专利名称：用于治疗il－5介导的疾病的重组il－5拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及抗体和改变的抗体(altered antibodies)领域，用于治疗和诊断IL-5介导的病症和与嗜曙红细胞过量产生有关的病症，更具体地说，涉及mAb、Fab、嵌合的和人源化的抗体。
背景技术：
嗜曙红细胞被认为与许多炎症疾病状态的病因有关，这些疾病包括与肺组织的过敏反应有关的变态疾病(Butterfield等，Immunopharmacology ofEosinophils，H.Smith and R.Cook，Eds.，p.151-192，Academic Press，London(1993))。一个著名的实例是气喘，该疾病的特征是空气通路的可逆性阻塞，导致非特异性的支气管过敏。而这又依赖于支气管粘液水平的慢性炎症反应的生成，以及巨噬细胞、淋巴细胞和嗜曙红细胞的特征性侵入。看来嗜曙红细胞在起始疾病的典型粘液损伤中起到关键作用(Corrigan等，Immunol.Today，13501-507(1992))。据报道，在患有慢性气喘的病人的循环系统、支气管分泌物和肺实质中，活化的嗜曙红细胞的数量增加，并且通过对不同肺功能的测试测量出，疾病的严重程度与血液嗜曙红细胞数相关(Griffen等，J.Aller.Clin Immunol.67548-557(1991))。嗜曙红细胞数量增加，通常在去粒过程中，也在进行晚期气喘反应的患者的支气管肺泡洗出液(bronchoalveolar lavage，BAL)中收集到；嗜曙红细胞减少，通常是类固醇治疗的结果，与临床症状的改善有关(Bousquet等，N.Eng.J.Med.，3231033-1039(1990))。
白介素5(IL-5)是主要由活化的CD4+T淋巴细胞产生的同二聚体糖蛋白。在人体中，IL-5主要负责控制嗜曙红细胞的生长和分化。在气喘患者的支气管泡洗出液中检测到IL-5水平升高(Motojima等，Allergy，4898(1993))。在没有抗原的刺激下，IL-5转基因小鼠的外周血和组织显示出显著的嗜曙红细胞水平(Dent等，J.Exp.Med.，1721425(1990))，而且抗鼠IL-5单克隆抗体具有在小鼠的血液和组织中减少嗜曙红细胞(Hitoshi等，Int.Immunol.，3135(1991))，以及在实验动物中减少与寄生物感染和过敏原攻击有关的嗜曙红细胞的作用(Coffman等，Science，245308-310(1989)，Sher等，Proc Natl Acad.Sci.，8361-65(1990)，Chand等，Eur.J.Pharmacol.，211121-123(1992))。
虽然皮质类固醇对抑制嗜曙红细胞数量和气喘的其他炎症成分有显著的作用，但它们对严重气喘，以及近来发现的对温和至中等气喘有副作用。仅有的另一种主要抗炎药物治疗-色甘酸(色甘酸钠和nedocromil)-被认为具有比皮质类固醇少的副作用。它们的精确作用机制仍然未知。
近来的开发工作集中于新的吸入的类固醇、长作用支气管舒张剂和作用于新的生化或药理学靶的药剂(例如钾通道激活剂、白三烯拮抗剂、5-脂加氧酶(5-LO)抑制剂等)。一种理想的药物应当将类固醇的有效性和色甘酸钠的安全性结合起来，并具有较高的选择性和快速作用的能力。中和IL-5抗体可能对治疗人的与嗜曙红细胞有关的疾病有用。
因此，本领域中需要一种高亲和性的IL-5拮抗剂，如人IL-5的中和单克隆抗体，它能减少嗜曙红细胞的分化和增殖(即嗜曙红细胞的积累)，由此减少嗜曙红细胞炎症发明概述在第一方面，本发明提供啮齿动物(例如大鼠和鼠)中和单克隆抗体，该抗体对人IL-5有特异性，并具有一定的结合亲和性，该亲和性的特征在于，解离常数等于或小于大约35×10-11M，如发明详述中所述。这些单克隆抗体的实例是鼠单克隆抗体2B6、2E6和2F2，以及大鼠单克隆抗体，如4A6。本发明的另一方面是一些杂交瘤，例如SK119-2B6.206.75(1)、SK119-2E3.39.40.2、SK119-2F2.37.80.12、4A6(1)G1F7和5D3(1)F5D6。
在相关方面，本发明提供中和Fab片段或通过去除本发明的啮齿动物中和单克隆抗体的Fc区得到的，对人IL-5有特异性的F(ab′)2片段。
在另一个相关方面，本发明提供中和Fab片段或通过链改组(shuffling)技术得到的，对人IL-5有特异性的F(ab′)2片段，由此，分离自本发明啮齿动物中和单克隆抗体的重(或轻)链免疫球蛋白，被轻链(或相应的重链)免疫球蛋白文库表达，该文库用IL-5免疫的啮齿动物，存在与纤毛噬菌体Fab显示文库中。
在另一个相关方面，本发明提供对人IL-5有特异性的改变的抗体，它包括来源于非人类中和单克隆抗体(mAb)的互补决定区(CDR)，非人类中和单克隆抗体的特征在于，人类IL-5和编码它的核酸分子的解离常数等于或小于大约3.5×10-11M。当改变的抗体是人源化的抗体时，来源于非人类免疫球蛋白的，编码互补决定区的序列被插入第一免疫球蛋白配对物(partner)，在该配对物中，第一免疫球蛋白配对物的至少一个，优选全部的互补决定区(CDR)被来源于非人类单克隆抗体的CDR置换。优选地，第一免疫球蛋白配对物也与第二免疫球蛋白配对物可操作地连接(operativelylinked)，第二免疫球蛋白配对物包括免疫球蛋白恒定区的全部或部分。
在相关方面，本发明提供来源于非人类中和单克隆抗体(mAb)的CDR，其特征在于，人类IL-5和编码所述CDR的核酸分子的解离常数等于或l小于大约3.5×10-11M。
在另一个相关方面，本发明提供一种嵌合抗体，该抗体含有来源于非人类中和单克隆抗体的人类重链和轻链恒定区以及重链和轻链可变区，其特征在于，对人类IL-5的解离常数等于或小于大约3.5×10-11M。
在另一个相关方面，本发明提供一种药物组合物，它含有一种(或多种)上面描述的改变的抗体和药用载体。
在另一方面，本发明提供一种治疗与嗜曙红细胞过量产生有关的人类疾病的方法，该方法是提供对人施用有效量的本发明药物组合物来完成的。
在另一方面，本发明提供改变的抗体(例如工程化的抗体、CDR、Fab或F(ab)2片段，或其类似物)的重组制备方法和有用的成分，该抗体来源于非人类中和单克隆抗体(mAb)，其特征在于，对人类IL-5的解离常数等于或小于大约35×10-11M。这些成分包括编码它们的分离的核酸序列，含有在特定调节序列控制下的核酸序列的重组质粒，所述调节序列能够指导核酸序列在被重组质粒转染的宿主细胞(优选哺乳动物)中表达。该制备方法包括在改变的抗体(优选人源化抗体)可以在所述细胞中表达的条件下培养本发明的被转染的宿主细胞系，并从中分离表达产物。
在另一方面，本发明提供诊断与嗜曙红细胞在人体中过量产生有关的疾病的方法，其包括从患者体内获得生物液样本，使本发明的抗体和改变的抗体与该样本接触，所用条件使得IL-5/(单克隆或改变的)抗体复合物得以形成，检测IL-5/抗体复合物存在与否。
本发明的其他方面和优点在发明详述和优选实施方案中进一步描述。
附图简述
图1[SEQ ID NO1和15]表明鼠抗体2B6和鼠/人抗体2B6嵌合抗体的重链可变区。方框区指示CDR。
图2[SEQ ID NO2和16]表明鼠和鼠/人抗体2B6嵌合抗体的轻链可变区。方框区指示CDR。
图3[SEQ ID NO3]表明鼠抗体2F2的重链可变区。方框区指示CDR。
图4[SEQ ID NO4]表明鼠抗体2F2的轻链可变区。方框区指示CDR。
图5[SEQ ID NO5]表明鼠抗体2E3的重链可变区。方框区指示CDR。
图6[SEQ ID NO6]表明鼠抗体2E3的轻链可变区。方框区指示CDR。
图7[SEQ ID NO7-14]表明鼠抗体2B6、2F2和2E3的重链和轻链可变区。
图8[SEQ ID NO18，19]表明人源化的抗体2B6的重链可变区。方框区指示CDR。
图9[SEQ ID NO20，21]表明人源化的抗体2B6的轻链可变区。方框区指示CDR。
图10是质粒pCDIL5HZHC1.0的示意图，该质粒用于在哺乳动物细胞中表达人源化的重链基因。该质粒含有β乳糖酶基因(BETA LAC)、SV-40复制起始区(SV40)、巨细胞病毒启动子序列(CMV)、一段信号序列、人源化的重链、来自牛生长激素(BGH)的polyA信号、β珠蛋白启动子(betaglopro)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和另一种BGH序列polyA信号，它们位于pUC19背景中。
图11是质粒pCNIL5HZHC1.0的示意图，该质粒用于在哺乳动物细胞中表达人源化的轻链基因。
图12[SEQ ID NO61，62]表明人源化的抗体2B6的NewM重链可变区。方框区指示CDR。
图13[SEQ ID NO69，70]表明人源化的抗体2B6的REI轻链可变区。方框区指示CDR。
发明详述本发明提供多种抗体、改变的抗体及其片段，其特征在于人类IL-5结合的特异性、中和活性和对人类IL-5的高亲和性，这些特征由鼠单克隆抗体2B6例示。本发明的抗体可通过常规杂交瘤技术、噬菌体显示组合文库、免疫球蛋白链改组以及人源化技术制备，以得到新的中和抗体。这些产物可用于治疗IL-5介导的疾病(如气喘)的治疗和药物组合物。这些产物也可用于通过测量(例如通过酶联免疫检测(ELISA))人体内源IL-5水平或由激活的细胞间接体内(exvivo)释放的IL-5，来诊断IL-5介导的病症。
1.定义“改变的抗体”指由改变的免疫球蛋白编码区编码的蛋白，它可以通过在特定宿主细胞中表达得到。这些改变的抗体是工程化的抗体(例如嵌合抗体或人源化的抗体)或抗体片段，该抗体片段缺少免疫球蛋白恒定区(例如Fv、Fab或F(ab)2等)的全部或部分。
“改变的免疫球蛋白编码区”指编码本发明的改变的抗体的核酸序列。当改变的抗体是移植的CDR或人源化的抗体时，来源于非人类免疫球蛋白的互补编码决定区(CDR)的序列被插入第一免疫球蛋白配对物中，该配对物含有人类可变框架序列。任选地，第一免疫球蛋白配对物与第二免疫球蛋白配对物可操作地连接。
“第一免疫球蛋白配对物”指编码人类框架或人类免疫球蛋白可变区的核酸序列，其中天然(或天然存在的)CDR编码区被供体抗体的CDR编码区置换。人类可变区可以是免疫球蛋白重链、轻链(或两种链同时存在)、其类似物或功能性片段。这些CDR区位于抗体(免疫球蛋白)的可变区内，可以用本领域已知的方法确定。例如，Kabat等(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，4th Ed，U.S.Department of Health and HumanServices，National Institutes of Health(1987))公开了CDR的定位方法。此外，可用于鉴定CDR区/结构的计算机程序也是已知的。
“中和”指一种抗体通过阻止人类IL-5与其特异性受体结合，或抑制IL-5通过其受体的信号来抑制IL-5活性，应使结合发生。如果在B13细胞生物检测中(IL-5中和检测，见实施例2C)，一种mAb对抑制IL-5活性是90％有效的，优选95％有效的，最有效100％有效的，则该mAb是中和性的。
术语“高亲和性”指抗体具有一种结合亲和性，其特征在于，在光学生物传感器分析中(见实施例2D)，对人类IL-5的Kd等于或小于3.5×10-11M。
“对人类IL-5结合的特异性”指对人而不是鼠的IL-5的高亲和性。
“第二免疫球蛋白配对物”指另一编码蛋白或肽的核酸序列，第一免疫球蛋白配对物在框架内或以任意合适的连接序列(即可操作连接)与之融合。优选地，它是免疫球蛋白基因。第二免疫球蛋白配对物可包括一段核酸序列，该序列编码同样(即同源的-第一和第二改变的可以来自同一来源)或另一(即异源的)感兴趣的抗体的全部恒定区。它可以是免疫球蛋白的重链或轻链(或同时具有两种链，它们作为单一多肽的一部分)。第二免疫球蛋白配对物不限于具体的免疫球蛋白类型或同种型。此外，第二免疫球蛋白配对物可包含免疫球蛋白的恒定区的一部分，例如Fab或F(ab)2的一部分(即合适的人类恒定区或框架区的离散部分)。这样的第二免疫球蛋白配对物可包含编码整合膜蛋白的序列，该蛋白暴露于宿主细胞的外表面，例如噬菌体显示文库的一部分，或编码用于分析性或诊断性检测的蛋白(例如辣根过氧化物酶、β半乳糖苷酶等)。
术语Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2以它们的标准含义使用(见例如，Harlow等，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1988))。
本文所用的术语“工程化的抗体”描述一种改变的抗体，即全长合成的抗体(例如针对一个抗体片段的嵌合的或人源化的抗体)，其中特定受体抗体的轻链和/或重链可变结构域的一部分被来自一个或多个供体抗体的类似部分替换，所述供体抗体对特定表位具有特异性。例如，这类分子可包括这样一些抗体，其特征在于，人源化的重链与未修饰的轻链(或嵌合的轻链)相连，反之亦然。工程化的抗体的特征也可以是编码受体抗体轻链和/或重链可变结构域框架区(framework regions)的核酸序列发生改变，使之保留供体抗体结合特异性。这些抗体可包含用来自本文描述的供体抗体的CDR替换来自受体抗体的一个或多个CDR。
“嵌合抗体”指一类工程化的抗体，其包含来源于供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)，以及来源于受体抗体的轻链和重链恒定区。
“人源化抗体”指一类工程化的抗体，其CDR来源于非人类供体免疫球蛋白，分子中残余的来源于免疫球蛋白的部分来源于一种(或多种)人类免疫球蛋白。此外，框架支持残基可被改变以维持结合亲和性(见例如，Queen等，Proc.Natl Acad Sci USA，8610029-10032(1989)，Hodgson等，Bio/Technology，9421(1991))。
术语“供体抗体”指这样一种(单克隆或多克隆)抗体，它将其可变区、CDR或其他功能片段或其类似物提供给第一免疫球蛋白，以提供改变的免疫球蛋白编码区和所得的表达的抗体，该抗体具有供体抗体的抗原特异性或中和活性特征。一种适用于本发明的供体抗体是命名为2B6的非人类(即鼠的)中和单克隆抗体。抗体2B6被限定为高亲和性的、人类IL-5特异性的(即不识别鼠IL-5)同种型IgG1的中和抗体，它在合适的鼠IgG恒定区内，分别具有SEQ ID NO2和16的可变轻链DNA和氨基酸序列，以及SEQ ID NO1和15的可变重链DNA和氨基酸序列。
术语“受体抗体”指与供体抗体异源的(单克隆或多克隆)抗体，它将编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区全部(或任意部分，但优选全部)的核酸序列贡献给第一免疫球蛋白配对物。优选地，人类抗体是该受体抗体。
“CDR”被限定为一种抗体的互补决定区氨基酸序列，它是免疫球蛋白重链和轻链的超可变区。见例如，Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，4th Ed.，U.S. Department of Health and HumanServices，National Institutes of Health(1987)。免疫球蛋白的可变部分中有三种重链CDR和三种轻链CDR(或CDR区)。因此，本文所用“CDR”指全部三种重链CDR，或全部三种轻链CDR(或全部重链和轻链CDR，若合适的话)。
在抗体与抗原或表位结合时，CDR提供主要的接触残基。本发明感兴趣的CDR来源于供体抗体可变重链和轻链序列，包括天然存在的CDR的类似物，该类似物分享或维持与和它来源相同的供体抗体同样的抗原结合特异性和/或中和能力。
“分享抗原结合特异性或中和能力”指，例如，虽然mAb可能具有某种程度的抗原亲和性，但被2B6核酸序列编码的CDR在适当的结构环境中可能具有较低的或较高的亲和性。人们希望2B6的CDR在这样的环境中与2B6识别相同的表位。2B6重链CDR的实例包括SEQ ID NO7、SEQID NO8、SEQ ID NO9，2B6轻链CDR的实例包括SEQ ID NO10、SEQID NO11和SEQ ID NO12。
“功能性片段”是重链或轻链可变序列的一部分(例如免疫球蛋白可变区的氨基或羧基末端的小的缺失)，它保留了与产生该片段的抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。
“类似物”是至少一个氨基酸被修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是化学性的，或是少量氨基酸(即不超过10个)的替换或重排，该修饰使得氨基酸序列保留未修饰的序列的生物学特性，例如抗原特异性和高亲和性。例如，当在CDR编码区内或周围产生了某些内切核酸酶限制性位点时，可以通过替换构建(不活动)突变。
类似物也可由等位变异产生。“等位变异或修饰”是编码本发明的氨基酸或肽序列的核酸序列中的改变。这种变异或修饰可来自于遗传密码的简并性，或被精心地工程化，以提供所需的特性。这些变异或修饰可以或不可以导致任何所编码的氨基酸序列发生改变。
术语“效应子试剂”指非蛋白载体分子，改变的抗体和/或供体抗体的天然或合成的轻链或重链，或供体抗体的其他片段可通过常规方式与之相连。这样的非蛋白载体可包括诊断领域所用的常规载体，例如聚苯乙烯或其他塑料珠，多糖，如BIAcore[Pharmacia]系统中所用的，或其他可用于医药领域的非蛋白物质，它们对人和动物施用时是安全的。其他效应子试剂可包括用于螯合重金属原子或放射性同位素的大环。这些效应子试剂也可用于提高改变的抗体的半衰期，例如聚乙二醇。
II.高亲和性IL-5单克隆抗体为了用于构建本发明的抗体、改变的抗体和片段，可用非人类的物种(例如牛、羊、猴、鸡、啮齿动物(例如鼠和大鼠)等)来产生所需的免疫球蛋白，该免疫球蛋白呈递天然的人类IL-5或其它肽表位。常规的杂交瘤技术可用于提供分泌非人类抗IL-5单克隆抗体的杂交瘤细胞系。然后用IL-5包被的96孔板筛选结合的杂交瘤，如实施例部分所述，或可选地用与链亲和素包被的平板结合的生物素化的IL-5。
本发明的一个示例性的，高亲和性的，中和mAb是mAb 2B6，它是一种鼠类抗体，可用于开发嵌合的、人源化的抗体，在下面的实施例1中有进一步的描述。2B6单克隆抗体的特征在于特异性结合人类IL-5的抗原，对IL-5的Kd值小于35×10-11M(大约2.2×10-11M)。通过光学生物传感器确定的2B6的Fab片段对IL-5的Kd值是大约9×10-11M。mAb 2B6看来阻遏人类IL-5和人类IL-5受体α链之间的结合反应。
另一种所需的供体抗体是鼠类mAb-2E3。这种mAb是同种型IgG2a，对hIL-5的解离常数小于3.5×10-11M(大约2.0×10-11M)。
另一种所需的供体抗体是大鼠mAb-4A6。这种mAb对hIL-5的解离常数小于3.5×10-11M(大约1.8×10-11M)。此外，mAb 4A6看来阻遏人类IL-5和人类IL-5受体β链之间的结合反应。
本发明不限于应用2B6 mAb、2E3 mAb或其超可变(即CDR)序列。任何其他对人类IL-5的解离常数小于或等于3.5×10-11M的高亲和性IL-5抗体和相应的抗IL-5CDR可替换它们。下面说明书中的供体抗体被限定为2B6或2E3，这个名称仅是用于说明并使说明书简化。
III.抗体片段本发明也包括Fab片段或F(ab′)2片段，这些片段来源于抗人类IL-5的mAb。这些片段可用作体内抗IL-5和嗜曙红细胞介导的病症的药剂，或作为IL-5体外诊断的一部分。Fab片段包含轻链的全部和重链的氨基末端部分；F(ab′)2片段是由两个Fab片段通过二硫键结合形成的片段。单克隆抗体2B6、2E3和其他类似的高亲和性的IL-5结合抗体，提供了Fab片段和F(ab′)2片段来源，这些片段可以通过常规方式得到，例如用合适的蛋白水解酶(木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)切割mAb，或用重组方法得到。这些Fab和F(ab′)2片段本身可用作治疗、预防或诊断药剂，以及用作序列供体，所述序列包括可变区和CDR序列，它们可用于形成本文描述的重组或人源化的抗体。
Fab和F(ab′)2片段可通过重组噬菌体文库构建(见例如Winter等，AnnRev.Immunol.，12433-455(1994))或免疫球蛋白链改组技术(见例如Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992)，两篇文献均完整地在此引入作为参考)构建，其中来自选定抗体的Fd或vH免疫球蛋白(例如2B6)被允许与轻链球蛋白vL(或vK)的所有组成部分结合，以形成新的Fab。相反，来自选定抗体的轻链可被允许与重链免疫球蛋白vH(或Fd)的所有组成部分结合，以形成新的Fab。当mAb 2B6的Fd被允许与轻链免疫球蛋白的所有组成部分结合时，得到中和IL-5Fab，如实施例部分所详述的。因此，人们可由链改组技术用单一序列(核苷酸或氨基酸)回收中和Fab。
IV.感兴趣的抗IL-5氨基酸和核苷酸序列上述mAb 2B6或其他抗体可提供序列，如可变重链和/或轻链肽序列、框架序列、CDR序列、功能片段及其类似物，以及编码它们的核酸序列，可用于设计和得到不同的改变的抗体，这些抗体对供体抗体具有抗原特异性。
作为一个实例，本发明提供可变轻链和可变重链序列，这些序列来自IL-5鼠抗体2B6及其衍生的序列。2B6的重链可变区由图1给出。CDR编码区用方框区域标出，并由SEQ ID NO7；SEQ ID NO8和SEQ ID NO9给出。2B6的轻链克隆可变区由图2给出。CDR编码区由SEQ IDNO10；SEQ ID NO11和SEQ ID NO12给出。
人源化的重链可变区由图8给出[SEQ ID NO18和19]。信号序列也由SEQ ID NO17给出。本领域技术人员已知的其他合适的信号序列，可以替换本实例中的信号序列。此构建体的CDR氨基酸序列与天然鼠和嵌合重链CDR的相同，由SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ ID NO9给出。人源化的轻链可变序列的一个实例(合成的)由图9给出[SEQ ID NO20和21]。
本发明的编码可变轻链和重链肽序列的核酸序列或其片段，也可用于在编码CDR或框架区的核酸序列内诱变产生特定的变化，并将所得的被修饰的或融合的核酸序列掺入表达质粒中。例如，框架和核酸序列和CDR编码区内的不活动替换被用于形成限制酶位点，这些位点有助于诱变的CDR(和/或框架)区的插入。这些CDR编码区被用于构建本发明的人源化的抗体。
考虑到遗传密码的简并性，可以构建不同的编码序列，这些序列编码可变重链和轻链氨基酸序列，本发明的CDR序列及其功能性片段或类似物，它们也具有供体抗体的抗原特异性本发明的编码可变轻链肽序列或CDR的分离的核酸序列或其片段，当与第二免疫球蛋白配对物可操作地结合时，可用于产生改变的抗体，例如嵌合的或人源化的抗体，或其他工程化的抗体。
应当注意到，除了本文描述的编码改变的抗体部分的分离的核酸序列外，本发明也包括其他这些的核酸序列，例如与天然CDR编码序列互补的，或与位于CDR编码区周围的被修饰的人类框架区互补的序列。有用的DNA序列包括这样一些序列，它们在严谨杂交条件下与DNA序列杂交(见T.Maniatis等，分子克隆(实验指南)，冷泉港实验室(1982)，387-389页)。严谨杂交条件的一个实例是用4×SSC在65℃下杂交，然后用0.1×SSC在65℃下清洗一个小时。另一严谨杂交条件是50％甲酰胺，4×SSC，42℃。优选地，这些杂交的DNA序列的长度至少是大约18个核苷酸，即大约CDR的大小。
V.改变的免疫球蛋白分子和改变的抗体改变的免疫球蛋白分子可编码改变的抗体，该抗体包括工程化的抗体，如嵌合抗体和人源化的抗体。所需的改变的免疫球蛋白编码区包含CDR编码区，CDR编码区编码对IL-5抗体有抗原特异性的肽，优选的是本发明提供的高亲和性抗体，它被插入第一免疫球蛋白配对物(人类框架或人类免疫球蛋白可变区)中。
优选地，第一免疫球蛋白配对物与第二免疫球蛋白配对物可操作地相连。第二免疫球蛋白配对物由上文限定，可包括编码感兴趣的第二抗体区域(例如Fc区)的序列。第二免疫球蛋白配对物也可包括编码另一免疫球蛋白的序列，所述另一免疫球蛋白与轻链或重链恒定区在框架内或以连接物序列的方式融合。针对IL-5的功能片段或类似物的工程化抗体可被设计得与同一抗体有更强的结合能力。
第二免疫球蛋白配对物也可与上文限定的效应物试剂(包括非蛋白载体分子)结合，第二免疫球蛋白配对物可以以常规方式与之可操作地连接。
在第二免疫球蛋白配对物(例如抗体序列)和效应物试剂之间的融合和连接可通过任何合适的方式进行，例如通过常规的共价或离子键，蛋白融合，或异双功能交联，如碳化二亚胺，戊二醛等。这些技术是本领域已知的，在常规的化学和生物化学课本中已有描述。
此外，常规的连接序列也可被构建到改变的免疫球蛋白编码区内，这些连接序列仅在第二免疫球蛋白配对物和效应物试剂之间提供所需数量的空间。这样的连接物的设计是本领域技术人员充分了解的。
此外，本发明的分子的信号序列可被修饰，以增强表达。作为一个实例，具有信号序列和来源于鼠重链序列的CDR的2B6人源化抗体，其初始的信号肽被另一信号序列[SEQIDNO17]替换。
一种示例性的改变的抗体含有可变重链和/或轻链肽，或含有对mAb2B6具有抗原特异性的蛋白序列，例如VH和VL链。本发明另一种所需的改变的抗体的特征在于这样的氨基酸序列或其功能片段或类似物，它包含鼠抗体分子2B6的重链和/或轻链可变区的至少一个，优选全部的CDR，残余序列来源于人。见例如人源化的VH和VL区(图8和9)。
在另一个实施方案中，本发明的工程化的抗体可与另一试剂相连。例如，重组DNA技术的方法可用于产生本发明的工程化抗体，其中完整抗体分子的Fc片段或CH2CH3结构域被一种酶或其他可检测分子(即多肽效应物或报道分子)替换。
第二免疫球蛋白配对物也可与非免疫球蛋白肽、蛋白或其片段可操作地连接，这些非免疫球蛋白肽、蛋白或其片段是与对鼠2B6有抗原特异性的含CDR的序列异源的。表达后所得的蛋白同时具有抗IL-5抗原特异性和非免疫球蛋白的特性。融合配对物特性可以是例如功能特性，如其他结合或受体结构域；或治疗特性，如果融合配对物本身是治疗性蛋白；或其他抗原特性。
本发明另一种所需的蛋白可包括具有全长重链和轻链的完整抗体分子，或其任何离散的片段，如Fab或F(ab′)2片段，重链二聚体，或其任何最小重组片段，例如Fv或单链抗体(SCA)或任何其他具有与选定供体单克隆抗体(例如mAb 2B6或2E3)相同的特异性的分子。这样的蛋白可以以改变的抗体形式应用，或以其非融合形式应用。
不论第二免疫球蛋白配对物是否来源于不同于供体抗体的抗体(例如免疫球蛋白框架或恒定区的任何同种型或类型)，都可得到工程化抗体。工程化抗体可包含来自例如受体抗体的免疫球蛋白(Ig)恒定区和可变框架区，和来自供体抗体(如本文描述的抗IL-5抗体)的一个或多个(优选所有)CDR。此外，可对受体mAb轻链和/或重链可变结构域框架区在核酸或氨基酸水平上进行改变，例如缺失、替换或添加，或改变供体CDR区，以便保留供体抗体的抗原结合特异性。
这些工程化的抗体被设计为具有IL-5mAb(如上述任意地修饰)可变重链和/或轻链中的一个(或两个)，或下面确定的重链或轻链CDR(见图7)中的一个或多个。本发明的工程化抗体被中和，即它们按需要阻遏与IL-5蛋白受体的结合，它们也阻遏或防止IL-5依赖型细胞的增殖。
这些工程化抗体可包括人源化抗体，该人源化抗体含有选定的人类免疫球蛋白或亚型的框架区，或是包含与IL-5抗体功能片段融合的人类重链和轻链恒定区的嵌合抗体。合适的人类(或其他动物)受体抗体可根据与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性选自常规的数据库，例如KABAT数据库、Los Alamos数据库和Swiss蛋白数据库。与供体抗体的框架区同源的(基于氨基酸)的人类抗体可能适于提供用于插入供体CDR的重链恒定区和/或重链可变框架区。可以用类似方式选择能提供轻链恒定区或可变框架区的合适的受体抗体。应注意到受体抗体的重链和轻链对由同一受体抗体起始而言是不需要的。
异源框架和恒定区最好选自人类免疫球蛋白及其同种型，如IgG(亚型1至4)，IgM，IgA和IgE。但是，受体抗体不必仅包含人类免疫球蛋白序列。例如可以这样构建基因，使得其中编码部分人类免疫球蛋白链的DNA序列与编码非免疫球蛋白氨基酸序列(例如多肽效应子或受体分子)的DNA分子融合。
特定的所需人源化抗体的一个实例包含2B6的CDR，它被插入选定的人类抗体序列的框架区。对于中和人类抗体，一个，两个或优选三个来自IL-5抗体重链和/或轻链可变区的CDR被插入选定的人类抗体序列的框架区，替换了人类抗体的天然CDR。
优选地，在人源化的抗体中，人类重链和轻链的可变结构域通过一个或多个CDR替换而被工程化。可以使用全部六个CDR，或使用少于六个的CDR的不同组合。优选全部六个CDR被替换。可以仅在人类重链中替换CDR，用轻链作为来自人类受体抗体的未修饰的轻链。可选地，可相容的轻链可通过常规抗体数据库选自另一人类抗体。工程化抗体的剩余物可来源于任何合适的受体人类免疫球蛋白。
工程化的人源化抗体优选地具有天然人类抗体或其片段的结构，并具有有效治疗应用或诊断应用所要求的特性的组合，所述治疗应用包括治疗IL-5介导的人类炎症。
作为另一实例，工程化抗体可包含三个2E3可变轻链区的CDR[SEQIDNO10、11和13]和三个2B6可变重链区的CDR[SEQIDNO7、8和9]。所得人源化抗体应具有与mAb 2B6相同的抗原结合特异性和高亲和性。
本领域技术人员应当理解，工程化抗体可通过改变可变结构域氨基酸而被进一步修饰，同时不会显著影响供体抗体(即类似物)的特异性和高亲和性。预期重链和轻链氨基酸可被其他氨基酸取代，取代位于可变结构域框架和/或CDR中。
此外，可改变恒定区以提高或降低本发明分子的选择特性。例如二聚化，与Fc受体结合或结合并激活补体的能力(见例如Angal等，分子免疫学，30105-108(1993)，Xu等，生物化学杂志，2693469-3474(1994)，Winter等，EP307，434-B)。
作为嵌合抗体的改变的抗体与上面描述的人源化抗体不同，它提供完整的非人类供体抗体重链和轻链可变区(包括框架区)，它们均与两条链的人类免疫球蛋白恒定区相连。预期相对人源化抗体而言保留了附加的非人类序列的嵌合抗体可在人体中引发显著的免疫应答。
这样的抗体在本发明和IL-5介导的疾病的治疗中是有用的，如下所述。
VI.改变的抗体和工程化抗体的制备优选地，mAb 2B6或其他合适的供体单克隆抗体(例如2E3、2F2、4A6等)的可变轻链和/或重链序列以及CDR，和它们的编码核酸序列，被用于通过如下方法构建本发明的改变的抗体，优选人源化抗体。相同或类似的技术也可用于产生本发明的其他实施方案。
用常规方法克隆产生选定供体mAb(例如鼠抗体2B6)的杂交瘤，该抗体的重链和轻链可变区的DNA可通过本领域技术人员已知的技术得到，例如Sambrook等(分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室(1989))描述的技术。用多核苷酸引物和逆转录酶得到2B6的可变重链和轻链，它们至少包含CDR编码区和受体mAb轻链和/或重链可变结构域框架区的某些部分(这些部分是为保留供体mAb结合特异性所需的)，以及残余的免疫球蛋白来源的部分，所述免疫球蛋白来源于人类免疫球蛋白的抗体链。用已知的数据库并通过与其他抗体进行比较确定出CDR编码区。
可制备鼠/人嵌合抗体并检测结合活性。这种嵌合抗体包含完整的非人类供体抗体VH和VL区，它们在两条链中均与人类Ig恒定区相连。用计算机化的数据库(例如KABAT)来确定来自人类抗体的重链可变区的同源框架区，并且选择与2B6有同源性的人类抗体作为受体抗体。设计在人类抗体框架内含有2B6 CDR编码区的合成的重链可变区的序列，它在框架区内具有任选的核苷酸替换，以引入限制性位点。随后用长的合成寡聚物合成出所设计的序列。可选地，所设计的序列是通过重叠寡核苷酸，用聚合酶链式反应(PCR)扩增和修正错误而被合成的。
用类似的方式可以设计出合适的轻链可变框架区。
人源化的抗体可来源于嵌合抗体，或优选地通过合成制备，合成是通过在选定的重链和轻链框架内适当地插入来自重链和轻链的供体mAb CDR编码区而完成的。可选地，本发明的人源化的抗体可用标准诱变技术制备。因此，所得的人源化抗体包含人类框架区和供体mAb CDR编码区。随后可对框架残基进行进一步操作。所得人源化抗体可在重组宿主细胞(例如COS、CHO或骨髓瘤细胞)中表达。其他人源化抗体可用这一技术在其他合适的IL-5特异性的、中和的、高亲和性的非人类抗体上制备。
常规的表达载体或重组质粒可这样制备将改变的抗体的这些编码序列与常规的调节控制序列可操作地连接，所述调节控制序列能控制在宿主细胞中的复制和表达，和/或从宿主细胞中分泌。调节序列包括启动子序列，例如CMV启动子，和信号序列，它可来源于其他已知抗体。类似地可制备第二表达载体，该载体具有编码互补抗体轻链或重链的DNA序列。优选地，第二表达载体与第一表达载体相同，只是涉及编码序列和可选择的标记物，以确保各多肽链被功能性地表达。可选地，改变的抗体的重链和轻链编码序列可存在于单一载体上。
通过常规技术将第一和第二载体共转染选定的宿主细胞(或只用单一载体转染)，以产生本发明的被转染的细胞，该细胞同时包含重组的或合成的轻链和重链。随后用常规技术培养被转染的细胞，以制备本发明的工程化的抗体。通过适当的检测技术，如ELISA或RIA，从培养物中筛选出与重组重链和/或轻链相连的人源化抗体。类似的常规技术可用于构建本发明其他改变的抗体和分子。
本领域的技术人员可筛选出克隆和亚克隆步骤所用的合适的载体，所述的克隆和亚克隆步骤被用于本发明的方法和组合物的构建中。例如可使用常规的pUC系列克隆载体。所用的一种载体是pUC19，它可以从例如Amersham(Buckinghamshire，英国)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)购得。此外，任何容易复制，具有大量克隆位点和可选择的基因(例如抗生素抗性)，容易操作的载体可用于克隆。因此，对克隆载体的选择在本发明中不是限制性因素。
类似地，本领域的技术人员可从任意常规载体中选择出表达本发明的工程化抗体所需的载体。这些载体也包含选定的调节序列(如CMV启动子)，它指导异源DNA序列在选定的宿主细胞中的复制和表达。这些载体含有上面描述的DNA序列，所述序列编码工程化抗体或改变的免疫球蛋白编码区。此外，载体中可掺入选定的免疫球蛋白序列，该序列通过所需的限制性位点的插入而被修饰，以利于操作。
表达载体的特征也可在于这样一些基因，它们适于扩大异源DNA序列(例如哺乳动物二氢叶酸还原酶基因(DHFR))的表达。其他优选的载体序列包含一段poly A信号序列，该序列来自例如牛生长激素(BGH)和β珠蛋白启动子序列(betaglopro)。本文所用的表达载体可用本领域技术人员充分了解的技术合成。
这些载体的组分，例如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等，可从商业或天然来源得到，或用已知的方法合成，它们被用来在宿主细胞中指导重组DNA的产物的表达和/或分泌。可为此目的选择其他合适的表达载体，它们之中用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达的多种类型是本领域已知的。
本发明也包括用重组质粒转染的细胞系，所述重组质粒包含工程化抗体或其改变的免疫球蛋白分子的编码序列。适于这些克隆载体克隆和其他操作的宿主细胞也是常规的。但是，最优选地，来自大肠杆菌的不同菌株被用于克隆载体的复制和本发明的改变的抗体的构建中的其他步骤。
用于表达本发明的工程化抗体或改变的抗体的适当的宿主细胞或细胞系优选地是哺乳动物细胞，例如CHO、COS、成纤维细胞(例如3T3)和骨髓细胞，更优选的是CHO或骨髓细胞。可用人类细胞，这使得分子可以以人类糖基化模式被修饰。可选地，可以使用其他真核细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞的选择，转化、培养、扩增、筛选和产物制备和纯化的方法是本领域已知的。见例如Sambrook等，引文同上。
细菌细胞可用作适于表达本发明的重组Fab的宿主细胞(见例如Pluckthum，A.，免疫学综述，130151-188(1992))。但是，由于细菌细胞表达的蛋白有处于非折叠或不正确折叠形式或处于非糖基化形式的倾向，应对任何细菌细胞产生的重组Fab筛选其抗原结合能力的保留。如果细菌细胞表达的分子以正确折叠的形式产生，该细菌细胞将是所需的宿主。例如，用于表达的不同大肠杆菌菌株是生物技术领域众所周知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌、链霉菌和其他杆菌等的不同菌株也可用于本方法。
如果需要，本领域技术人员已知的酵母菌株也可作为宿主细胞，昆虫细胞(例如果蝇和鳞翅目昆虫)和病毒表达系统也是如此。见例如Miller等，遗传工程，8277-298，Plenum Press(1986)以及其中所引用的文献。
构建本发明的载体的一般方法，产生本发明的宿主细胞所需的转染方法，和从该宿主细胞产生本发明的改变的抗体所必需的培养方法都是常规的技术。同样，本发明的改变的抗体一旦生成，即可根据本领域的标准方法从细胞培养物中将其纯化，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等。这些技术属于本领域之内，并且没有对本发明进行限制。
人源化抗体的另一种表达方法可利用在转基因动物中的表达，如美国专利4,873,316号中描述的。这涉及利用动物酪蛋白启动子的表达系统，当其被转基因性地掺入哺乳动物中时，能使雌性动物在其奶中产生所需的重组蛋白。
一旦用所需的方法表达，即通过合适的检测手段检查工程化抗体的体外活性。用目前常规的ELISA检测方案来定量和定性地评估工程化抗体与IL-5的结合。此外，可用其他体外检测手段确认中和效果，然后进行人类临床研究以评价工程化抗体除通常的清除机制外的机体内持续能力。
在由2B6制备人源化抗体的方法之后，本领域的技术人员可从本文描述的其他供体IL-5抗体、可变区序列和CDR肽构建人源化的抗体。工程化抗体可用可变区框架制备，该框架可能通过接受工程化抗体而识别“自身”。可变区框架的小的改变可使抗原结合产生大的增加，但对接受者的免疫原性没有可觉察的增加。这种工程化的抗体可有效地治疗IL-5介导的人类疾病。这类抗体也用于诊断这些疾病。
VII.治疗/预防应用本发明也涉及治疗人类嗜曙红细胞相关症状(如气喘)的方法，包括施用有效剂量的抗体，所述抗体包括本文描述的工程化抗体或改变的抗体或其片段中的一种或多种。
利用本发明的分子诱导的治疗反应可通过结合人类IL-5然后阻遏嗜曙红细胞刺激作用而产生。因此，当处于适于治疗应用的制备物和制剂中时，本发明的分子对这样一些人是非常有用的，他们患有变态和/或特应性反应，或与嗜曙红细胞有关的反应，例如但不限于，过敏性鼻炎、气喘、慢性嗜曙红性肺炎、过敏性支气管曲霉病、腹腔病、嗜曙红性胃肠炎、Churg-Strauss综合症(结节性动脉外膜炎和特应性病)、嗜曙红肌痛综合症、嗜曙红细胞过多综合症、水肿反应(包括发作性angiodema)、蠕虫感染(其中嗜曙红细胞起保护性作用)、盘尾丝虫皮炎和特应性皮炎。
本发明的改变的抗体、抗体及其片段也可与其他抗体结合应用，特别是可与其他标记物(表位)反应的人类mAb，所述标记物与疾病相关，本发明的工程化抗体是针对这些标记物的。
据信，本发明的治疗性药剂可在大约2天至3周内或根据需要治疗过敏性疾病。例如，当治疗季节性鼻炎等时，可能需要较长的治疗时间。这比目前在治疗IL-5介导的疾病时所用的输注方案要好。治疗的剂量和持续时间与本发明分子在人类循环系统中的相对持续时间有关，本领域的技术人员可根据患者的病情和一般健康状况对其进行调整。
本发明药剂的施用方式可以是任何将药剂输送到宿主中的合适的途径。本发明的改变的抗体、抗体、工程化的抗体及其片段以及药物组合物特别适于胃肠外施用，即皮下、肌内、静脉内或鼻腔内。
本发明的治疗药剂可被制成药物组合物，该组合物中含有有效量的处于药用载体中的本发明的工程化(例如人源化)抗体作为活性成分。在本发明的预防性药剂中，以适于注射的形式存在的含有工程化抗体的水悬液或溶液(优选在生理pH下缓冲的)是优选的。用于胃肠外施用的组合物通常含有本发明工程化抗体的溶液或其溶于药用载体形成的混合液，所述载体优选地是水基载体。可用不同的水基载体，例如0.4％盐水，0.3％甘氨酸等。这些溶液是灭菌的，通常没有颗粒状物种。这些溶液可用常规的、众所周知的灭菌技术(例如过滤)灭菌。组合物中可含有接近生理条件所需的药用辅助性物质，例如pH调节剂和缓冲剂等。本发明抗体在药物组合物中的浓度可在较宽的范围内变化，即重量比从小于0.5％，通常等于或小于1％，到15％或20％，根据所选择的具体施用方式，基于液体的体积、粘度等来选择抗体的浓度。
因此，用于肌肉内注射的本发明的药物组合物可包含1毫升无菌缓冲液，和大约1纳克至100毫克，例如大约50纳克至30毫克，或更优选大约5毫克至25毫克的本发明的工程化抗体。类似地，用于静脉输注的本发明的药物组合物可包含250毫升无菌的Ringer’s溶液，和大约1至30，优选5毫克至大约25毫克的本发明的工程化抗体。制备可胃肠外施用的组合物的精确方法对本领域的技术人员是已知的或是显而易见的，更详细的描述见例如Remington’s Pharmaceutical Science，15th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania。
优选地，当处于药物制备物中时，本发明的治疗药剂以单位剂量形式存在。适当的治疗有效剂量可由本领域的技术人员容易地确定。为了有效地治疗人或其他动物的炎症，应当对每70公斤体重通过胃肠外(优选静脉内或肌肉内)施用大约0.1毫克至20毫克剂量的本发明的蛋白或抗体。如果必要的话，在炎症反应期间，医生可选择合适的时间间隔重复这一剂量。
本发明的改变的抗体和工程化抗体也可用于诊断，例如确定IL-5介导的疾病或跟踪这类疾病的治疗进程。作为诊断药剂，这些改变的抗体可被常规地标记以用于ELISA和其他常规的测量血清、血浆或其他适当的组织中的，或由培养物中的人类细胞释放的IL-5水平的检测方案。其中利用了改变的抗体的检测的性质是常规的，并且不限制本发明公开。
因此，本发明的一个实施方案涉及帮助诊断过敏或其他与嗜曙红细胞过量产生有关的病症的方法，它包括以下步骤确定得自所述患者的样本(血浆或组织)中人类IL-5的量，将该量与普通群体中的人类IL-5平均量进行比较，由此，如果患者样本中IL-5的量显著升高，则表明有与嗜曙红细胞过量产生有关的过敏或其他病症。
本文描述的抗体、改变的抗体或其片段可被冷冻干燥以便贮存，并在使用前在合适的载体中重建。这一技术已被证明对常规的免疫球蛋白有效。本领域已知的冷冻干燥和重建技术可被采用。
下述实施例阐明了本发明的不同实施方案，包括示例性工程化抗体的构建及其在合适的载体和宿主细胞中的表达，并且不应被理解为限制本发明的范围。所有的氨基酸都以常规的三字母或单字母编码表示。除非另外说明，所有必要的限制性酶、质粒和其他药剂和材料都是从商业途径得到的。所有的一般克隆连接和其他重组DNA方法都按下面文献中描述的进行T.Maniatis等，引文同上，或其第二版(1989)，Sambrook等编辑，出版者相同(“Sambrook等”)。
实施例1-hIL-5的MAb的制备在果蝇Schneider 2(S2)细胞中表达人类IL-5，将其纯化至均一。用草地贪夜蛾21(Sf21)在Baculovirus中表达鼠IL-5，将其纯化至均一。单克隆抗体TRFK-5(一种中和大鼠抗小鼠IL-5抗体)得自Genzyme公司(Cambridge，MA)。
A.免疫方法重组人类IL-5(IL-5)被用作一组七只CAF1雌性小鼠(CharlesRiver，Wilmington，MA)的免疫原。动物接受三次皮下注射，注射的是磷酸缓冲液(PBS)中的IL-5，用1∶1的TiterMAXTM(CytoRx Corp.，Nocross，GA)将其乳化四个月。激发抗原的剂量是50微克，加强剂量是25和10微克。加强之后收集血清样本，检测与IL-5的结合，并通过受体结合抑制试验和B13增殖试验(或IL-5中和试验(实施例2C))检测中和活性。所有小鼠产生的血清样本都结合IL-5。在无痛苦致死之前3天，用10微克重组人类IL-5对被选作脾供体的动物进行静脉内加强注射。
B杂交瘤发育所用的是Kohler等(Nature，256495(1975))首先报道的融合方法，对其进行了修改以便用细胞单层来完成这一技术(Kennet等编，“杂交瘤生物分析的新方向”，pp.368-377，Plenum Press，New York)。合并来自两只供体小鼠的脾细胞，用5千万脾细胞对1千万SP2/0/Ag14骨髓瘤细胞的比例进行融合。通过ELISA检测融合阳性孔的上清液对IL-5的结合。含有产生IL-5的抗体的细胞的孔被展开，用IL-5受体结合抑制试验和B13(中和)增殖试验(下面将要描述)筛选上清。
分离出16个杂交瘤，它们分泌可与IL-5反应的单克隆抗体。将杂交瘤上清与碘化的IL-5混合，加入到由表达IL-5受体(IL-5R)α链的果蝇细胞制备的膜提取物中，检测受体结合的抑制。11个杂交瘤上清液对碘化IL-5与IL-5受体α链结合的抑制大于60％。三种单克隆抗体(2B6、2E3和2F2)也对由人而不是鼠IL-5引发的鼠B13细胞的增殖的抑制大于70％。杂交瘤中的5个，其中4个阻遏结合和/或增殖(1C6、2B6、2E3和2F2)，1个是非中和的(24G9)，在软琼脂中被反复地亚克隆，以产生稳定的克隆细胞系。用ELISA筛选来自克隆细胞系上清的交叉反应，这些上清不与人类IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-8、M-CSF或TGFα结合。这些单克隆抗体被纯化，其结合亲和性用光学生物传感器(BIAcore)测定为范围是10-100pM。用同种型试剂(PharMingen，San Diego，CA)将来自这些细胞系的上清同种型化。
通过类似的方法，如对小鼠进行的描述，用相近的免疫方案和用于融合的大鼠杂交瘤，从免疫的大鼠中得到大鼠杂交瘤。两个大鼠杂交瘤(4A6和5D3)被鉴定为产生可与IL-5结合的单克隆抗体。象mAb 2B6、2E3和2F2一样，发现mAb 4A6和5D3在下文描述的B13试验中被中和。
C.杂交瘤保藏产生单克隆抗体2B6的杂交瘤细胞系SK119-2B6.206.75(1)被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA，保藏号HB11783，并且依照1977年的布达佩斯协议被专利保藏处接受，该协议管理为专利程序目的的微生物保藏。
产生单克隆抗体2E3的杂交瘤细胞系SK119-2E3.39..40.2被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA，保藏号HB 11782，并且依照1977年的布达佩斯协议被专利保藏处接受，该协议管理为专利程序目的的微生物保藏。
产生单克隆抗体2F2的杂交瘤细胞系SK119-2F2.37.80.12(1)被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA，保藏号HB11781，并且依照1977年的布达佩斯协议被专利保藏处接受，该协议管理为专利程序目的的微生物保藏。
产生单克隆抗体24G9的杂交瘤细胞系SK119-24G9.8.20.5(1)被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA，保藏号HB11780，并且依照1977年的布达佩斯协议被专利保藏处接受，该协议管理为专利程序目的的微生物保藏。
产生单克隆抗体4A6的杂交瘤细胞系4A6(1)G1F7被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA，保藏号HB11943，并且依照1977年的布达佩斯协议被专利保藏处接受，该协议管理为专利程序目的的微生物保藏。
产生单克隆抗体5D3的杂交瘤细胞系5D3(1)F5D6被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA，保藏号HB11942，并且依照1977年的布达佩斯协议被专利保藏处接受，该协议管理为专利程序目的的微生物保藏。
实施例2-检测A.ELISA用溶于0.05M，pH9.6碳酸缓冲液的0.2微克IL-5包被MaxiSorbTM免疫平板的单独的孔。4℃保温过夜后，用含0.025％吐温20的PBS清洗平板，用溶于含0.025％吐温20的PBS的1％BSA在室温下封闭2小时。未稀释的杂交上清被加到IL-5包被的孔中，在室温下保温2小时。清洗平板之后，加入用PBS稀释成1/7500的过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG&IgM(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，所述PBS中含有1％BSA和0.025％吐温20。2小时之后清洗平板，加入0.2毫升pH4.75的0.1M柠檬酸缓冲液，该缓冲液中含有0.1％的尿素过氧化物和1mg/ml的邻苯二胺。15分钟后，将平板在VMaxTMMicroplate Reader(Molecular Devices，Menlo Park，CA)上以450nm读数。
B.受体结合抑制试验表达人类IL-5受体(IL-5R)α链的果蝇S2细胞的膜提取物被用于测量抗体对IL-5与受体结合的影响。为制备膜，在4℃下用1000×g离心10分钟沉淀109个细胞。用干冰/乙醇浴冷冻细胞沉淀15分钟。融化沉淀，用10毫升PBS在4℃下重悬，用1000×g离心10分钟。用2×PBS清洗细胞沉淀，重悬于13.5毫升高渗缓冲液(10mM Tris pH7.5，3mMMgCl2，1mM二硫苏糖醇，1mM苯甲磺酰氟，1uM leupeptin，1uM pepstatinA)，在冰上保温5分钟。细胞悬液在15毫升Dounce匀浆器中匀浆，用2.5M蔗糖溶液使蔗糖的终浓度达到0.25M。1000×g离心15分钟除去细胞碎片。4℃下100,000×g离心90分钟沉淀细胞膜，用50毫升10mM TrispH7.5，3mM MgCl2，250mM蔗糖重悬细胞膜，-70℃保存。
用含有受体的果蝇膜进行的检测在MultiscreenGVTM平板(MilliporeCorp.，Bedford，MA)上用果蝇果蝇组织培养基M3(Lindquist等，DrosophilaInf Serv.，58163(1982))完成，M3中含有25mM HEPES缓冲液，pH7.2和0.1％BSA(结合缓冲液)。用0.1毫升结合缓冲液将孔预封闭。50微升的待测样本，每样三份，被加入孔中，随后加入25微升碘化(125I)IL-5。室温下温育20分钟后，25微升表达人类IL5Rα链的果蝇S2细胞的膜提取物被加入孔中。进一步培养1小时后，通过真空过滤收集膜，用结合缓冲液洗3次。过滤物被干燥和计数。
C.IL-5中和检测鼠IL-5/IL-3依赖型细胞系LyH7.B13(B13)得自R.Plalcios，BaselInstitute of Immunology，Switzerland。细胞在RPMI 1640培养液(GibcoBRL，Renfrewshire，UK)中每周深层培养两次，培养液中补充了L-谷氨酰胺，非必需氨基酸，丙酮酸钠，青霉素-链霉素(均为GibcoBRL)，加2-巯基乙醇(5×10-5M，Sigma)，10％胎牛血清(Globepharm，Surrey，UK)和1-10单位的鼠IL-5。为进行检测，在存在被适当稀释的待测样本的条件下，将细胞在96孔圆底平板中每样三份地培养48小时，在最后4个小时中快速施加0.5 uCi3H-胸苷(Amersham，Bucks，UK)。在1205 Betaplate(LKBWallac，Beds，UK)中对其进行闪烁计数。
D.光学生物传感器用BIAcore光学传感器(Pharmacia Biosensor，UppsaIa，Sweden)测量固定化的hIL-5和抗体的动力学和平衡结合特性。用前面描述的(Karlsson等，J.Immunol.Meth.，145229-240(1991))相关内容评价动力学数据，该文献完整地在此引入作为参考。
三种中和单克隆抗体，即2B6、2E3和2F2，具有非常类似的抑制125I-IL-5与膜受体结合和B细胞增殖的中和的能力，并对IL-5有非常类似的亲和性(见表I)。来自这三种mAb(2种IgG1和一种IgG2a)的VH和VL的核苷酸序列已被确定。所得的序列非常类似，仅有几个残基的差异。
表I可与人类IL-5反应的mAb的亲和性和中和能力mAb Kd(pM)a中和结合增殖IC50c100％抑制cIC50(nM)b2B6221 702002E3201 906002F2131 150 3401C6864312,200ND24G9 ND＞133 ＞100,000 ND4A618＞88 281005D3NDND100 10,000a用光学生物传感器(BIOcore)分析(25℃)确定b对125I-IL-5与来自果蝇膜的IL-5R(α链)结合的抑制c对8pM人类IL-5引发的B13细胞增殖(以pM为单位)的抑制ND＝没有数据实施例3-来自组合文库的IL-5Fab的分离和定性A.PCR和组合文库的构建用cDNA试剂盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)将纯化自三只小鼠的脾的RNA逆转录，使用试剂盒中提供的引物(dT)15或3′Fd(IgG1，IgG2a&IgG3)，以及kappa轻链引物，如Huse等(Science，2461275(1989))和Kang，SA.(MethodsCompanion Methods Enzymol.，2111(1991))所述，文献在此引入作为参考。用所描述的(Huse等，同上)引物和热循环条件通过PCR扩增免疫球蛋白cDNA。对所有反应采用使用了AmpliWaxTMPCR Gem100(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)小珠的“热起始(Hot Start)”技术和制造商的方案。PCR产物被凝胶纯化、消化并连接到pMKFabGene3载体(Ames等，J.Immunol，1524572(1994))上。与Fd cDNA连接后的文库滴度为5.1×107CFU，与kappacDNA连接后的文库滴度为1.5×106CFU。用辅助噬菌体VCSM13(Stratagene)感染XLl-Blue细胞(Stratagene，La Jolla，CA)，该细胞已用噬菌粒文库进行了转化，所述噬菌体是如Barbas和Lerner(MethodsCompamon Methods Enzymol.，2119(1991))所述制备的。
B.生物淘选(Biopanning)用溶于0.1M碳酸氢盐，pH8.6的IL-5(1ug/孔)在4℃下将四微滴定孔(Immulon II Removawell Strips，Dynatech Laboratories Inc.，Chantilly，VA)包被过夜。用水清洗孔，用含有3％BSA的PBS在37℃下将孔封闭1小时。除去封闭溶液，将文库加入微滴定孔中(50ug/孔)，在37℃下保温2小时。用TBS/吐温(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.5％吐温20)将孔洗10次，用水洗1次，然后用下述溶液将粘附的噬菌体洗脱0.1M HCl，用甘氨酸调至pH2.2，含1mg/ml BSA。
C.菌落转移s按所述方法(Barbas和Lerner，同上)处理菌落转移s，该菌落转移s来自分离自第3和第4轮生物淘选的克隆。用0.5-1.0 uCi125I-IL-5在室温下，在含有1％BSA的PBS中温育过滤物1小时，125I-IL-5是按制造商建议的方法用Bolton-Hunter试剂(NEN，Billerica，MA)碘化的。然后用PBS 0.25％吐温清洗，在柯达XAR胶片上曝光。用放射自显影检测表达IL-5反应性Fab的克隆。
D.可溶FAB的制备用NheI和SpeI消化噬菌粒DNA以除去基因III并自连接。XL1-Blue细胞被转化，分离的克隆在含有1％葡萄糖和50ug/ml羧苄青霉素的5.0毫升super broth(SB)培养基(30克胰蛋白胨，20克酵母提取物，10克3-[N-吗啉代]丙磺酸，MOPS，pH调至7)中，在37℃下生长过夜。用Beckman GS-6G离心机3500rpm离心10分钟将1毫升培养物中的细胞沉淀，该细胞被用于接种5毫升SB，SB中含有50ug/ml carbenicillin。将培养物在37℃下振摇1小时，加入异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG；1mM)，将培养物移至28℃过夜。通过在4℃下，在悬于30mM TrispH8.0的20％蔗糖中裂解细胞来从胞外质中制备可溶性Fab，然后在Microfuge中离心10分钟。用western印迹，通过与含有已知量的鼠Fab的样本进行比较来估计Fab的浓度。不同细菌的胞外质提取物含有相似浓度的Fab，按western印迹分析所估计的，其农度范围是1-20ug/ml。
E.FAB的纯化
用基因工程方法将一段螯合肽加到重链的羧基末端，以利于蛋白纯化。用NheI和SpeI消化除去M13基因III编码区之后，编码6个组氨酸残基的一对重叠寡核苷酸被亚克隆到Fab表达载体中[SEQ ID NO43]5′-CTAGCCACCACCACCACCACCACTAA-3′[SEQ ID NO44]3′-GGTGGTGGTGGTGGTGGTGATTGATC-5′。
用上面描述的方法诱导Fab的表达。在28℃下诱导过夜之后，通过在20％蔗糖，30mM TRIS pH8.0中，在4℃下保温30分钟制备细胞沉淀的胞外质裂解物。向澄清的上清中加入尿素和Brij-35试剂至终浓度分别为2M和1％。在室温下摇动1小时后，处理后的澄清上清液以0.5毫升/分钟的速率直接加到5毫升镍-NTA金属螯合柱(1.5×3厘米)上，该柱已用缓冲液A(100mM磷酸钠，10mM Tris，0.3M NaCl，2M尿素，pH8.0)平衡。在4个柱体积(20毫升)的洗柱之后，用6个柱体积(30毫升)的从pH8到pH4的反向pH梯度，在与上面相同的缓冲液中洗脱下结合的物质。从柱中洗脱下的纯化的Fab在pH5.5时呈现尖锐的对称峰。它们的纯度大于90％，不含DNA。
F.FAB ELISA用悬于0.1M pH8.6碳酸氢盐缓冲液的蛋白(1毫克/毫升，每孔50毫升)包被Immulon II平板(Dynatech)。稀释和清洗在含有0.05％吐温TM20的PBS中进行。将平板在室温下用含有1％BSA的PBS清洗并封闭1小时。将含有可溶Fab或纯化Fab的，不同稀释率的细菌上清加到平板上。温育1小时之后清洗平板，加入生物素化的山羊抗小鼠kappa(SouthernBiotechnology Associates，Inc，Birmingham，AL)(1∶2000稀释；50微升/孔)1小时。清洗平板，加入链亲和素标记的辣根过氧化物酶(1∶2000稀释；50微升/孔)1小时。清洗平板，加入ABTS过氧化物酶底物(100微升/孔L；Kirkegaard & Perry Laboratoris，Gaithersburg，MD)，在UVmaxTM(Molecular Devices)微平板计数器上读取405nm的光密度。
G.来自组合文库的Fab的分离和定性通过多轮抗包被了IL-5的微滴定孔的生物淘选，从文库中选出带有抗IL-5的Fab的噬菌体。筛选4轮之后，用菌落转移试验鉴定IL-5反应性Fab，所述试验利用了125I-IL-5。第3轮的34个克隆和第4轮的4个克隆被鉴定为结合标记的IL-5。与IL-5的结合通过直接结合ELISA而被确认，ELISA中应用了表达Fab-基因III融合蛋白的培养物上清。从这些克隆中分离出DNA，在去除M13基因III的编码区之后，可溶Fab的表达被诱导。制备胞外质级分，用ELISA检测其与IL-5的结合。Fab特异性地结合IL-5，没有显示出结合另一种蛋白，rC5a。
未稀释的胞外质提取物(含有1-20ug/mlFab)在IL-5R结合抑制试验(实施例2)中被检测。Fab中没有一个抑制碘化IL-5与IL-5Ro的结合超过35％。
H.中和mAb转变成FAB用上面描述的条件，通过PCR分离mAb(2B6)的Fd和KcDNA。凝胶纯化的片段被亚克隆到pMKFabGene3载体中，该载体已被修饰为包含基因IIIcDNA的hexa-His序列3′，结果生成质粒pMKFabGene3H。通过菌落转移试验鉴定出含有2B6重链和轻链的功能性IL-5结合Fab克隆。用NheI/Spe II消化除去基因III和自连接之后重链在框架内与hexa-His融合，使得可以用上述方法纯化。Fab以剂量依赖方式抑制受体结合，IC50大约为7.5ug/ml，与亲本mAb(鼠2B6)类似。
I.链改组文库的构建和筛选编码中和mAb2B6的Fd的cDNA作为XhoI/SpeI片段被亚克隆到pMKFabGene3H中，pMKFabGene3H含有SstI/XbaI片段以代替轻链cDNA。用SstI和XbaI消化该噬菌粒，然后与SstI/XbaI消化的轻链PCR产物连接，所述PCR产物来源于IL-5免疫的小鼠(上文描述的)。连接后的文库滴度是4×105CFU。如上所述对组合文库进行生物淘选和菌落转移试验。
通过将编码中和mAb2B6的Fd与相同轻链的所有组成部分匹配而构建文库，所述轻链的所有组成部分是从IL-5免疫的小鼠中回收的，被用于产生组合文库。对该链改组文库进行4轮生物淘选(对固定化的IL-5)，用菌落转移试验对所得的克隆进行IL-5反应性检测。用ELISA和IL-5Rα结合试验对结合碘化IL-5的阳性克隆进一步检测。从链改组文库中回收的两个Fab(2和5)阻遏IL-5与IL-5Rα的结合，并在B13试验中抑制IL-5依赖性增殖。这两个Vk的序列与2B6Vk(2B6VH的初始轻链配对物)的序列类似。Fab2&15的轻链序列分别是SEQ ID NO45和46。对于Fab2，CDR1-3分别是SEQ ID NO10，11和47。对于Fab15，CDR1-3分别是SEQ ID NO10，11和48。
下面实施例4和5中列出的所有抗体氨基酸序列使用KABAT编号系统，它允许CDR和框架长度的变化。即，不论在它们前面的氨基酸的实际编号是多少，关键氨基酸总是被指定相同的编号。例如，所有轻链CDR之前的半胱氨酸总是KABAT位置23，CDR1之后的色氨酸残基总是KABAT位置35，即使CDR1可含有多达17个氨基酸。
实施例4-人源化的抗体一种人源化的抗体被设计为在人类抗体框架内包含鼠类CDR。通过下述操作来制备人源化的IL-5特异性小鼠抗体2B6。
A.基因克隆用得自Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)试剂盒分别从2B6、2F2和2E3杂交瘤细胞系(见实施例1)中分离mRNA，然后用cDNA试剂盒(Boehringer Mannheim)提供的引物(dT)15将其逆转录以制备cDNA。用小鼠免疫球蛋白特异性PCR引物扩增DNA，该DNA编码从重链可变区的氨基酸#9(KABAT编号系统)到铰链区，以及从轻链可变区氨基酸#9(KABAT编号系统)到恒定区末端的结构域。通过独立的PCR反应得到各抗体链的几个克隆。
所用的小鼠γ1铰链区引物是[SEQ ID NO22]5′GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC 3′所用的小鼠γ2a铰链区引物是[SEQ ID NO23]5′GGACAGGGCTTACTAGTGGGCCCTCTGGGCTC 3′所用的小鼠重链可变区引物是[SEQ ID NO24]5′AGGT(C或G)(C或A)A(G或A)CT(G或T)TCTCGAGTC(T或A)GG 3′所用的小鼠kappa链恒定区引物是[SEQ ID NO25]5′CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG 3′所用的小鼠轻链可变区引物是[SEQ ID NO26]5′CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA 3′PCR片段被克隆到质粒pGEM7f+(Promega)中，然后转化大肠杆菌DH5α(Bethesda Research Labs)。
B.DNA测序对上面A部分的重链和轻链鼠cDNA克隆进行测序。这些克隆的可变区的测序结果显示在SEQ ID NO1-6(图1-6)中。各克隆含有这样一些氨基酸，它们在小鼠重链可变区或轻链可变区中是保守的。CDR氨基酸序列在下面列出。
2B6重链的CDR区是SEQ ID NO7、8和9。见图7。这些序列由SEQIDNO1编码。轻链的CDR区是SEQ ID NO10、11和12。见图7。这些序列由SEQ ID NO2编码。
2F2重链的CDR区是SEQ ID NO7、8和9。见图7。这些序列由SEQID NO3编码。轻链的CDR区是SEQ ID NO10、11和13。见图7。这些序列由SEQ ID NO4编码。
2E3重链的CDR区是SEQ ID NO7、8和14。见图7。这些序列由SEQ ID NO5编码。轻链的CDR区是SEQ ID NO10、11和13。见图7。这些序列由SEQ ID NO6编码。
C.人类框架的选择在2B6的克隆之后，将重链和轻链的可变区的氨基酸序列(图1和2)(分别是SEQ ID NO15和16)与KABAT和SWISS-PROT(Nuc.AcidsRes.，202019-2022(1992))蛋白序列数据库中已知的鼠免疫球蛋白序列进行比较，以将氨基酸归属至N末端残基。然后将推断的2B6重链和轻链可变区氨基酸序列与人类免疫球蛋白序列数据库进行比较，以确定重链和轻链的人类框架，它应与鼠类序列最为匹配。此外，用位置数据库(positionaldatabase)评价重链和轻链，以估计由于氨基酸而导致的冲突，该冲突可能影响CDR的呈递，所述数据库是从Fab结构域的结构模型产生的。通过在冲突位置替换相应的小鼠氨基酸，可以在人源化可变区的合成过程中解决冲突。
得自人类骨髓瘤免疫球蛋白(COR)的抗体的重链框架区被利用(E.M.Press和N.M.Hogg，Biochem.J.，117641-660(1970))。发现人类重链框架氨基酸序列与2B6框架有大约66％的同源性。
对于合适的轻链可变区框架，利用了Bence-Jones蛋白(LEN)的轻链可变框架序列(Schneider等，Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.，356507-557(1975))。在氨基酸水平上，人类轻链框架区与鼠类2B6轻链框架区有大约82％的同源性。
选定的人类框架被反向翻译以提供DNA序列。
D.人源化Mab基因的构建提供2B6重链CDR[图7和SEQ ID NO1-2]和人类抗体的框架序列，制备合成的重链可变区[SEQ ID NO18]。它是用四个合成的寡核苷酸[SEQID NO27和28][SEQ ID NO29和30]制备的，当这些寡核苷酸连接到一起时，编码氨基酸#21-#106(KABAT编号)。然后将寡核苷酸连接到基于pUC18的质粒的HpaI-KpnI限制性位点中，该质粒含有基于COR框架(同上)的来源于另一人源化重链的序列。这个质粒提供单一序列[SEQ IDNO17]和残余的可变区序列。用诱变引物通过PCR或通过将合成的连接物添加到已存在的限制性位点中，对作图的序列中的任何错误进行改正。
信号序列和人源化重链可变区作为EcoRI-ApaI片段被从基于pUC的质粒中切下，并被连接到表达载体pCD中，pCD包含IgG1人类恒定区。合成的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列在图8[SEQ ID NO18和19]中给出。人类框架残基是SEQ ID NO19的氨基酸1-30，36-49，66-97和109-119。CDR的氨基酸序列与鼠2B6 CDR相同。所得的表达载体pCDIL5HZHC1.0在图10中给出。
提供2B6轻链CDR[图7和SEQ ID NO10、11和12]和人类抗体的框架序列，制备合成的轻链可变区[SEQ ID NO20]。四个合成的寡核苷酸被插入基于pUC18的质粒中；这四个合成的寡核苷酸编码人源化VL氨基酸#27-#58(KABAT编号)[SEQ ID NO31和32]和氨基酸#80-#109[SEQ IDNO33和34]，它们分别带有SacI-KpnI和PstI-HindIII末端；所述质粒含有来源于另一人类轻链框架(B17)(Marsh等，Nuc.Acids Res.，136531-6544(1985))的序列，它与LEN框架有高度的同源性。这个质粒提供残余的可变区序列。用诱变引物通过PCR或通过将合成的连接物添加到已存在的限制性位点中，对作图的序列中的任何错误和LEN与B17之间的单氨基酸差异进行改正。
人源化轻链可变区以EcoRV-Narl片段从pUC质粒中分离出来，连接到表达载体pCN中，该载体含有单一序列[SEQ ID NO17]和kappa人类恒定区。合成的轻链可变区核苷酸和氨基酸序列在图9[SEQ ID NO20和21]中给出。人类框架残基是SEQ ID NO21的氨基酸1-23、41-55、63-94和104-113。CDR的氨基酸序列与鼠2B6CDR相同。但是，这些CDR的编码序列与鼠2B6编码序列不同，以产生限制性酶位点。所得的一个表达载体，pCNIL5HZLC1.0在图11中给出。这些合成的可变轻链和/或质粒序列被用于构建人源化抗体。
E.人源化MAB的表达来源于IgG1同种型的人源化重链利用了SEQ ID NO19提供的合成的重链可变区。按上面描述的方法设计并合成含有2B6重链CDR的该合成的VH。
人源化的轻链，一种人类kappa链，利用了SEQ ID NO21提供的合成的轻链可变区。按上面描述的方法设计并合成含有2B6轻链CDR的该合成的VL。编码人源化可变区的DNA片段被插入基于pUC19的哺乳动物细胞表达质粒，该质粒利用了单一序列，并含有CMV启动子，以及嵌合体的人类重链或人类轻链恒定区，用常规方法(Maniatis等，引文同上)得到质粒pCDIL5HZHC1.0(重链)[SEQ ID NO49，也见图10]和pCNIL5HZLC1.0(轻链)[SEQ ID NO50，也见图11]。质粒共转染到COS细胞中，分别在3和5天后用实施例5描述的ELISA进行上清试验，以确定人类抗体的存在。
上述实施例描述了示例性工程化抗体的制备。利用其他抗IL-5抗体(例如2F2、2E3、4A6、5D3、24G9等)，可用类似的方法开发其他工程化的抗体。
F.纯化CHO表达的嵌合和人源化2B6的纯化可通过常规的蛋白A(或G)亲和层析，离子交换和分子筛层析来完成。类似的方法已被成功地用于其他单克隆抗体(例如呼吸道合胞病毒、白介素4和疟疾环子孢子蛋白抗原)的纯化，纯度＞95％。
G.其他人源化单克隆抗体和表达质粒提供质粒pCDIL5HZHC 1.0[SEQ ID NO49]，制得表达质粒pCDIL5HZHC1.1，其中在框架位置73的Asp被Thr替换。这是通过将带有EcoRV和XhoI末端的合成的连接物[SEQ ID NO51和SEQ ID NO52]与同样消化的pCDIL5HZHC1.0连接而完成的。类似地，表达质粒pCDIL5HZHC1.2在框架位置37将Ile替换成Val。这是通过将带有HpaI和XbaI末端的合成的连接物[SEQ ID NO53和SEQ ID NO54]与同样消化的pCDIL5HZHC1.0连接而完成的。表达质粒pCDIL5HZHC1.3也是通过将带有HpaI和XbaI末端的合成的连接物[SEQ ID NO53和SEQ ID NO54]与同样消化的pCDIL5HZHC1.1连接而完成的。
提供前面描述的基于pUC18的质粒，制备人源化的轻链可变区，其中框架位置#15从Leu变成Ala，所述基于pUC18的质粒含有四个合成的寡核苷酸序列[SEQ ID NO31、32、33和34]。用NheI和SacI限制性内切酶消化该质粒，并插入一个合成的连接物[SEQ ID NO55和56]。然后分离EcoRV-NarI片段，将其连接到同样消化的表达载体pCDIL5HZHC1.0中，得到pCDIL5HZHC1.1。
用得自免疫球蛋白(NEW)的重链框架区(Saul等，J.Biol.Chem.253585-597(1978))和2B6重链CDR[图7和SEQ ID NO1-2]制备合成的可变区。可能影响CDR呈递的框架氨基酸被鉴定并用前面描述的方法替换。产生了四个重叠的合成寡核苷酸[SEQ ID NO57、58、59和60]，当它们被退火并延伸时，编码单一序列[SEQ ID NO17]和重链可变区的氨基酸。用PCR引物[SEQ ID NO63和64]扩增该合成的基因，并作为BstXI-HindIII限制性片段连接到基于pUC18的质粒中，该质粒含有基于COR框架的来源于另一人源化重链的序列。通过将合成的寡核苷酸连接物[SEQ IDNO75和76]插入SacII和KpnI限制性位点，在氨基酸位置91(Kabat编号系统)(等价于图12的位置94)进行苯丙氨酸到酪氨酸框架替换。所得的重链可变区[图12和SEQ ID NO61，62]被称作NEWM人源化的重链。
用诱变引物通过PCR或通过将合成的连接物添加到已存在的限制性位点中，对mapped序列中的任何错误进行改正。信号序列和人源化重链可变区作为EcoRI-ApaI片段被从基于pUC的质粒中切下，并被连接到表达载体pCD中，得到质粒pCDIL5NEWM，其中pCD包含IgG1人类恒定区。CDR的氨基酸序列与鼠2B6重链CDR的相同。
用得自免疫球蛋白(REI)的轻链框架区(Palm等，Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.356167-191(1975))和2B6轻链CDR[图7和SEQ ID NO10、11和12]制备合成的可变区。可能影响CDR呈递的框架氨基酸被鉴定并用前面描述的方法替换。产生了四个重叠的合成寡核苷酸[SEQ ID NO65、66、67和68]，当它们被退火并延伸时，编码代表的氨基酸[图13和SEQID NO69，70]，该轻链可变区被称为REI人源化轻链。用PCR引物[SEQ IDNO71和72]扩增该合成的基因，并作为EcoRI-HindIII限制性片段连接到pGEM-7Zf(+)(Promega公司，Madison，WI)中。
用诱变引物通过PCR或通过将合成的连接物添加到已存在的限制性位点中，对mapped序列中的任何错误进行改正。人源化轻链可变区作为EcoRV-NarI片段被从基于pGEM-7Zf(+)的质粒中切下，并被连接到表达载体pCN中，得到质粒pCNIL5REI，其中pGEM-7Zf(+)包含单一序列[SEQ IDNO17]以及人类Kappa恒定区。CDR的氨基酸序列与鼠2B6轻链CDR的相同。但是，这些CDR的编码序列与鼠2B6的编码序列不同，以产生限制性酶位点。这些合成的可变轻链和/或重链序列被用于构建人源化抗体。
提供上述基于pGEM-7Zf(+)的质粒，可制备人源化的轻链可变区，其中框架位置#15从缬氨酸变为丙氨酸。可用限制性内切酶NheI和SacI消化该质粒并插入合成的引物[SEQ ID NO73和74]。然后分离出EcoRR-NarI片段，将其连接到同样消化的表达载体pCNIL5HZREI中，得到质粒pCNIL5REIV15A。
实施例5-嵌合抗体的构建编码鼠单克隆抗体2B6重链可变区的氨基酸#9-#104(KABAT编号)的DNA被作为AvaII-StyI限制性片段从cDNA的基于pGEM7Zf+的PCR克隆中分离，所述cDNA由2B6杂交瘤细胞系(见实施例4)产生。通过将该片段与四个小的合成寡连接物[SEQ ID NO35、和36][SEQ ID NO37和38]结合到用BstX1-HindIII消化的基于pUC18的质粒中，可以提供侧面(flanking)重链可变区序列和一段信号序列[SEQ ID NO17]。从紧密相关的鼠重链推断的N末端氨基酸的共有序列被指认为前8个VH残基，并且在SEQ ID NO35和36中被编码。通过对2B6重链的前15个N末端氨基酸进行测序，确认了重链的推断氨基酸序列。
含有信号和VH区序列的EcoRI-ApaI片段被分离，并被连接到质粒pCD中，该质粒已编码人类IgG1恒定区。
编码鼠单克隆抗体2B6轻链可变区的氨基酸#12-#99(KABAT编号)的DNA被作为DdeI-AvaI限制性片段从cDNA的基于pGEM7Zf+的PCR克隆中分离，所述cDNA由2B6杂交瘤细胞系(见实施例4)产生。通过将该片段与四个小的合成寡连接物[SEQ ID NO39、和40][SEQ ID NO41和42]结合到用EcoRV-HindIII消化的基于pUC18的质粒中，可以提供侧面(flanking)轻链可变区序列。从紧密相关的鼠轻链推断的N末端氨基酸的共有序列被指认为前8个VL残基，并且在SEQ ID NO39和40中被编码。通过对2B6轻链的前15个N末端氨基酸进行测序，确认了轻链的推断氨基酸序列。该可变区随后作为EcoRV-Narf片段被分离出来，并连接到表达载体pCN中，该载体已含有人类kappa区和信号序列。
通过pCD和基于pCN的质粒共转染COS细胞来完成嵌合抗体的表达。3和5天后收集培养物上清，通过下面描述的ELISA检测免疫球蛋白的表达除最后一步外，各步骤之后用PBS清洗。用100纳克/50微升/孔的山羊抗体将微滴定平板包被过夜，所述抗体对人类抗体的Fc区有特异性。加入培养物上清，温育1小时。然后加入辣根过氧化物酶结合的山羊抗人IgG抗体，温育1小时。然后加入ABTS过氧化物酶底物(Kirkegaard & PerryLaboratories Inc.，Gaithersburg，MD)。温育1小时后，用微滴定平板计数器(Molecular Devices公司，Menlo Park，CA)在405nm处读取吸收值。嵌合抗体的表达被检测。在类似的ELISA中，含有嵌合抗体的COS细胞上清与包被了人类IL-5蛋白的微滴定孔特异性地结合。这个结果证实编码抗IL-5抗体的基因已被合成并表达。
上述实施例描述了示例性工程化抗体的制备。利用通过常规方式开发的其他抗IL-5供体抗体(例如2F2、2E3、4A6、5D3、24G9等)，可以用类似的方法开发其他工程化的抗体。
序列表(1)一般资料(i)申请人Ames，Robert S.
Appelbaum，Edward RChaiken，Irwin MCook，Richard M.
Gross，Mitchell S.
Holmes，Stephen D.
McMillan，Lynette J.
Theisen，Timothy W.(ii)发明名称用于治疗IL-5介导的疾病的重组IL5拮抗剂(iii)序列数76(iv)相关地址(A)收信人SmithKline Beecham Corp./Corporate(B)街道P.O. Box1539-UW2220(C)城市King of Prussia(D)州Pennsylvania(E)国家USA(F)邮编19406-0936(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM兼容型(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)当前申请资料(A)申请号(B)提交日期(C)分类(vii)在先申请资料(A)申请号US08/470110(B)提交日期1995年6月6日(vii)在先申请资料
(A)申请号US08/467420(B)提交日期1995年6月6日(vii)在先申请资料(A)申请号US08/363131(B)提交日期1994年12月23日(VIII)律师/代理人资料(A)姓名Sutton，Jeffrey A.
(B)注册号34,028(C)参考/登记号P50282-2(ix)远程通讯资料(A)电话610-270-5024(B)电传610-270-5090(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度334个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)特性(A)名称/关键词misc_feature(B)位置1..334(D)其他资料/注＝“第一个碱基相应于Kabat位置24”(xi)序列描述SEQ ID NO1ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT CACAGAGCCT GTCCATCACT TGCACTGTCT CTGGGTTTTC 60ATTAACCAGC TATAGTGTAC ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT 120GGGAGTAATA TGGGCTAGTG GAGGCACAGA TTATAATTCG GCTCTCATGT CCAGACTGAG 180CATCAGCAAA GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA CTGAACAGTC TGCAAACTGA 240TGACACAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAGA TCCCCCTTCT TCCTTACTAC GGCTTGACTA 300CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCA 334(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度315个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)特性(A)名称/关键词misc_feature(B)位置1..315(D)其他资料/注＝“第一个碱基相应于Kabat位置25”(xi)序列描述SEQ ID NO2TCCTCCCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGCAAGTC CAGTCAGAGT 60CTGTTAAACA GTGGAAATCA AAAGAACTAC TTGGCCTGGT ACCAGCAGAA ACCAGGGCAG120CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC180ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTTCCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC240CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGTTCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA300GAGTTGGAAA TAAAA 315(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度334个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)特性(A)名称/关键词misc_feature(B)位置1..334
(D)其他资料/注＝“第一个碱基相应于Kabat位置24”(xi)序列描述SEQ ID NO3ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT CACAGAGCCT GTCCATCACT TGCACTGTCT CTGGGTTTTC 60ATTAACCAGT TATAGTGTAC ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT120GGGAGTAATA TGGGCTAGTG GAGGCACAGA TTATAATTCG GCTCTCATGT CCAGACTGAG180CATCAGCAAA GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA CTGAACAGTC TGCGAACTGA240TGACACAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAGA TCCCCCTTCT TCCTTACTAC GGCTTGACTA300CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCA334(2)SEQ ID NO4的资料334(i)序列特征(A)长度315个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)特性(A)名称/关键词misc_feature(B)位置1..315(D)其他资料/注＝“第一个碱基相应于Kabat位置25”(xi)序列描述SEQ ID NO4TCCTCCCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGCAAGTC CAGTCAGAGT 60CTATTAAACA GTGGAAATCA AAAGAACTAC TTGGCCTGGT ACCAACAGAA ACCAGGGCAG 120CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC 180ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTACCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC 240CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGATCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA 300GAGTTGGAAA TAAAA(2)SEQ ID NO5的资料315(i)序列特征
(A)长度334个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)特性(A)名称/关键词misc_feature(B)位置1..334(D)其他资料/注＝“第一个碱基相应于Kabat位置24”(xi)序列描述SEQ ID NO5ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT CACAGAGCCT GTCCATCACT TGCACTGTCT CTGGGTTTTC 60ATTAACCAGC TATAGTGTAC ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT120GGGAGTAATC TGGGCTAGTG GAGGCACAGA TTATAATTCG GCTCTCATGT CCAGACTGAG180CATCAGCAAA GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA CTGAACAGTC TGCAAACTGA240TGACGCAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAGA TCCCCCTTTT TCCTTACTAC GGCTTGACTT300CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCA334(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度315个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)特性(A)名称/关键词misc_feature(B)位置1..315(D)其他资料/注＝“第一个碱基相应于Kabat位置25”(xi)序列描述SEQ ID NO6TCCTCTCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGCAAGTC CAGTCAGAGT60CTGTTAAACA GTGGAAATCA AAAAAACTAC TTGGCCTGGT ACCAGCAGAA ACCAGGGCAG 120CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC 180ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTACCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC 240CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGATCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA 300GAGTTGGAAA TAAAA315(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO1Ser Tyr Ser Val His1 5(2)SEQ ID NO8的资料(i)序列特征(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO8Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO9的资料(i)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO9Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO10的资料(i)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO10Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu1 5 10 15Ala(2)SEQ ID NO11的资料(i)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO11
Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5(2)SEQ ID NO12的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO12Gln Asn Val His Ser Phe Pro Phe Thr1 5(2)SEQ ID NO13的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO13Gln Asn Asp His Ser Phe Pro Phe Thr1 5(2)SEQ ID NO14的资料(i)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO14Asp Pro Pro Phe Ser Leu Leu Arg Leu Asp Phe1 5 10(xi)序列描述SEQ ID NO15Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr20 25 30Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met50 55 60Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu65 70 75 80Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala85 9095Arg Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO16的资料(i)序列特征(A)长度113个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO16Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Val His Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Glu Leu Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO17的资料(i)序列特征(A)长度60个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO17ATGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT GGATCTCTGG TGCCTACGGG60(2)SEQ ID NO18的资料(i)序列特征(A)长度357个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO18CAGGTTACCC TGCGTGAATC CGGTCCGGCA CTAGTTAAAC CGACCCAGAC CCTGACGTTA60ACCTGCACCG TCTCCGGTTT CTCCCTGACG AGCTATAGTG TACACTGGGT CCGTCAGCCG120CCGGGTAAAG GTCTAGAATG GCTGGGTGTA ATATGGGCTA GTGGAGGCAC AGATTATAAT180TCGGCTCTCA TGTCCCGTCT GTCGATATCC AAAGACACCT CCCGTAACCA GGTTGTTCTG240ACCATGACTA ACATGGACCC GGTTGACACC GCTACCTACT ACTGCGCTCG AGATCCCCCT300TCTTCCTTAC TACGGCTTGA CTACTGGGGT CGTGGTACCC CAGTTACCGT GAGCTCA 357(2)SEQ ID NO19的资料(i)序列特征(A)长度l19个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO19Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr20 25 30Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met50 55 60Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly100 105 110Thr Pro Val Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO20的资料(i)序列特征(A)长度339个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO20GATATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCG CTAGCTGTGT CTCTGGGCGA GAGGGCCACC 60ATCAACTGCA AGAGCTCTCA GAGTCTGTTA AACAGTGGAA ATCAAAAGAA CTACTTGGCC 120TGGTATCAGC AGAAACCCGG GCAGCCTCCT AAGTTGCTCA TTTACGGGGC GTCGACTAGG 180GAATCTGGGG TACCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC 240ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTATACTACT GTCAGAATGT TCATAGTTTT 300CCATTCACGT TCGGCGGAGG GACCAAGTTG GAGATCAAA 339(2)SEQ ID NO21的资料(i)序列特征(A)长度113个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO21Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Val His Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO22的资料(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO22GTACATATGC AAGGCTTACA ACCACAATC 29(2)SEQ ID NO23的资料(i)序列特征
(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO23GGACAGGGCT TACTAGTGGG CCCTCTGGGC TC32(2)SEQ ID NO24的资料(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO24AGGTSMARCT KTCTCGAGTC WGG 23(2)SEQ ID NO25的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO25CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG36(2)SEQ ID NO26的资料(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO26CCAGATGTGA GCTCGTGATG ACCCAGACTC CA 32(2)SEQ ID NO27的资料(i)序列特征(A)长度140个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO27AACCTGCACC GTCTCCGGTT TCTCCCTGAC GAGCTATAGT GTACACTGGG TCCGTCAGCC60GCCGGGTAAA GGTCTAGAAT GGCTGGGTGT AATATGGGCT AGTGGAGGCA CAGATTATAA120TTCGGCTCTC ATGTCCCGTC140(2)SEQ ID NO28的资料(i)序列特征(A)长度149个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO28ATATCGACAG ACGGGACATG AGAGCCGAAT TATAATCTGT GCCTCCACTA GCCCATATTA60CACCCAGCCA TTCTAGACCT TTACCCGGCG GCTGACGGAC CCAGTGTACA CTATAGCTCG120TCAGGGAGAA ACCGGAGACG GTGCAGGTT 149(2)SEQ ID NO29的资料(i)序列特征(A)长度139个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO29TGTCGATATC CAAAGACACC TCCCGTAACC AGGTTGTTCT GACCATGACT AACATGGACC 60CGGTTGACAC CGCTACCTAC TACTGCGCTC GAGATCCCCC TTCTTCCTTA CTACGGCTTG120ACTACTGGGG TCGTGGTAC 139(2)SEQ ID NO30的资料(i)序列特征(A)长度126个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO30CACGACCCCA GTAGTCAAGC CGTAGTAAGG AAGAAGGGGG ATCTCGAGCG CAGTAGTAGG 60TAGCGGTGTC AACCGGGTCC ATGTTAGTCA TGGTCAGAAC AACCTGGTTA CGGGAGGTGT120CTTTGG 126(2)SEQ ID NO31的资料(i)序列特征(A)长度117个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO31CTCAGAGTCT GTTAAACAGT GGAAATCAAA AGAACTACTT GGCCTGGTAT CAGCAGAAAC 60CCGGGCAGCC TCCTAAGTTG CTCATTTACG GGGCGTCGAC TAGGGAATCT GGGGTAC 117(2)SEQ ID NO32的资料(i)序列特征(A)长度117个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO32CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCCGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC CGGGTTTCTG 60CTGATACCAG GCCAAGTAGT TCTTTTGATT TCCACTGTTT AACAGACTCT GAGAGCT 117(2)SEQ ID NO33的资料(i)序列特征(A)长度102个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO33GCTGAAGATG TGGCAGTATA CTACTGTCAG AATGTTCATA GTTTTCCATT CACGTTCGGC 60GGAGGGACCA AGTTGGAGAT CAAACGTACT GTGGCGGCGC CA 102(2)SEQ ID NO34的资料(i)序列特征(A)长度111个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO34AGCTTGGCGC CGCCACAGTA CGTTTGATCT CCAACTTGGT CCCTCCGCCG AACGTGAATG 60GAAAACTATG AACATTCTGA CAGTAGTATA CTGCCACATC TTCAGCCTGC A 111(2)SEQ ID NO35的资料(i)序列特征(A)长度82个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO35ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT GGATCTCTGG TGCCTACGGG60CAGGTTCAAC TGAAAGAGTC AG 82(2)SEQ ID NO36的资料(i)序列特征(A)长度89个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO36GTCCTGACTC TTTCAGTTGA ACCTGCCCGT AGGCACCAGA GATCCAGAGC AACAGAGAAA60TGAAGACCTG GGTCTGCAAC ACCATGTTG 89(2)SEQ ID NO37的资料(i)序列特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO37CAAGGCACCA CTCTCACAGT CTCCTCAGCT AGTACGAAGG GCCCA 45(2)SEQ ID NO38的资料(i)序列特征(A)长度43个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO38AGCTTGGGCC CTTCGTACTA GCTGAGGAGA CTGTGAGTGG TGC43(2)SEQ ID NO39的资料(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO39ATCGTGATGA CCCAGTCTCC ATCCTCCC 28(2)SEQ ID NO40的资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO40TCAGGGAGGA TGGAGACTGG GTCATCACGA T 31(2)SEQ ID NO41的资料(i)序列特征(A)长度43个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO41TCGGGGGACA GAGTTGGAAA TAAAACGTAC TGTGGCGGCG CCA 43(2)SEQ ID NO42的资料(i)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO42AGCTTGGCGC CGCCACAGTA CGTTTTATTT CCAACTCTGT CC 42(2)SEQ ID NO43的资料(i)序列特征
(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO43CTAGCCACCA CCACCACCAC CACTAA 26(2)SEQ ID NO44的资料(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO44CTAGTTAGTG GTGGTGGTGG TGGTGG 26(2)SEQ ID NO45的资料(i)序列特征(A)长度113个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO45Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly15 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO46的资料(i)序列特征(A)长度113个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO46Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Pne Tnr Gly Ser Gly Ser Gly Tnr Asp Pne Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO47的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO47Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Phe Thrl 5(2)SEQ ID NO48的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO48Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr1 5(2)SEQ ID NO49的资料(i)序列特征(A)长度6285个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构环状(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO49GACGTCGCGG CCGCTCTAGG CCTCCAAAAA AGCCTCCTCA CTACTTCTGG AATAGCTCAG 60AGGCCGAGGC GGCCTCGGCC TCTGCATAAA TAAAAAAAAT TAGTCAGCCA TGCATGGGGC120GGAGAATGGG CGGAACTGGG CGGAGTTAGG GGCGGGATGG GCGGAGTTAG GGGCGGGACT180ATGGTTGCTG ACTAATTGAG ATGCATGCTT TGCATACTTC TGCCTGCTGG GGAGCCTGGG240GACTTTCCAC ACCTGGTTGC TGACTAATTG AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT300GGGGAGCCTG GGGACTTTCC ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGAAT TAATTCCCGG360GGATCGATCC GTCGACGTAC GACTAGTTAT TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT420CATAGCCCAT ATATGGAGTT CCGCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA480CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA540ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GACTATTTAC GGTAAACTGC CCACTTGGCA600GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG660CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC720TACGTATTAG TCATCGCTAT TACCATGGTG ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT780GGATAGCGGT TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT 840TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC CGCCCCATTG 900ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA TAAGCAGAGC TGGGTACGTG 960AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCGA ATTCGAGGAC GCCAGCAACA TGGTGTTGCA1020GACCCAGGTC TTCATTTCTC TGTTGCTCTG GATCTCTGGT GCCTACGGGC AGGTTACCCT1080GCGTGAATCC GGTCCGGCAC TAGTTAAACC GACCCAGACC CTGACGTTAA CCTGCACCGT1140CTCCGGTTTC TCCCTGACGA GCTATAGTGT ACACTGGGTC CGTCAGCCGC CGGGTAAAGG1200TCTAGAATGG CTGGGTGTAA TATGGGCTAG TGGAGGCACA GATTATAATT CGGCTCTCAT1260GTCCCGTCTG TCGATATCCA AAGACACCTC CCGTAACCAG GTTGTTCTGA CCATGACTAA1320CATGGACCCG GTTGACACCG CTACCTACTA CTGCGCTCGA GATCCCCCTT CTTCCTTACT1380ACGGCTTGAC TACTGGGGTC GTGGTACCCC AGTTACCGTG AGCTCAGCTA GTACCAAGGG1440CCCATCGGTC TTCCCCCTGG CACCCTCCTC CAAGAGCACC TCTGGGGGCA CAGCGGCCCT1500GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA ACTCAGGCGC1560CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG TCCTCAGGAC TCTACTCCCT1620CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG CTTGGGCACC CAGACCTACA TCTGCAACGT1680GAATCACAAG CCCAGCAACA CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGCCCAAAT CTTGTGACAA1740AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT CAGTCTTCCT1800CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT1860GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT1920GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT 1980GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA 2040GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA 2100GCCCCGAGAA CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA CCAAGAACCA 2160GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA 2220GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG 2280CTCCTTCTTC CTCTATAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT 2340CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC 2400CCTGTCTCCG GGTAAGTGAG TGTAGTCTAG ATCTACGTAT GATCAGCCTC GACTGTGCCT 2460TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT 2520GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG 2580TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC 2640AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC TCTATGGAAC CAGCTGGGGC TCGACAGCGC 2700TGGATCTCCC GATCCCCAGC TTTGCTTCTC AATTTCTTAT TTGCATAATG AGAAAAAAAG 2760GAAAATTAAT TTTAACACCA ATTCAGTAGT TGATTGAGCA AATGCGTTGC CAAAAAGGAT 2820GCTTTAGAGA CAGTGTTCTC TGCACAGATA AGGACAAACA TTATTCAGAG GGAGTACCCA 2880GAGCTGAGAC TCCTAAGCCA GTGAGTGGCA CAGCATTCTA GGGAGAAATA TGCTTGTCAT 2940CACCGAAGCC TGATTCCGTA GAGCCACACC TTGGTAAGGG CCAATCTGCT CACACAGGAT 3000AGAGAGGGCA GGAGCCAGGG CAGAGCATAT AAGGTGAGGT AGGATCAGTT GCTCCTCACA 3060TTTGCTTCTG ACATAGTTGT GTTGGGAGCT TGGATAGCTT GGACAGCTCA GGGCTGCGAT 3120TTCGCGCCAA ACTTGACGGC AATCCTAGCG TGAAGGCTGG TAGGATTTTA TCCCCGCTGC 3180CATCATGGTT CGACCATTGA ACTGCATCGT CGCCGTGTCC CAAAATATGG GGATTGGCAA 3240GAACGGAGAC CTACCCTGGC CTCCGCTCAG GAACGAGTTC AAGTACTTCC AAAGAATGAC 3300CACAACCTCT TCAGTGGAAG GTAAACAGAA TCTGGTGATT ATGGGTAGGA AAACCTGGTT 3360CTCCATTCCT GAGAAGAATC GACCTTTAAA GGACAGAATT AATATAGTTC TCAGTAGAGA 3420ACTCAAAGAA CCACCACGAG GAGCTCATTT TCTTGCCAAA AGTTTGGATG ATGCCTTAAG 3480ACTTATTGAA CAACCGGAAT TGGCAAGTAA AGTAGACATG GTTTGGATAG TCGGAGGCAG 3540TTCTGTTTAC CAGGAAGCCA TGAATCAACC AGGCCACCTT AGACTCTTTG TGACAAGGAT 3600CATGCAGGAA TTTGAAAGTG ACACGTTTTT CCCAGAAATT GATTTGGGGA AATATAAACT 3660TCTCCCAGAA TACCCAGGCG TCGTCTCTGA GGTCCAGGAG GAAAAAGGCA TCAAGTATAA 3720GTTTGAAGTC TACGAGAAGA AAGACTAACA GGAAGATGCT TTCAAGTTCT CTGCTCCCCT 3780CCTAAAGCTA TGCATTTTTA TAAGACCATG GGACTTTTGC TGGCTTTAGA TCAGCCTCGA 3840CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGTTG TTTGCCCCTC CCCCGTGCCT TCCTTGACCC 3900TGGAAGGTGC CACTCCCACT GTCCTTTCCT AATAAAATGA GGAAATTGCA TCGCATTGTC 3960TGAGTAGGTG TCATTCTATT CTGGGGGGTG GGGTGGGGCA GGACAGCAAG GGGGAGGATT 4020GGGAAGACAA TAGCAGGCAT GCTGGGGATG CGGTGGGCTC TATGGAACCA GCTGGGGCTC 4080GATCGAGTGT ATGACTGCGG CCGCGATCCC GTCGAGAGCT TGGCGTAATC ATGGTCATAG 4140CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG AGCCGGAAGC 4200ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC TCACATTAAT TGCGTTGCGC 4260TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG TCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA 4320CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT GCGTATTGGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT CACTGACTCG 4380CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC GGTAATACGG 4440TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG 4500GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC 4560GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA 4620TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT 4680ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA ATGCTCACGC 4740TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC 4800CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA 4860AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT 4920GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC TAGAAGGACA 4980GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT 5045TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT 5105ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT 5160CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC 5220ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA 5280ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC GATCTGTCTA 5340TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC 5400TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT 5460TTATCAGCAA TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC TGCAACTTTA 5520TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT 5580AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT ACAGGCATCG TGGTGTCACG CTCGTCGTTT 5640GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG ATCCCCCATG 5700TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC 5760GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT CATGCCATCC 5820GTAAGATGCT TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA ATAGTGTATG 5880CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA-ATACGGGATA ATACCGCGCC ACATAGCAGA 5940ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA 6000CCGCTGTTGA GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC TTCAGCATCT 6060TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC CGCAAAAAAG 6120GGAATAAGGG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA ATATTATTGA 6180AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT TTAGAAAAAT 6240AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCT 6285(2)SEQ ID NO50的资料(i)序列特征(A)长度5703个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构环状(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO50GACGTCGCGG CCGCTCTAGG CCTCCAAAAA AGCCTCCTCA CTACTTCTGG AATAGCTCAG 60AGGCCGAGGC GGCCTCGGCC TCTGCATAAA TAAAAAAAAT TAGTCAGCCA TGCATGGGGC120GGAGAATGGG CGGAACTGGG CGGAGTTAGG GGCGGGATGG GCGGAGTTAG GGGCGGGACT180ATGGTTGCTG ACTAATTGAG ATGCATGCTT TGCATACTTC TGCCTGCTGG GGAGCCTGGG240GACTTTCCAC ACCTGGTTGC TGACTAATTG AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT300GGGGAGCCTG GGGACTTTCC ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGAAT TAATTCCCGG360GGATCGATCC GTCGACGTAC GACTAGTTAT TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT420CATAGCCCAT ATATGGAGTT CCGCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA480CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA540ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GACTATTTAC GGTAAACTGC CCACTTGGCA600GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG660CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC720TACGTATTAG TCATCGCTAT TACCATGGTG ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT780GGATAGCGGT TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT840TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC CGCCCCATTG900ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA TAAGCAGAGC TGGGTACGTG960AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCGA ATTCATTGAT AGGATCCAGC AAGATGGTGT 1020TGCAGACCCA GGTCTTCATT TCTCTGTTGC TCTGGATCTC TGGTGCCTAC GGGGATATCG 1080TGATGACCCA GTCTCCAGAC TCGCTAGCTG TGTCTCTGGG CGAGAGGGCC ACCATCAACT 1140GCAAGAGCTC TCAGAGTCTG TTAAACAGTG GAAATCAAAA GAACTACTTG GCCTGGTATC 1200AGCAGAAACC CGGGCAGCCT CCTAAGTTGC TCATTTACGG GGCGTCGACT AGGGAATCTG 1260GGGTACCTGA CCGATTCAGT GGCAGCGGGT CTGGGACAGA TTTCACTCTC ACCATCAGCA 1320GCCTGCAGGC TGAAGATGTG GCAGTATACT ACTGTCAGAA TGTTCATAGT TTTCCATTCA 1380CGTTCGGCGG AGGGACCAAG TTGGAGATCA AACGTACTGT GGCGGCGCCA TCTGTCTTCA 1440TCTTCCCGCC ATCTGATGAG CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA 1500ATAACTTCTA TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG 1550GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC AGCCTCAGCA 1620GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA AGTCTACGCC TGCGAAGTCA 1630CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAATTCT 1740AGATCCGTTA TCTACGTATG ATCAGCCTCG ACTGTGCCTT CTAGTTGCCA GCCATCTGTT 1800GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC CTGGAAGGTG CCACTCCCAC TGTCCTTTCC 1860TAATAAAATG AGGAAATTGG ATCGCATTGT CTGAGTAGGT GTCATTCTAT TCTGGGGGGT 1920GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT 1980GCGGTGGGCT CTATGGAACC AGCTGGGGCT CGACAGCTCG AGCTAGCTTT GCTTCTCAAT 2040TTCTTATTTG CATAATGAGA AAAAAAGGAA AATTAATTTT AACACCAATT CAGTAGTTGA 2100TTGAGCAAAT GCGTTGCCAA AAAGGATGCT TGTTCTCTGC TTAGAGACAG ACAGATAAGG 2160ACAAACATTA TTCAGAGGGA GTACCCAGAG CTGAGACTCC TAAGCCAGTG AGTGGCACAG 2220CATTCTAGGG AGAAATATGC TTGTCATCAC CGAAGCCTGA TTCCGTAGAG CCACACCTTG 2280CATTCTAGGG AGAAATATGC TTGTCATCAC CGAAGCCTGA TTCCGTAGAG CCACACCTTG 2280GTAAGGGCCA ATCTGCTCAC ACAGGATAGA GAGGGCAGGA GCCAGGGCAG AGCATATAAG 2340GTGAGGTAGG ATCAGTTGCT CCTCACATTT GCTTCTGACA TAGTTGTGTT GGGAGCTTGG 2400ATCGATCCAC CATGGTTGAA CAAGATGGAT GTCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG 2400AGAGGCTATT CGGCTATGAC TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT 2520AGAGGCTATT CGGCTATGAC TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT 2520TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC 2580TGAATGAACT GCAGGACGAG GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT 2640GCGCAGCTGT GCTCGACGTT GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG 2700TGCCGGGGCA GGATCTCCTG TCATCTCACC TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG 2760CTGATGCAAT GCGGCGGCTG CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG 2820CGAAACATCG CATCGAGCGA GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG 2880ATCTGGACGA AGAGCATCAG GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC 2940GCATGCCCGA CGGCGAGGAT CTCGTCGTGA CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA 3000TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT TCTGGATTCA TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC 3060GCTATCAGGA CATAGCGTTG GCTACCCGTG ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG 3120CTGACCGCTT CCTCGTGCTT TACGGTATCG CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT 3180ATCGCCTTCT TGACGAGTTC TTCTGAGCGG GACTCTGGGG TTCGAAATGA CCGACCAAGC 3240GACGCCCAAC CTGCCATCAC GAGATTTCGA TTCCACCGCC GCCTTCTATG AAAGGTTGGG 3300CTTCGGAATC GTTTTCCGGG ACGCCGGCTG GATGATCCTC CAGCGCGGGG ATCTCATGCT 3360GGAGTTCTTC GCCCACCCCA ACTTGTTTAT TGCAGCTTAT AATGGTTACA AATAAAGCAA 3420GGAGTTCTTC GCCCACCCCA ACTTGTTTAT TGCAGCTTAT AATGGTTACA ATAAAGCAAA 3420TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT TTTTTCACTG CATTCTAGTT GTGGTTTGTC 3480CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCTG GATCGCGGCC GCGATCCCGT CGAGAGCTTG 3540GCGTAATCAT GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC 3600AACATACGAG CCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC 3660ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG 3720CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CTCTTCCGCT 3780TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC 3840TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA 3900GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT 3960AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC 4020CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT 4080GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG 4140CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG 4200GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT 4260CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG 4320ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC 4380GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA 4440AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT 4500GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT 4560TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA 4620TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC 4680TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT 4740ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA 4800ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA 4860CGGTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA 4920AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA 4980GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTAC AGGCATCGTG 5040GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA 5100GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT 5160GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT 5220CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA 5280TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC CGGCGTCAAT ACGGGATAAT 5340ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA 5400AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC 5460AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG 5520CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC 5580CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT 5640GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA 5700CCT 5703(2)SEQ ID NO51的资料(i)序列特征(A)长度81个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO51ATCCAAAGAC AACTCCCGTA ACCAGGTTGT TCTGACCATG ACTAACATGG ACCCGGTTGA60CACCGCTACC TACTACTGCG C 81(2)SEQ ID NO52的资料(i)序列特征(A)长度85个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO52TCGAGCGCAG TAGTAGGTAG CGGTGTCAAC CGGGTCCATG TTAGTCATGG TCAGAACAAC60CTGGTTACGG GAGTTGTCTT TGGAT 85(2)SEQ ID NO53的资料(i)序列特征(A)长度73个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO53AACCTGCACC GTCTCCGGTT TCTCCCTGAC GAGCTATAGT GTACACTGGA TCCGTCAGCC60GCCGGGTAAA GGT 73(2)SEQ ID NO54的资料(i)序列特征(A)长度77个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO54CTAGACCTTT ACCCGGCGGC TGACGGATCC AGTGTACACT ATAGCTCGTC AGGGAGAAAC60CGGAGACGGT GCAGGTT 77(2)SEQ ID NO55的资料(i)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO55CTAGCTGTGT CAGCTGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGAGCT 46(2)SEQ ID NO56的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO56CTTGCAGTTG ATGGTGGCCC TCTCGCCAGC TGACACAG38(2)SEQ ID NO57的资料(i)序列特征(A)长度140个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO57TTCGAGGACG CCAGCAACAT GGTGTTGCAG ACCCAGGTCT TCATTTCTCT GTTGCTCTGG60ATCTCTGGTG CCTACGGGCA GGTCCAACTG CAGGAGAGCG GTCCAGGTCT TGTGAGACCT 120AGCCAGACCC TGAGCCTGAC 140(2)SEQ ID NO58的资料(i)序列特征(A)长度138个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO58GTGCCTCCAC TAGCCCATAT TACTCCAAGC CACTCTAGAC CTCGTCCAGG TGGCTGTCTC 60ACCCAGTGTA CACTATAGCT GGTGAGGGAG AAGCCCGAGA CGGTGCAGGT CAGGCTCAGG120GTCTGGCTAG GTCTCACA 138(2)SEQ ID NO59的资料(i)序列特征(A)长度143个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO59GGCTTGGAGT AATATGGGCT AGTGGAGGCA CAGATTATAA TTCGGCTCTC ATGTCCAGAC60TGAGTATACT GAAAGACAAC AGCAAGAACC AGGTCAGCCT GAGACTCAGC AGCGTGACAG 120CCGCCGACAC CGCGGTCTAT TTC143(2)SEQ ID NO60的资料(i)序列特征(A)长度136个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO60CCAGTGCCAA GCTTGGGCCC TTGGTGGAGG CGCTCGAGAC GGTGACCGT GGTACCTTGTC 60CCCAGTAGTC AAGCCGTAGT AAGGAAGAAG GGGGATCTCG AGCACAGAAA TAGACCGCGG120TGTCGGCGGC TGTCAC136(2)SEQ ID NO61的资料(i)序列特征(A)长度357个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO61CAGGTCCAAC TGCAGGAGAG CGGTCCAGGT CTTGTGAGAC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTG 60ACCTGCACCG TCTCGGGCTT CTCCCTCACC AGCTATAGTG TACACTGGGT GAGACAGCCA120CCTGGACGAG GTCTAGAGTG GCTTGGAGTA ATATGGGCTA GTGGAGGCAC AGATTATAAT180TCGGCTCTCA TGTCCAGACT GAGTATACTG AAAGACAACA GCAAGAACCA GGTCAGCCTG240AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ACTGTGCTCG GGATCCCCCT300TCTTCCTTAC TACGGCTTGA CTACTGGGGA CAAGGTACCA CGGTCACCGT CTCGAGC 357(2)SEQ ID NO62的资料(i)序列特征(A)长度119个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO62Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr20 25 30Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met50 55 60Ser Arg Leu Ser Ile Leu Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu65 70 75 80Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO63的资料(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO63AGGACGCCAG CAACATGGTG TTGCAGAC28(2)SEQ ID NO64的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO64TGCCAAGCTT GGGCCCTTGG TGGAGGCGCT CGAGAC 36(2)SEQ ID NO65的资料(i)序列特征(A)长度121个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO65GACCATGATT ACGAATTCGT AGTCGGATAT CGTGATGACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG 60CGCTAGCGTG GGTGACAGAG TGACCATCAC CTGTAAGAGC TCTCAGAGTC TGTTAAACAG120T121(2)SEQ ID NO66的资料(i)序列特征(A)长度116个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO66AGATTCCCTA GTCGATGCCC CGTAGATCAG CAGCTTTGGA GCCTTACCGG GTTTCTGCTG 60ATACCAGGCC AAGTAGTTCT TTTGATTTCC ACTGTTTAAC AGACTCTGAG AGCTCT116(2)SEQ ID NO67的资料(i)序列特征(A)长度116个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO67TCTACGGGGC ATCGACTAGG GAATCTGGGG TACCAGATAG ATTCAGCGGT AGCGGTAGCG 60GAACCGACTT CACCTTCACC ATCAGCAGCC TGCAGCCAGA GGACATCGCC ACCTAC116(2)SEQ ID NO68的资料(i)序列特征(A)长度117个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO68TCGATGCCAA GCTTGGCGCC GCCACAGTAC GTTTGATCTC CACCTTGGTC CCTTGTCCGA 60ACGTGAATGG AAACTATGA ACATTCTGGC AGTAGTAGGT GGCGATGTCC TCTGGCT 117(2)SEQ ID NO69的资料(i)序列特征(A)长度339个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO69GATATCGTGA TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60ATCACCTGTA AGAGCTCTCA GAGTCTGTTA AACAGTGGAA ATCAAAAGAA CTACTTGGCC120TGGTATCAGC AGAAACCCGG TAAGGCTCCA AAGCTGCTGA TCTACGGGGC ATCGACTAGG180GAATCTGGGG TACCAGATAG ATTCAGCGGT AGCGGTAGCG GAACCGACTT CACCTTCACC240ATCAGCAGCC TGCAGCCAGA GGACATCGCC ACCTACTACT GCCAGAATGT TCATAGTTTT300CCATTCACGT TCGGACAAGG GACCAAGGTG GAGATCAAA 339(2)SEQ ID NO70的资料(i)序列特征(A)长度113个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO70Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys35 40 45Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr phe Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Val His Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile100 105 110(2)SEQ ID NO71的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO71GATTACGAAT TCGTAGTCGG ATAT24(2)SEQ ID NO72的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO72TGCCAAGCTT GGCGCCGCCA CAGT24(2)SEQ ID NO73的资料(i)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO73CTAGTGCGGG TGACCGAGTG ACCATCACCT GTAAGAGCT39(2)SEQ ID NO74的资料(i)序列特征
(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO74CTTACAGGTG ATGGTCACTC GGTCACCCGC A 31(2)SEQ ID NO75的资料(i)序列特征(A)长度66个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO75GGTCTATTAC TGTGCTCGGG ATCCCCCTTC TTCCTTACTA CGGCTTGACT ACTGGGGACA60AGGTAC 66(2)SEQ ID NO76的资料(i)序列特征(A)长度64个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO76CTTGTCCCCA GTAGTCAAGC CGTAGTAAGG AAGAAGGGGG ATCCCGAGCA CAGTAATAGA60CCGC 6权利要求
1.一种啮齿动物的中和单克隆抗体，它对人类白介素5有特异性，并具有解离常数等于或小于大约3.5×10-11M的结合亲和性。
2.权利要求1的单克隆抗体，它是鼠类的单克隆抗体。
3.权利要求1的单克隆抗体，它是大鼠的单克隆抗体。
4.权利要求2的单克隆抗体，它包含SEQ ID NO16的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO15的重链氨基酸序列。
5.权利要求1的单克隆抗体，它具有2B6、2E3、2F2或4A6的鉴定特征。
6.一种杂交瘤，它具有细胞系SK119-2B6.206.75(1)、SK119-2E3.39.40.2、SK119-2F2.37.80.12或4A6(1)G1F7的鉴定特征。
7.一种中和Fab片段或其F(ab′)2片段，它是通过去除权利要求1的单克隆抗体的Fc区而制备的。
8.一种中和Fab片段或其F(ab′)2片段，它是通过链改组技术制备的，由此，权利要求1的单克隆抗体的Fd重链在鼠类轻链丝状噬菌体Fab显示文库中表达。
9.一种中和Fab片段或其F(ab′)2片段，它是通过链改组技术制备的，由此，权利要求1的单克隆抗体的轻链在鼠类重链丝状噬菌体Fab显示文库中表达。
10.一种改变的抗体，它包含一条重链和一条轻链，其中所述重链和轻链的框架区来源于至少一种选定的抗体，各所述链的互补决定区的氨基酸序列来源于权利要求1的单克隆抗体。
11.权利要求10的改变的抗体，其中重链的互补决定区的氨基酸序列是(a)SEQ ID NO7、8、9；或(b)SEQ ID NO7、8、14。
12.权利要求10的改变的抗体，其中轻链的互补决定区的氨基酸序列是(a)SEQ ID NO10、11、12；或(b)SEQ ID NO10、11、13。
13.权利要求10的改变的抗体，其中所述重链的框架区包含SEQIDNO19的氨基酸1-30，36-49，66-97和109-119。
14.权利要求10的改变的抗体，其中所述轻链的框架区包含SEQ IDNO21的氨基酸1-23，41-55，63-94和104-113。
15.一段免疫球蛋白重链互补决定区(CDR)，其氨基酸序列选自(a)SEQ ID NO7，(b)SEQ ID NO8，(c)SEQ ID NO9，和(d)SEQ ID NO14。
16.一段免疫球蛋白轻链互补决定区(CDR)，其氨基酸序列选自(a)SEQ ID NO10，(b)SEQ ID NO11，(c)SEQ ID NO12，(d)SEQ ID NO13，(e)SEQ ID NO47，和(f)SEQ ID NO48。
17.一种核酸分子，它编码权利要求15的免疫球蛋白互补决定区(CDR)。
18.一种核酸分子，它编码权利要求16的免疫球蛋白互补决定区(CDR)。
19.一种嵌合抗体，它包含一条重链和一条轻链，所述抗体的特征在于其对人类白介素-5的解离常数等于或小于3.5×10-11M，其中所述重链和轻链的恒定区来源于至少一种选定的抗体，各所述链的可变区的氨基酸序列来源于权利要求1的单克隆抗体。
20.权利要求19的抗体，其中恒定区选自人类免疫球蛋白。
21.一种药物组合物，它包含权利要求10的改变的抗体和一种药用载体。
22.一种治疗与嗜曙红细胞过量产生有关的人类疾病的方法，它包括给需要所述治疗的人施用有效量的权利要求10的改变的抗体。
23.权利要求22的方法，其中所述与嗜曙红细胞过量产生有关的疾病是气喘。
24.权利要求22的方法，其中所述与嗜曙红细胞过量产生有关的疾病是过敏性鼻炎。
25.权利要求22的方法，其中所述与嗜曙红细胞过量产生有关的疾病是特应性皮炎。
26.一段分离的核酸序列，它选自(a)编码权利要求10的改变的抗体的核酸序列；(b)与(a)互补的核酸序列；和(c)(a)和(b)的片段或类似物，其编码对人类白介素5有特异性的蛋白；其中所述序列可任选地包含限制性位点。
27.权利要求26的分离的核酸序列，其中该序列编码人源化的重链可变区，它包含SEQ ID NO18的核酸序列。
28.权利要求26的分离的核酸序列，其中该序列编码人源化的重链可变区，它包含SEQ ID NO61的核酸序列。
29.权利要求26的分离的核酸序列，其中该序列编码人源化的轻链可变区，它包含SEQ ID NO20的核酸序列。
30.权利要求26的分离的核酸序列，其中该序列编码人源化的轻链可变区，它包含SEQ ID NO69的核酸序列。
31.一种重组质粒，它包含权利要求26的核酸序列。
32.一种宿主细胞，它被权利要求31的重组质粒转染。
33.一种制备对人类白介素5有特异性的改变的抗体的方法，它包括培养用权利要求31的重组质粒转染的细胞系，所述质粒处于选定的调节序列的控制下，该调节序列能够指导质粒在所述细胞中的表达。
34.一种判断人类IL-5在人体中存在与否的方法，它包括从患者得到生物液的样本，使权利要求1的单克隆抗体在可以形成IL-5/单克隆抗体复合物的条件下与该样本接触，检测所述IL-5/单克隆抗体复合物存在与否。
35.一种有助于诊断与嗜曙红细胞过量产生有关的过敏或其他疾病的方法，它包括根据权利要求34的方法确定患者样本中人类IL-5的量，将该量与正常群体中人类IL-5的平均量进行比较，由此，如果患者中人类IL-5的量显著升高，则表明存在与嗜曙红细胞过量产生有关的过敏或其他疾病。
36.一种杂交瘤，它具有细胞系SK119-24G9.8.20.5或5D3(1)F5D6的鉴定特征。
37.一种单克隆抗体，它由权利要求36的杂交瘤产生。
全文摘要
本发明提供得自高亲和性中和单克隆抗体的,嵌合的、人源化的和其他的IL－5单克隆抗体,含有这些单克隆抗体的药物组合物,治疗和诊断方法。
文档编号C07K16/24GK1175263SQ95197701
公开日1998年3月4日 申请日期1995年12月22日 优先权日1994年12月23日
发明者R·S·阿米斯, E·R·阿佩尔鲍姆, I·M·柴肯, R·M·库克, M·S·格罗斯, S·D·霍尔米斯, L·T·麦克米兰, T·W·泰森 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司, 史密丝克莱恩比彻姆有限公司