专利名称：脱髓鞘病或海绵状病的诊断的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物和人脱髓鞘疾病和海绵状脑病的诊断，尤其涉及人BSE以及类似或相关疾病的诊断。
在我们共同申请待审的国际申请WO97/02667中，我们公开了一种新的哺乳动物海绵状脑病和其它脱髓鞘病症的诊断实验。公开于我们在先申请中的上述实验基于一种适用于在人和其他动物中出现的多种形式的病理状况的发生模型。对于牛海绵状疾病，该模型提供了一种对基于形成蛋白感染素的目前理论的替换。简单地说，该新模型基于分子模拟现象，按照该模型，哺乳动物接触某些具有模拟髓磷脂肽序列的细菌后，会产生一种自动免疫反应。在涉及产生自动免疫反应的细菌中，最重要的是不动杆菌种，尤其是乙酸钙不动杆菌。基于这种新模型的该诊断实验开发了早期治疗这类感染的可能性，例如，通过应用一种适当的抗生素防止进一步的自动-免疫攻击动物自身髓磷脂。
在我们的国际申请WO99/47932种，我们已经确证在患多发性硬化(MS)和Creutzfeld-Jacob症(CJD)的患者血清中不动杆菌IgA抗体水平升高。
在我们的在先申请UK 9825948.4中，我们描述了进一步实验，该实验确证在死于BSE的牛血清中存在抗牛髓磷脂和抗牛髓磷脂神经微丝的抗体。这些抗体属于IgA型。在患MS和CJD的患者血清中也得到相似结果。这些结果证实了上述模型的有效性，并可得出这样的结论，即我们发现了在脊椎动物包括人和其它例如家畜饲养场中的家畜中发生或可能发生的相似疾病的起源的通用模型。我们的最近研究结果还提供了早期证实这些疾病，尤其是牛初始BSE的进一步实验基础。这些进一步的实验可以是对基于检测针对不动杆菌种，例如乙酸钙不动杆菌的IgA抗体实验的替代或补充。
本发明因此包括诊断脊椎动物海绵状疾病或脱髓鞘疾病，包括BSE、MS和CJD的方法，其包括分析生物样品中的抗体，尤其是IgA抗体，该抗体结合髓磷脂和/或髓磷脂神经微丝或其抗原(免疫原)部分，包括下文说明的肽成分。
本发明优选包括分析针对脊椎动物例如牛或人类髓磷脂和/或髓磷脂神经微丝的抗体。然而，可以选择使用来自其它物种的、经评价与结合抗体的牛或人类的髓磷脂和髓磷脂神经微丝具有足够同源性的那些髓磷脂和髓磷脂神经微丝。
在实施该方法中，阳性结果表示抗体水平在对照样品的抗体水平之上至少约两个标准偏差。
本发明还包括一种检测脊椎动物海绵状疾病或脱髓鞘疾病的诊断试剂盒，包括例如实验抗原、髓磷脂或髓磷脂神经微丝或其抗原(免疫原)部分。
前面描述方法中使用的实验抗原和诊断试剂盒可以是髓磷脂或髓磷脂神经微丝的肽成分，例如具有序列ID Nos1-8的下列序列之一，即，1.NEALEK2.LKKVHEE3.EALEKQL4.ELEDKQN5.EALEKQL 6.KKVHEE 7.EIRDLR 8.EQEIRDLR上述序列已经从蛋白质信息资源(Protein Information Resource)数据库中提取出来，释放号为44。
由于IgA抗体在免疫反应中的较高特异性，可以得出这样的结论，即不动杆菌感染机制是经机体粘膜途径，原始部位为肠道或鼻腔。可能鼻腔是感染部位，由于吸入由干燥污水或动物粪便形成的携带不动杆菌的灰尘导致。该机制提示有必要改善家畜饲养工作中的卫生状况。实验对前面提到的生物体的分析在前面提到的我们共同申请待审的申请中描述，因此其内容被参考插入本文。用髓磷脂蛋白或神经微丝作为实验抗原进行的类似分析程序如下描述。ELISA实验(1)吸取200ul抗原悬浮液A或B，置于96孔平底硬聚苯乙烯微滴板中在4℃下过夜。(抗原A是牛髓磷脂，来自Sigma Chemical Company，Fancy Road，Poole，Dorset，BH12 4XA，UK，浓度为5ug/ml，抗原B是牛神经微丝，同样来自Sigma，浓度为5ug/ml)。(2)然后用含0.1％(v/v)Tween 20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗3次。(3)向各孔中加入300ul在PBS中的封闭液(0.2％w/v卵清蛋白，0.1％v/v Tween)，然后在37℃保温1小时。(4)然后用PBS.Tween 20冲洗平板三次。(5)取200ul血清样品(实验或对照)用PBS以1/200的比例稀释。加入Tween，然后在37℃保温2小时。(6)然后用PBS.Tween 20冲洗平板三次。(7)取200ul结合兔抗-牛IgA(alpha链)的过氧化物酶用PBS以1/4000的比例稀释。(8)然后用PBS.Tween 20冲洗平板三次。(9)每孔加入200ul 0.5mg/ml(2，2’-连氮双(3-乙基苄-噻唑啉-6-磺酸)的含0.98mM过氧化氢的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH4.1)，在室温下保持20分钟，形成比色分析的颜色。(10)然后用100ul 2mg/ml氟化钠中止反应，用微量-ELISA平板读数仪在波长630nm处测定光密度。(11)所有分析均在编号的情况下进行，以便实验者清楚进行研究的血清的来源(实验或对照)。(12)所有实验进行两次。
上述实验程序可以应用人髓磷脂或髓磷脂神经微丝或来源于它们的肽以同样方式进行。
该分析是诊断患牛海绵状脑病的牛和患MS和CJD的人的新方法，其中描述了一个能够测定牛或人血清中抗两种脑抗原的抗体的实验。任何比健康对照高出2个标准偏差的读数表示为阳性反应。而且，实验对于两种抗原(A)牛髓磷脂蛋白和(B)牛神经微丝将都是阳性的(高2个标准偏差)。
这是描述测定BSE感染牛和患MS和CJD患者中，抗脑抗原的自动抗体的的首次分析。
对于BSE的结果在附
图1和2中显示。
对于MS和CJD的结果在附图3中显示。
在我们的前面提到的国际申请中描述的实验可以与本发明的实验组合起来。该组合实验特别适用于检测BSE的应用。该组合实验也可以被称为“MAN实验”，其基于抗牛髓磷脂(脑白质)和抗牛神经微丝(脑灰质)的自动抗体以及抗腐生细菌乙酸钙不动杆菌的特定抗体的分别测定。
抗牛髓磷脂和牛神经微丝的自动抗体和抗不动杆菌的抗体按照以前描述的方法，针对各实验动物测定。然后按照下列运算法则，通过乘光密度得到MAN指数＝髓磷脂IgA自动抗体x不动杆菌抗体x神经微丝自动抗体，即M×A×N的乘积。
附图4显示了该实验与健康“生物体”对照或患其他疾病的对照(CVL)(CVL＝中心脊椎动物实验室(Central Veterinary Laboratory，UK，从那儿得到患其他疾病的动物血清)比较之后的结果。
MAN实验针对“生物体”大田对照校准，所述对照是来自饲料仅由青草和干草构成的大田动物。MAN实验是一种经验性实验，如果仅实验健康牛，得到非常低的MAN指数值。
当实验怀疑有BSE的牛血清时，当MAN指数比对照值高3个标准偏差时，认定为阳性反应。
权利要求
1.一种诊断脊椎动物海绵状病或脱髓鞘病，包括BSE，MS和CJD的方法，该方法包括分析生物样品中结合髓磷脂和/或髓磷脂神经微丝或结合一种或多种髓磷脂和/或髓磷脂神经微丝的抗原(免疫原)部分的抗体。
2.按照权利要求1的方法，其中抗体是IgA抗体。
3.按照权利要求1或2的方法，其中分析是针对结合脊椎动物髓磷脂和/或髓磷脂神经微丝或其部分的抗体。
4.按照权利要求3的方法，其中脊椎动物是牛或人。
5.按照权利要求4的方法，其中实验抗原是选自具有上文中说明的序列ID Nos.1-8的序列的一种肽。
6.按照权利要求1-5之一的方法，其中阳性结果表示抗体水平比对照样品的抗体水平至少高约两个标准偏差。
7.一种权利要求1-6之一的方法与分析抗不动杆菌种抗体的方法组合的方法。
8.一种检测脊椎动物海绵状病或脱髓鞘病的诊断试剂盒，包括作为实验抗原的髓磷脂和/或髓磷脂神经微丝和/或一种或多种髓磷脂和/或髓磷脂神经微丝的一部分。
9.按照权利要求8的诊断试剂盒，其中实验抗原是一种具有选自上文说明的序列ID Nos.1-8序列的肽。
10.按照权利要求8或9的诊断试剂盒，其中含有作为实验抗原的髓磷脂、髓磷脂神经微丝、和乙酸钙不动杆菌。
全文摘要
一种诊断脊椎动物海绵状病或脱髓鞘病,包括BSE、MS和CJD的方法,该方法包括分析生物样品中结合髓磷脂和/或神经微丝或结合一种或多种其抗原(免疫原)部分的抗体。
文档编号C07K14/435GK1338053SQ9981369
公开日2002年2月27日 申请日期1999年11月25日 优先权日1998年11月26日
发明者艾伦·埃布林格 申请人:伦敦皇家学院