如下:10 X LA PCR Buffer(Mg2+ free) 5.0 μ I ；2.5mM dNTP Mixture 8.0 μ I ；25mM Mg2+ 5.0 μ I ；LA Taq DNAPolymerase (5U/μ I) 0.5 μ I ;正向引物(10 μ Μ) 2μ1;反向引物(10 μ Μ) 2μ1;模板(895 杨 cDNA) I μ I ;加无菌 ddH20 补足 50 μ I。反应程序:预变性 94°C 3min ；94°C 30s，55°C 30s, 72°C 2min，35 个循环；72°C IOmin0
[0030]最终获得基因全长cDNA序列为2178bp，包含一个1779bp的完整阅读框，命名为PeARF17.1基因，序列如SEQ ID N0.1所示，其所编译表达蛋白序列如SEQ ID N0.2所示。
[0031]实施例2 PeARF17.1基因植物表达载体构建
利用通路克隆技术构建I基因的过量表达载体。使用特异PCR引物(实施例1饱PeARF17.1 ORF引物)，以cDNA为模板，进行PCR扩增，将/?他？77.1基因ORF构建到入门载体。入门载体为 pCRTM8/GW/T0P0? vector (Invitrogen)。反应体系为:Fresh PCRproduct (purified) 80ng ；Salt solution 0.5 μ I ；pCR?8/Gff/T0P0? vector 0.5μ1;加无菌ddH20补足3μ I。反应程序为:22°C反应2h。
[0032]从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，带I基因的入门载体与植物表达载体PH35GS进行LR反应。载体质粒如图1所示。反应体系为:linearized entry clone 50ng ；purified destination vector 75ng；LR Clonase
Π enzyme mix 0.5 μ I ;加 TE (pH 8.0)补足 2.5 μ I ;。反应条件:25°C 2_3h。经 LR 反应后PeARF17.1基因导入植物表达载体pH35GS中，在I基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，它能使I基因在杨树体内高效表达?灰PeARFl7.1基因的3’端组装了强终止子NOS，可有效终止7.1基因的转录；在载体质粒上组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选；在载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的7.1基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中。通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为pH35GS-PeARF17.1，该基因位于启动`子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，I可在杨树体内高效表达。
[0033]实施例3 PeARF17.1基因的遗传转化
通过液氮冻融法将所构建的pH35GS-PeARF17.1过量表达载体转入农杆菌菌株EHA105(Invitrogen),通过农杆菌介导将7基因转入杨树。实验结果如图1~5所不，图1是植物表达载体PH35GS的结构示意图；图2 % PeARF17.1基因在杨树不定根发生发育过程中的表达模式；图3为过量表达I的转基因杨的分子检测；图4为过量表达PeARF17.1的转基因杨与未转基因杨的整体形态比较，图中，左边为转基因杨，右边为未转基因杨；图5为过量表达I的转基因杨与未转基因杨根系比较，图中，左边为转基因杨，右边为未转基因杨。从结果可以明显得出，过量表达I的转基因杨无明显主干，丛生状态，根茎结合部扁平，不定根数显著增多，说明7.1基因是调控杨树生长发育的关键调节因子，在林木基因工程领域有重要应用价值。
【权利要求】
1.一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因7，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
2.含有权利要求1所述的杨树生长素响应因子基因7.1的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于:所述载体在7^4^27.1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S。
4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于:所述载体在7^4^27.1基因的3’端组装有强终止子NOS。
5.根据权利要求2所述的载体，其特征在于:所述载体组装HPT基因表达盒，所述HPT基因表达盒作为转基因杨树的筛选标记，用潮霉素进行转基因杨树的筛选。
6.根据权利要求2所述的载体，其特征在于:所述载体组装有能促使组装于其间的PeARF17.1基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中的LB和RB序列。
7.含有权利要求1所述的杨树生长素响应因子基因7.1的宿主细胞。
8.权利要求1所述的杨树生长素响应因子基因2在调控杨树生长发育过程中的应用。
9.权利要求1所述的杨树生长素响应因子基因7.1的表达蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。`
【文档编号】C07K14/415GK103865952SQ201410067980
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】胥猛, 杨春霞, 黄敏仁 申请人:南京林业大学