本发明涉及新的基于铱Ir(III)的发光复合物、包含这些复合物作为标记的缀合物和它们在例如基于电化学发光的分析物检测中的应用。
背景技术：
电致化学发光(也称为电化学发光并缩写为ECL)是在电极处产生的物质经历高能电子转移反应以形成发光的激发态的过程。详细的ECL研究最初由Hercules和Bard等人在二十世纪六十年代中期描述。在约40年的研究后，ECL现在已经变成非常有力的分析技术，并在例如免疫测定、食物和水的测试和生物战剂检测领域中广泛使用。对于在有机发光设备(OLED)中使用，大量的化合物似乎令人感兴趣。这些化合物适用于固体材料中或者可溶解在有机流体中。然而，关于例如从生物样品检测分析物所需要的它们在含水介质中的效用，还没有得出结论。一般而言，基于ECL的检测方法是基于使用包含Ru(II+)作为金属离子的水溶性钌复合物。尽管历经过去的几十年作出了显著改进，但是仍非常需要更加灵敏的基于电化学发光的体外诊断测定。现在已经意料不到地发现，某些基于铱Ir(III+)的发光复合物代表用于未来高灵敏性的基于ECL的检测方法的非常有希望的标记。
技术实现要素：
本发明披露了式I的基于铱的化学发光化合物，其中R1-R16为氢、卤素、氰基-或者硝基-、氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵基、取代的烷基铵基、羧基、羧酸酯基、氨基甲酰基、羟基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亚砜基、砜基(sulfodioxide)、膦酸酯基、次膦酸酯基或者R17，其中R17为芳基、取代的芳基、烷基、取代的烷基、支链烷基、取代的支链烷基、芳基烷基、取代的芳基烷基、烷基芳基、取代的烷基芳基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基，其中所述取代基选自氢、卤素、氰基-或者硝基-、亲水基团如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵基、取代的烷基铵基、羧基、羧酸酯基、氨基甲酰基、羟基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亚砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，或者其中在R1-R12中的两个相邻的R或/和在R13-R16中的两个相邻的R可分别形成芳族环或者取代的芳族环，其中所述取代基选自氢、卤素、氰基-或者硝基-、亲水基团如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵基、取代的烷基铵基、羧基、羧酸酯基、氨基甲酰基、羟基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亚砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，或者其中在R1-R12中的两个相邻的R或/和在R13-R16中的两个相邻的R可分别形成脂族环或者取代的脂族环，其中所述取代基选自氢、卤素、氰基-或者硝基-、亲水基团如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵基、取代的烷基铵基、羧基、羧酸酯基、氨基甲酰基、羟基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亚砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，以及其中R13-R16中的至少一个为-Q-Y，其中Q表示衔接物以及Y为官能团。本发明还披露了缀合物，其包含上面的化合物和与其共价结合的亲和结合剂。本发明还涉及本发明披露的化合物或者缀合物在进行水溶液中具体地电化学发光设备或者电化学发光检测系统中的发光测量或者电化学发光反应中的用途。本发明还披露了通过体外方法测量分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供怀疑或者已知包含所述分析物的样品，(b)在适于形成分析物缀合物复合物的条件下，使所述样品与本发明缀合物接触，和(c)测量步骤(b)中形成的复合物并由此得到分析物的测量。具体实施方式本发明涉及式I的基于铱的化学发光化合物，其中R1-R16为氢、卤素、氰基-或者硝基-、氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵基、取代的烷基铵基、羧基、羧酸酯基、氨基甲酰基、羟基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亚砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基或者R17，其中R17为芳基、取代的芳基、烷基、取代的烷基、支链烷基、取代的支链烷基、芳基烷基、取代的芳基烷基、烷基芳基、取代的烷基芳基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基，其中所述取代基选自氢、卤素、氰基-或者硝基-、亲水基团如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵基、取代的烷基铵基、羧基、羧酸酯基、氨基甲酰基、羟基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亚砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，或者，其中在R1-R12中的两个相邻的R或/和在R13-R16中的两个相邻的R可分别形成芳族环或者取代的芳族环，其中所述取代基选自氢、卤素、氰基-或者硝基-、亲水基团如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵基、取代的烷基铵基、羧基、羧酸酯基、氨基甲酰基、羟基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亚砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，或者，其中在R1-R12中的两个相邻的R或/和在R13-R16中的两个相邻的R可分别形成脂族环或者取代的脂族环，其中所述取代基选自氢、卤素、氰基-或者硝基-、亲水基团如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵基、取代的烷基铵基、羧基、羧酸酯基、氨基甲酰基、羟基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亚砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，以及其中R13-R16中的至少一个为-Q-Y，其中Q表示衔接物以及Y为官能团。在一个实施方案中，式I化合物中的R1-R16中的至少一个被至少一个亲水基团取代。在一个实施方案中，取代的烷基氧基的优选的取代基为亚乙基氧基链，所述亚乙基氧基链包含1-40个亚乙基氧基单元，或者包含1-20个亚乙基氧基单元，或者包含1-10个亚乙基氧基单元。优选的亲水基团为氨基、烷基氨基(烷基表示直链如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基链，或者支链烷基链如异丙基、异丁基、叔丁基，优选为直链烷基链如甲基或者乙基)、取代的烷基氨基(这种取代的烷基氨基含有与N原子结合的一个或者两个例如支链或者直链，所述与N原子结合的一个或者两个例如支链或者直链被另外的亲水基团如羟基或者磺基取代，优选地，这种取代的烷基氨基含有两个羟基丙基或者羟基乙基残基)、芳基氨基(芳基是指芳族残基，例如苯基，或者萘基，优选苯基)、取代的芳基氨基(具有如上面定义的芳基和由亲水基团形成的另外的残基)、烷基铵基(烷基如上面所定义，并且烷基铵基优选为三甲基铵残基或者三乙基铵残基)、取代的烷基铵基、羧基、羧酸酯基(优选为烷基酯如甲酯或者乙酯)、氨基甲酰基、羟基、取代的或者未取代的烷基氧基(烷基和取代的烷基如上面所定义)或者芳基氧基或者取代的芳基氧基(芳基和取代的芳基如上面所定义)、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亚砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基。优选地，这种亲水基团选自氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵基、取代的烷基铵基、羧基、羟基、磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亚砜基、砜基和膦酸酯基，在适用的情况下，每个基团优选如上段中所定义。在又一实施方案中，亲水基团选自磺基、磺酰氨基、砜基。在一个实施方案中，式I的基团R1-R12中的至少一个为磺基。在一个实施方案中，包含在式I中的苯基菲啶残基的R1-R12中的至少一个被至少一个亲水基团取代。在一个实施方案中，包含在式I中的苯基菲啶残基选自下面给出的取代的苯基菲啶。在本发明的化合物中，衔接物Q优选具有1-20个原子的主链长度。换句话说，在式I的吡啶环和官能团Y之间的最短连接由1-20个原子组成。在一个实施方案中，在本发明的电化学发光复合物中的衔接物Q为直链或者支链的、饱和或者不饱和的、未取代或者取代的C1-C20烷基链，或者C1-C20芳基烷基链(其中，例如，亚苯基环共计4个碳原子的长度)，或者具有由碳原子和一个或者多个选自O、N和S的杂原子组成的主链的1-20个原子的链，或者具有由碳原子和一个或者多个选自O、N和S的杂原子构成的包含至少一个芳基、杂芳基、取代的芳基或者取代的杂芳基的主链的1-20个原子的链(其中，例如，亚苯基环共计4个原子的长度)。在一个实施方案中，在本发明化合物中的衔接物Q为饱和的C1-C12烷基链，或者C1-C12芳基烷基链，或者具有由碳原子和一个或者多个选自O、N和S的杂原子组成的主链的1-12个原子的链，或者具有由碳原子和一个或者多个选自O、N和S的杂原子构成的包含至少一个芳基、杂芳基、取代的芳基或者取代的杂芳基的主链的1-20个原子的链(其中，例如，亚苯基环共计4个原子的长度)。在一个实施方案中，包含在本发明的基于铱的复合物中的官能团Y选自羧酸基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、氨基、卤素、巯基、马来酰亚氨基、炔基、叠氮基和亚磷酰氨基。缀合物包含本申请在上面披露并定义的式I的基于铱的电化学发光化合物和与其共价结合的生物物质。适合的生物物质的实例为细胞、病毒、亚细胞粒子、蛋白质、脂蛋白类、糖蛋白类、肽类、多肽类、核酸、肽核酸(PNA)、低聚糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、激素类、药理学物质、生物碱、甾类、维生素、氨基酸和糖。在一个实施方案中，本发明缀合物(即，与式I化合物共价结合)的生物物质为亲和结合剂。本领域技术人员应承认的是，在本发明缀合物中，式I化合物的官能团Y用于与亲和结合剂上的基团形成共价键。在亲和结合试剂本身不含与基团Y结合或者反应的适当基团的情况下，可将这种基团通过依靠已经确立的操作容易地引入至亲和结合剂中。不希望被进一步限制，但是为清楚起见，亲和结合剂可包含任何以下物质：抗原、蛋白质、抗体、生物素或者生物素类似物和抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素、糖和凝集素、酶、多肽、氨基、核酸或者核酸类似物和互补核酸、核苷酸、聚核苷酸、肽核酸(PNA)、多糖、金属离子螯合剂、受体激动剂、受体拮抗剂，或者它们的任何组合。例如，亲和结合剂可为特异性结合对的一个配对体，其中所述结合对的其它配对体与细胞表面或者细胞内结构相关或者是细胞表面或者细胞内结构上的靶标。优选地，亲和结合剂为亲和结合对的配对体或者成员，或者也被本领域技术人员称为特异性结合对的配对体或者成员。亲和结合剂与它的靶标(例如，特异性结合对的一个成员，如抗体与特异性结合对的另一成员如它的抗原)具有至少107l/mol的亲和性。亲和结合剂与它的靶标优选具有108l/mol的亲和性或者甚至更优选具有109l/mol的亲和性。在一个实施方案中，本发明涉及缀合物，其中所述亲和结合剂选自抗原、抗体、生物素或者生物素类似物、抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素、糖、凝集素、核酸或者核酸类似物和互补核酸、受体和配体。在一个实施方案中，本发明涉及缀合物，其中所述亲和结合剂选自抗体、生物素或者生物素类似物、抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素，和核酸。在一个实施方案中，本发明的缀合物包含共价连接的本申请在上面披露和定义的式I化合物和亲和结合剂，所述亲和结合剂为低聚核苷酸或者抗体。生物素类似物为氨基生物素、亚氨基生物素或者脱硫生物素。本申请使用的术语"低聚核苷酸"或者“核酸”通常是指包含至少8个核苷酸和至多约1000个核苷酸的短的、通常单链的聚核苷酸。在一个优选实施方案中，低聚核苷酸的长度为至少9、10、11、12、15、18、21、24、27或者30个核苷酸。在一个优选实施方案中，低聚核苷酸的长度为不超过200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35或者30个核苷酸。术语低聚核苷酸应宽泛地理解，并包括DNA和RNA及其类似物和修饰物。核酸类似物可例如含有在标准碱基脱氧腺苷(dA)、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞苷(dC)、脱氧胸苷(dT)、脱氧尿苷(dU)处携带取代基的取代的核苷酸。这种取代的核碱基(nucleobases)的实例为：5-取代的嘧啶如5-甲基dC、氨基烯丙基dU或者dC、5-(氨基乙基-3-丙烯酰亚氨基)-dU、5-丙炔基-dU或者-dC、5-卤化-dU或者-dC；N取代的嘧啶如N4-乙基-dC；N取代的嘌呤如N6-乙基-dA、N2-乙基-dG；8-取代的嘌呤如8-[(6-氨基)-己-1-基]-8-氨基-dG或者-dA、8-卤化dA或者dG、8-烷基dG或者dA；和2-取代的dA如2-氨基dA。核酸类似物可含有核苷酸或者核苷类似物。即，可通过使用核碱基类似物替换天然存在的核碱基，所述核碱基类似物例如5-硝基吲哚d核苷；3硝基吡咯d核苷、脱氧肌苷(dI)、脱氧黄苷(dX)；7-脱氮-dG、-dA、-dI或者-dX；7-脱氮-8-氮杂-dG、-dA、-dI或者-dX；8-氮杂-dA、-dG、-dI或者-dX；d间型霉素(dFormycin)；拟dU；拟异dC；4-硫dT；6-硫dG；2-硫dT；异dG；5-甲基-异-dC；N8-连接的8-氮杂-7-脱氮-dA；5,6-二氢-5-氮杂-dC；和亚乙烯基-dA或者吡咯-dC(pyrollo-dC)。本领域技术人员清楚的是，在互补链中的核碱基不得不以这样的方式选择：使得双链体形成为特异性的。例如，如果在一条链(例如(a))中使用5-甲基-异-dC，那么异dG不得不在互补链(例如(a’))中。在核酸类似物中，低聚核苷酸主链可修饰，以含有取代的糖残基、糖类似物、在核苷间的磷酸酯部分中的修饰，和/或为PNA。低聚核苷酸可例如含有具有取代的脱氧核糖如2’-甲氧基、2’-氟、2’-甲基硒基、2’-烯丙氧基、4’-甲基dN(其中N为核碱基，例如，A、G、C、T或者U)的核苷酸。糖类似物例如为木糖；2’,4’桥接的核糖如(2'-O,4'-C亚甲基)-(被称为LNA的低聚物)或者(2'-O,4'-C亚乙基)-(被称为ENA的低聚物)；L-核糖、L-d-核糖、己糖醇(被称为HNA的低聚物)；环己烯基(被称为CeNA的低聚物)；阿卓糖醇(被称为ANA的低聚物)；三环核糖类似物，其中C3′和C5′原子通过与环丙烷环稠合的亚乙基桥连接(被称为三环DNA的低聚物)；丙三醇(被称为GNA的低聚物)；吡喃葡萄糖(被称为HomoDNA的低聚物)；carbaribose(具有环戊烷代替四氢呋喃亚单元)；羟基甲基-吗啉(被称为吗啉代DNA的低聚物)还已知的是，大量的核苷间磷酸酯部分的修饰不干扰杂化性质，并且这种主链修饰也可与取代的核苷酸或者核苷酸类似物组合。实例为硫代磷酸酯(phosphorthioate)、二硫代磷酸酯(phosphordithioate)、氨基磷酸酯和甲基膦酸酯低聚核苷酸。也可使用PNA(具有不含磷酸酯和d-核糖的主链)作为DNA类似物。在本发明的意义上，可将上述修饰的核苷酸、核苷酸类似物以及低聚核苷酸主链修饰在低聚核苷酸中按希望组合。术语"抗体"在本申请中以最宽的意义使用，并且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双重特异性抗体)，和抗体片段，只要它们呈现希望的生物活性即可。“分离的”抗体是已经鉴别并且从天然环境的组分分离和/或回收的抗体。天然环境的污染物组分是会干扰抗体的研究、诊断或者治疗用途的物质，并且可包括酶、激素类，和其它蛋白质性质或者非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，超过95wt％的抗体，在一些实施方案中，超过99wt％的抗体，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下使用例如考马斯蓝或银染色的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种组分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。“天然抗体”通常为包含两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链的约150,000道尔顿的杂四聚糖蛋白类。每个轻链通过一个共价的二硫键与重链连接，而二硫连接的数目在具有不同的免疫球蛋白同型的重链中不同。每个重链和轻链也具有规则地间隔的链内二硫桥。每个重链在一端具有可变域(VH)，接着是众多恒定域。每个轻链具有在一端的可变域(VL)和在另一端的恒定域；轻链的恒定域对准重链的第一恒定域，并且轻链可变域对准重链的可变域。特定氨基酸残基被认为在轻链和重链可变域之间形成界面。抗体的“可变域”或者“可变区域”是指抗体的重链或者轻链的氨基端区域。可将重链的可变域称为“VH”。可将轻链的可变域称为“VL”。这些区域通常为抗体的最可变部分并含有抗原结合位点。术语“可变”是指以下事实：在抗体中，可变域的某些部分在序列方面严重不同，并且用在每一特定抗体对于它的特定抗原的结合和特异性中。然而，可变性在抗体的整个可变域中不平均分布。在轻链和重链可变域中，它集中在被称为高度可变域(HVR)的三个区段中。将可变域的更加高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含4个通过3个HVR连接的在很大程度上采取β-层构型的FR区，所述3个HVR连接形成环路连接，并且在一些情况中，形成β-层结构的一部分。在每个链中的HVR通过FR区靠近地保持在一起，并且与来自其它链的HVR一起促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NationalInstituteofHealth,Bethesda,MD(1991))。恒定域不直接牵涉在抗体与抗原的结合中，但是呈现多种效应子功能，例如在抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。可将来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”指定为被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种明确不同类型中的一种，这是基于它们的恒定域的氨基酸序列。取决于它们的重链的恒定域的氨基酸序列，可将抗体(免疫球蛋白)指定为不同的种类。具有5种主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG，和IgM，并且这些类别中的数种可进一步分成亚类(同型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型是公知的，并且一般性描述在例如Abbas等人,CellularandMol.Immunology,4thed.,W.B.Saunders,Co.(2000)中。抗体可为较大融合分子的一部分，所述较大融合分子通过抗体与一种或者多种其它蛋白质或者肽类的共价或者非共价缔合形成。术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本申请中可互换使用，表示呈基本完整形式的抗体，而非下面定义的抗体片段。该术语具体表示重链含有Fc区的抗体。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地，包含完整抗体的抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2，和Fv片段；双抗体；直链抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段(每个具有单一抗原结合位点)，和残留“Fc”片段(它的名称反映出它容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理得到具有两个抗原结合位点的F(ab’)2片段并且仍能够交联抗原。“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv物质由紧密的非共价缔合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物质中，一个重链可变域和一个轻链可变域可通过柔性肽衔接物共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链Fv物质中的结构的“二聚”结构缔合。正是以这种构型，才使得每个可变域的3个HVR相互作用，以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。共同地，6个HVR向抗体给予抗原结合特异性。然而，甚至单一可变域(或者对抗原具有特异性的仅包含3个HVR的半个Fv)具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整的结合位点。Fab片段含有重链和轻链可变域，并且也含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。通过在重链CH1域的羧基端添加几个残基(包括一个或者多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)，Fab’片段不同于Fab片段。Fab’-SH是本申请中用于Fab’的符号名称，其中恒定域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初作为Fab’片段的对产生，所述Fab’片段在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。“单链Fv”或者“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL域，其中这些域存在于单一多肽链中。通常，scFv多肽还在VH和VL域之间包含多肽衔接物，所述多肽衔接物使得scFv能够形成抗原结合所希望的结构。为了回顾scFv，参见，例如，Plueckthun,In:ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,Vol.113,Rosenburg和Moore(eds.),Springer-Verlag,NewYork(1994)pp.269-315。术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在相同多肽链(VH-VL)中包含与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用太短以至于不允许在相同链上的两个域之间配对的衔接物，迫使所述域与另一链的互补域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体可为二价的或者双特异性的。双抗体更详细地描述在例如，EP0404097；WO1993/01161；Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等人,PNASUSA90(1993)6444-6448中。三体(triabody)和四体(tetrabody)也描述在Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134中。本申请使用的术语“单克隆抗体”是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各抗体个体是相同的，除了可以以极小量存在的可能的突变如天然存在突变形式外。因此，修饰词“单克隆”表示抗体的特征为不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这种单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中所述靶标结合多肽序列通过以下方法获得：所述方法包括从多个多肽序列选择单一靶标结合多肽序列。例如，选择方法可为从多个克隆如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或者重组DNA克隆的库中选择单一克隆。应理解的是，可将选择的靶标结合序列进一步改变，例如，改善对靶标的亲和性、人源化靶标结合序列、改善它的在细胞培养中的产量、降低它的体内免疫原性、创造多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与多克隆抗体制品(其通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，单克隆抗体制品的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体制品的优势还在于它们通常未被其它免疫球蛋白污染。如上所述，本申请披露的化合物和缀合物具有相当有利的性质。例如，披露的化合物或者缀合物分别显示高ECL效力。如果相应的测量在含水系统中实施，这种高效力也是存在的，相比之下，许多ECL-标记仅在有机溶剂中分析时显示高ECL效力。例如，许多OLED染料通常在乙腈中分析，且在水溶液中不溶，或者如果在水溶液中可溶，预计不显示有效的电化学发光。在一个优选实施方案中，本发明分别涉及本发明中披露的化合物或者缀合物在进行水溶液中的电化学发光反应中的用途。水溶液是包含至少90％水(以重量计)的任何溶液。显然，这种水溶液可含有另外的成分，例如缓冲剂化合物、洗涤剂和作为ECL反应中的电子给体的例如叔胺如三丙基胺。在一个实施方案中，本发明分别涉及本发明中披露的化合物或者缀合物在基于电化学发光的检测方法中的用途。在一个实施方案中，本发明分别涉及本发明中披露的化合物或者缀合物在检测分析物中的用途。本发明的分析物可为任何无机或者有机分子，包括感兴趣的任何生物物质。代表本发明意义上的分析物的适合生物物质的实例为细胞、病毒、亚细胞粒子、蛋白质、脂蛋白类、糖蛋白类、肽类、多肽类、核酸、低聚糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、激素类、药理学物质、生物碱、甾类、维生素、氨基酸和糖。分析物可选自多肽、碳水化合物，和无机或者有机药物分子。多肽或者蛋白质是基本上由氨基酸组成并且具有至少两个通过肽连接键连接的氨基酸的分子。在本申请披露的方法中研究感兴趣的分析物的情况中，多肽优选由至少5、6、7、8、9、10、12、15、20、25和30个至最多约10,000个氨基酸组成。优选地，多肽将含有5-2,000个氨基酸，还优选10-1,000个氨基酸。在分析物为核酸的情况中，这些核酸优选为天然存在的DNA或者RNA低聚核苷酸。在一个实施方案中，本发明涉及通过体外方法测量分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供怀疑或者已知包含所述分析物的样品，(b)在适于形成分析物缀合物复合物的条件下，使所述样品与本发明中披露的亲和结合剂和式I化合物的缀合物接触，(c)步骤(b)中形成的测量复合物并由此得到分析物的测量。在一个实施方案中，在上面的检测分析物的方法中的测量通过使用基于电化学发光的检测操作来实施。还优选的是，所述方法在水溶液中进行。提供以下实施例以帮助理解本发明，本发明的实际范围在所附权利要求中阐述。应理解的是，可对所阐述的操作进行修饰，而不脱离本发明的主旨。实施例1合成取代的苯基菲啶实施例1.1用于合成取代的2-氨基联苯的一般操作：使用在可商购得到的2-溴苯胺衍生物和相应的芳基硼酸之间的由Youn,S.W.在TetrahedronLett.50(2009)4598-4601中描述的Suzuki-Miyaura偶联反应，可合成适当的2-氨基联苯，其为进一步反应成菲啶所需要。典型操作：a:10mol％PdCl2(PPh3)2,K2CO3,DMF/H2O(5/1),80℃,24小时其它实例：实施例1.2用于合成取代的菲啶的一般操作：向2-芳基苯胺1(0.01mol)在氯仿(20ml)中的冰冷却的溶液中添加芳基酰氯2(0.01mol)并在惰性条件下在室温搅拌30分钟。接下来，将所得混合物在搅拌下回流2小时。历时60分钟将反应混合物通过滴加吡啶(0.02mol，在10ml氯仿中)处理。将混合物冷却至室温，并搅拌过夜。将混合物用0.5MHCl充分洗涤，用MgSO4干燥并真空浓缩。将粗产物通过快速色谱法在硅胶上纯化(3:2的己烷/乙酸乙酯)，以66％收率得到纯产物3。将苯甲酰氨基-2-联苯3(0.01mol)和POCl3(5ml)在20ml甲苯中的溶液在氮气下回流并搅拌18小时，遵循Lion,C.在Bull.Soc.Chim.Belg.98(1989)557-566中所述的操作。将冷却的反应混合物用CH2Cl2(30ml)稀释，并倒入冰中，用25％NH4OH和蒸馏水洗涤。将有机层用MgSO4干燥并真空浓缩，然后实施快速色谱法(硅胶,1:1的己烷/乙酸乙酯)，得到产物4,6-苯基菲啶。收率：52％。白色固体。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.54-7.85(m,9H),8.10(d,J＝8.0Hz,1H),8.28(d,J＝7.9Hz,1H),8.62(d,J＝8.4Hz,1H),8.67(d,J＝8.4Hz,1H)。使用2-萘-2-基-苯基胺替代2-芳基-苯胺：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.64(d,J＝9.1Hz,2H),8.29(d,J＝8.1Hz,1H),8.16(d,J＝8.92Hz,1H),7.92(d,J＝7.48Hz,1H),7.79-7.75(m,2H),7.69(t,J＝14.0,8.2Hz,1H),7.63-7.61(m,2H),7.53-7.46(m,4H),7.19(t,J＝14.3,7.2Hz,1H)。MS:[M+H]+306.3使用萘碳酰氯替代苯基酰氯：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.74(d,J＝8.3Hz,1H),8.65(d,J＝8.1Hz,1H),8.27(d,J＝8.1Hz,1H),8.23(s,1H),8.15(d,J＝8.3Hz,1H),8.03(d,J＝8.4Hz,1H),7.97-7.94(m,2H),7.90-7.85(m,2H),7.80-7.69(m,2H),7.62(t,J＝14.2,7.1Hz,1H),7.59-7.55(m,2H)。MS:[M+H]+306.3实施例1.3合成6-(2-磺基苯基)菲啶的操作6-(2-磺基苯基)菲啶可通过以下方法合成：使用Nicolai,E.在Chem.Pharm.Bull.42(1994)1617-1630中所述的操作，将芳基苯胺(0.01mol)与2-磺基苯甲酸环酸酐(0.01mol)在CH3CN中温和加热6小时。在纯化后，可将产物基于实施例1.2中描述的方法转化成适当的菲啶。实施例1.4合成6-苯基-烷基磺酰基菲啶的操作6-苯基-烷基磺酰基菲啶可通过以下方法合成：使用Lion,C.在Bull.Soc.Chim.Belg.98(1989)557-566中所述的操作，将烷基磺酰基-芳基苯胺(0.01mol)与苯甲酰氯(0.01mol)在氯仿中温和加热，参见实施例1.2。在纯化后，可将产物基于实施例1.2中所述的方法转化成适当的菲啶。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.92(d,J＝8.7Hz,1H),8.75(d,J＝1.9Hz,1H),8.68(d,J＝7.0Hz,1H),8.35(dd,J＝8.7,2.0Hz,1H),8.30(d,J＝7.2Hz,1H),7.89(t,J＝15.3,7.1Hz,1H),7.81-7.73(m,3H),7.64-7.56(m,3H)3.12(s,3H)。MS:[M+H]+334,36-(4-甲基磺基苯基)菲啶也可遵循Cymerman,J.在J.Chem.Soc.(1949)703-707中所述的操作制备。实施例1.5合成6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶合成甲苯磺酸2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-醇酯：操作：(JACS,2007,129,13364)向2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-醇(7g,33.6mmol)和三乙胺(4.9ml,35.3mmol)在无水CH2Cl2(100ml)中的溶液中添加4-甲苯磺酰氯(6.7g,35.3mmol)和DMAP(120mg)。将混合物在室温搅拌20小时。将反应混合物先后用80mLHCl(1M)和水洗涤。将萃取液用无水MgSO4干燥，过滤并蒸发滤液。残留物不经进一步纯化就用于后续步骤。收率：11.0g(90％)NMR:1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.75-7.64(m,2H),7.31-7.26(m,2H),4.16-4.06(m,2H),3.62(m2H),3.59-3.40(m,10H),3.30(s,3H),2.38(s,3H)。13C{1H}NMR(101MHz,CDCl3)δ144.75(s),132.90(s),129.77(s),127.8(s),71.82(s),70.60(s),70.48(s),70.47(s),70.41(s),70.39(s),69.23(s),68.55(s),58.90(s),21.53(s)。合成4-PEG4-苯甲酸乙酯：操作：(JACS,2007,129,13364)将化合物2-乙基-4-甲基苯磺酸2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基酯(8.1g,22.3mmol)、4-羟基苯甲酸乙酯(3.7g,22.3mmol)、K2CO3(15.4g,111.5mmol)和18-冠-6(0.59g,2.2mmol)的混合物在丙酮(120ml)中回流22小时。将反应混合物浓缩并用乙酸乙酯萃取。将萃取液用H2O洗涤，用无水MgSO4干燥，并过滤。将滤液蒸发至干，并通过柱色谱法在硅胶(二氯甲烷/甲醇＝100:1)上纯化残留物，得到化合物(1.93g,88％)。收率：7g(88％)NMR:1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.01-7.84(m,2H),6.96-6.85(m,2H),4.29(q,J＝7.1Hz,2H),4.12(dd,J＝5.4,4.3Hz,2H),3.82(dd,J＝5.4,4.2Hz,2H),3.71-3.56(m,10H),3.51-3.45(m,2H),3.32(s,3H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H)。13C{1H}NMR(101MHz,CDCl3)δ166.29(s),162.47(s),131.45(s),123.01(s),114.11(s),71.90(s),70.84(s),70.60(s),70.59(s),70.58(s),70.48(s),69.51(s),67.54(s),60.57(s),58.98(s),14.35(s)。MS(+):[M+Na+]+＝计算值379.1727,实测值379.1743合成4-PEG4-苯甲酸：操作：(JACS,2007,129,13364)将化合物4-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基氧基)苯甲酸乙酯(7g,19.6mmol)和KOH(2.3g,41.24mmol)在200mLEtOH/H2O(1:1v/v)中的混合物回流过夜。在冷却后，将混合物用HCl(2N)中和。将所得混合物用EtOAc萃取并蒸发至干。将所得白色固体在EtOAc/己烷中重结晶。收率：5.3g(85％)NMR:1HNMR(300MHz,CDCl3)δ11.17(s,1H),8.14-7.89(m,2H),7.03-6.75(m,2H),4.29-4.02(m,2H),3.92-3.81(m,2H),3.78-3.57(m,10H),3.57-3.46(m,2H),3.35(s,3H)。13C{1}NMR(75MHz,CDCl3)δ171.46(s),163.24(s),132.30(s),121.98(s),114.33(s),71.96(s),70.91(s),70.67(s),70.66(s),70.64(s),70.54(s),69.55(s),67.66(s),59.08(s)。MS(-):[M-H]-＝计算值327.1438,实测值327.1456合成N-联苯-2-基-4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯甲酰胺:操作：在0℃，向4-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基氧基)苯甲酸(3g,9.14mmol)、0.2mLDMF在30mL无水DCM中的溶液中添加草酰氯(1.05mL,12.34mmol)。将反应混合物在0℃搅拌1小时。将溶液浓缩至干。油状残留物不经进一步纯化就用于后续步骤。在惰性气氛下，将2-苯基苯胺(1.6g)、吡啶(2.4mL)在氯仿(80mL)中的溶液冷却至0℃。将4-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基氧基)苯甲酰氯(3.1g,9.14mmol)缓慢添加至溶液，并使最终混合物达到室温。将溶液回流2小时，并在室温搅拌过夜。将反应混合物用HCl(1M,2x100mL)、NaHCO3(100mL)和水(50mL)萃取。将有机相用MgSO4干燥并通过色谱法在硅胶中纯化(EtOAc/己烷)。收率：4.1(90％)NMR:1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.49(dd,J＝8.3,0.9Hz,1H),7.94(s,1H),7.61-7.35(m,9H),7.33-7.25(m,1H),7.19(m,1H),6.91-6.84(m,2H),4.16-4.10(m,2H),3.85(m,2H),3.77-3.58(m,10H),3.56-3.49(m,2H),3.36(s,3H)。13C{1H}NMR(101MHz,CDCl3)δ164.56(s),161.65(s),138.18(s),135.12(s),132.32(s),129.97(s),129.39(s),129.22(s),128.66(s),128.57(s),128.16(s),127.13(s),124.18(s),121.23(s),114.57(s),71.95(s),70.89(s),70.64(s),70.63(s),70.54(s),69.54(s),67.63(s),59.04(s),53.51(s)。MS(+)[M+H]+＝计算值480.2386,实测值480.2383；[M+Na]+＝计算值502.2200,实测值502.2204合成6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶：操作：将N-联苯-2-基-4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯甲酰胺(4g,8.34mmol)、POCl3(10ml)在10ml甲苯中的溶液回流20小时。将混合物冷却至室温，并添加100ml二氯甲烷。将溶液倒入冰中，并用NH4OH(20％)中和混合物。将有机相相继用蒸馏水和盐水萃取并洗涤，并用MgSO4干燥。将所得溶液通过快速色谱法纯化(硅胶，在1:1的乙酸乙酯/己烷中，Rf＝0.14)。收率：1g(25％)NMR:1HNMR(300MHz,CDCl3)δ8.68(d,J＝8.3Hz,1H),8.59(dd,J＝8.1,1.4Hz,1H),8.23(dd,J＝8.1,1.1Hz,1H),8.15(dd,J＝8.3,0.7Hz,1H),7.84(ddd,J＝8.3,7.1,1.3Hz,1H),7.79-7.57(m,5H),7.15-7.03(m,2H),4.29-4.19(m,2H),3.93-3.90(m,2H),3.80-3.60(m,12H),3.59-3.49(m,2H),3.37(s,3H)。13C{1H}NMR(75MHz,CDCl3)δ160.92(s),159.45(s),143.84(s),133.59(s),131.26(s),130.61(s),130.26(s),129.05(s),128.90(s),127.19(s),126.85(s),125.39(s),123.70(s),122.29(s),122.01(s),114.68(s),72.02(s),70.97(s),70.74(s),70.72(s),70.69,70.62(s),69.80(s),67.68(s),59.15(s)。MS(+)JM358-F5,[M+H]+计算值＝462,2280,实测值462.2275实施例2用于合成氯-交联的二聚体复合物的一般操作：一般操作由Nonoyama,M.,J.Organomet.Chem.86(1975)263-267公开。铱二聚体如下合成：将IrCl3·3H2O和2.5当量的6-苯基菲啶在氮气下在2-乙氧基乙醇/水混合物(3:1,v/v)中在120℃加热18小时。在冷却至室温后，将沉淀物过滤并相继用甲醇和Et2O洗涤，干燥，得到希望的二聚体。实施例2.1具有未取代苯基菲啶的复合物[(6-苯基菲啶)2IrCl]2.收率：71％。棕色固体。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ6.45(d,J＝6.8,4H),6.58(t,J＝7.1,13.9Hz,4H),6.95(t,J＝7.1,14.2Hz,4H),7.56(t,J＝7.4,16.0Hz,4H),7.68(t,J＝8.1,16.2Hz,4H),7.93(t,J＝8.0,14.6Hz,4H),8.07-8.13(m,8H),8.80(d,J＝7.3Hz,4H),8.93-9.01(m,12H)。实施例2.2具有取代的苯基菲啶的复合物将6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶(1g,2.16mmol)、IrCl3·3H2O(346mg,0.98mmol)在16ml2-EtOEtOH:H2O(12:4)中的混合物在氮气气氛下回流过夜。将反应混合物冷却至室温，并添加60ml水，得到油状沉淀物。弃去上清液，并将50ml水添加至残留物。将混合物搅拌1小时，得到红棕色沉淀物。将固体过滤，并用水(50ml)和Et2O(30ml)洗涤。将棕色固体溶解在较小量的二氯甲烷中，并通过添加Et2O沉淀。其不经进一步纯化就用于后续步骤。收率：550mg(50％)NMR:1HNMR(300MHz,CDCl3)δ8.74(d,J＝8.1Hz,4H),8.36(dd,J＝8.0,5.2Hz,8H),7.90(dd,J＝14.7,7.7Hz,8H),7.81(d,J＝9.0Hz,4H),7.79-7.67(m,4H),6.78-6.65(m,4H),6.32(dd,J＝8.8,2.5Hz,4H),5.89-5.83(m,4H),5.28(d,J＝2.5Hz,4H),3.67-3.10(m,100H,PEG链,含有一些杂质)MS(ESI-MS(+)):[M+2Na+]2+计算值1171.3463,实测值1171.3473；[(C^N)2Ir]+＝计算值1113.3877,实测值1113.3892实施例3A)合成羧基亚烷基氧基-吡啶-2-甲酸衍生物：将3-羟基-2-吡啶羧酸(0.01mol)、4-溴丁酸乙酯或者6-溴己酸乙酯(0.021mol)的混合物，和碳酸钾(5当量)在DMF(20ml)中的混合物在氮气下在90℃加热20小时。在冷却后，将反应混合物倒入冰-水混合物中，并用二氯甲烷(30ml)萃取三次，用无水MgSO4干燥，过滤并将溶剂蒸干。通过快速色谱法纯化(硅胶,3:1的己烷/乙酸乙酯)，得到产物(基于专利US5,219,847)。将形成的酯通过NaOH在MeOH(pH＝10)中水解。然后将溶液的pH调节至6.0，并在室温搅拌过夜。真空除去溶剂，并将残留物从己烷/丙酮结晶，得到希望的产物。3-(羧基-戊基氧基)-吡啶-2-羧酸。收率：51％。灰色固体。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.39-1.45(m,2H),1.51-1.57(m,2H),1.67-1.74(m,2H),2.19-2.23(m,2H),4.04-4.07(m,2H),7.47-7.50(m,1H),7.61(d,J＝8.1Hz,1H),8.13(d,J＝8.1Hz,1H)。B)合成5-[4-(2-羧基-乙基)-苯基]-吡啶-2-羧酸在氩气气氛下，向4ml1,2-二甲氧基乙烷中添加5-溴-吡啶-2-羧酸(93mg,0.46mmol)、4-(2-羧基乙基)苯硼酸(106mg,0.55mmol)、0.51ml2M碳酸钠水溶液和二(三苯基膦)二氯化钯(II)(20mg,0.03mmol)。将混合物在90℃搅拌过夜，冷却并用水萃取。添加乙酸乙酯，并将混合物用1M盐酸调节至pH＝2。在用乙酸乙酯三倍萃取后，将合并的有机层用硫酸镁干燥，过滤，并真空蒸发。将残留物通过硅胶色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇5:1)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.00(d,J＝2Hz,1H),8.25(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),8.11(d,J＝8.1Hz,1H),7.74(d,J＝8.2Hz,2H),7.41(d,J＝8.2Hz,2H),2.91(t,J＝15,7.5Hz,2H),2.61(t,J＝15.1,7.6Hz,2H)。MS：[M+H]+272.3实施例4用于合成铱复合物的一般操作将0.5mmol氯交联二聚体复合物、1.25mmol吡啶-2-甲酸酯(picolinate)和3mmolNa2CO3混合至2-乙氧基乙醇(12ml)中，并在120℃加热15小时。向冷却的混合物中添加蒸馏水(25ml)，然后将粗产物滤出并用水洗涤，然后用数份正己烷和Et2O洗涤。将产物通过柱色谱法纯化(硅胶,正己烷/二氯甲烷)，得到红色粉末。(基于Lamansky,S.,Inorg.Chem.40(2001)1704-1711)Ir(6-苯基菲啶)2吡啶-2-羧酸：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.17(d,J＝7.8Hz,1H),9.09(d,J＝8.2Hz,1H),8.71(d,J＝8.2Hz,1H),8.62(t,J＝14.8,7.8Hz,2H),8.43-8.33(m,4H),8.23(d,J＝8.1Hz,1H),7.92-7.77(m,4H),7.65(t,J＝15,7.9Hz,2H),7.57-7.46(m,3H),7.36(t,J＝14.8,7.8Hz,1H),7.19-7.16(m,2H),7.10(d,J＝7.8Hz,1H),7.04(t,J＝14.2,6.8Hz,1H),6.92(t,J＝14.1,6.7Hz,1H),6.80(t,J＝13.7,6.8Hz,1H),6.67(t,J＝13.7,6.6Hz,1H),6.51(d,J＝6.8Hz,1H)。MS：[M+H]+826.4Ir(6-苯基菲啶)25-(甲氧基)吡啶-2-羧酸：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.15(d,J＝8.2Hz,1H),9.09(d,J＝8.2Hz,1H),8.70(d,J＝7.8Hz,1H),8.61(d,J＝8.2Hz,2H),8.44-8.35(m,3H),8.21(d,J＝8.0Hz,1H),7.97(d,J＝2.7,1H),7.91-7.86(m,2H),7.82-7.80(m,2H),7.68(d,J＝8.6Hz,1H),7.57-7.53(m,3H),7.36(t,J＝15.2,7.2Hz,1H),7.14(t,J＝15.1,7.6Hz,1H),7.08-6.93(m,4H),6.78(t,J＝14.9,7.6Hz,1H),6.65(t,J＝14.8,7.6Hz,1H),6.49(d,J＝7.6Hz,1H),3.63(s,3H)。MS：[M+H]+854.2Ir(6-苯基菲啶)24-(羟基甲基)吡啶-2-羧酸：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.14(d,J＝8.1Hz,2H),8.96(d,J＝8.0Hz,1H),8.87(d,J＝7.7Hz,1H),8.73(d,J＝7.7Hz,1H),8,68(d,J＝7.8Hz,1H),8.51(d,J＝8.6Hz,1H),8.37(d,J＝8.2Hz,1H),8.26-8.24(m,2H),8.10(t,J＝14.7,7.3Hz,1H),8.02-7.96(m,3H),7.68(d,J＝8.4Hz,1H),7.62(t,J＝15.2,7.1Hz,1H),7.53-7.48(m,2H),7.39-7.37(m,2H),7.16(t,J＝15.3,7.2Hz,1H),7.10-7.04(m,2H),6.86(d,J＝6.8Hz,1H),6.78(t,J＝14.2,7.1Hz,1H),6.67(t,J＝14.9,7.3Hz,1H),6.35(d,J＝6.8Hz,1H),5.32(s,1H),4.33(s,2H)。MS：[M+H]+854.2Ir(6-苯基菲啶)23-羟基吡啶-2-羧酸：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.15(d,J＝8.3Hz,1H),9.06(d,J＝8.2Hz,1H),8.65-8.57(m,3H),8.46-8.41(m,2H),8.34(d,J＝8.0Hz,1H),8.21(d,J＝8.0Hz,1H),7.94-7.78(m,5H),7.72(d,J＝7.8Hz,1H),7.58-7.55(m,2H),7.40(t,J＝14.0,7.0Hz,1H),7.15(t,J＝15.2,7.0Hz,1H),7.05-6,95(m,5H),6.77(t,J＝13.7,7.0Hz,1H),6.66(t,J＝13.6,6.4Hz,1H),6.50(d,J＝6.6Hz,1H)。MS：[M+H]+839.2Ir(6-苯基-苯并菲啶)2吡啶-2-羧酸：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.04(m,4H),8.82(m,2H),8.77-8.70(m,1H),8.41(d,J＝8.0Hz,1H),8.29-8.27(m,2H),8.15-8.09(m,4H),7.85(d,J＝8.3Hz,1H),7.78-7.71(m,4H),7.65(d,J＝7.7Hz,1H),7.62-7.553(m,2H),7.45-7.40(m,2H),7.23-7.17(m,1H),7.13-7.05(m,3H),7.05-7.00(m,1H),6.83(dd,J＝10.8,4.0Hz,1H),6.68(dd,J＝10.9,3.8Hz,1H),6.51(dd,J＝7.6,0.9Hz,1H)。MS：[M+H]+924.2Ir(6-苯基菲啶)22-(羧基乙基-苯基)吡啶-2-羧酸：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.24(m,1H),9.15(d,J＝8.0Hz,1H),8.97(d,J＝8.4Hz,1H),8.88(d,J＝8.1Hz,1H),8.73(d,J＝7.6Hz,1H),8.68(d,J＝7.4Hz,1H),8.50(d,J＝7.8Hz,1H),8.45(d,J＝7.9Hz,1H),8.34(d,J＝2.0Hz,1H),8.28(d,J＝7.9Hz,1H),8.13-8.00(m,4H),7.92(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),7.63(t,J＝15.2,7.0Hz,2H),7.54-7.42(m,3H),7.35(d,J＝8.2Hz,2H),7.17(t,J＝15.2,7.0Hz,1H),7.10-7.06(m,3H),7.02(t,J＝15.7,7.3Hz,1H),6.89(d,J＝6.7Hz,1H),6.77(t,J＝14.0,7.1Hz,1H),6.71(t,J＝14.8,7.0Hz,1H),6.45(d,J＝6.7Hz,1H),2.86(t,J＝15.2,7.5Hz,2H),2.55(t,J＝15.4,7.7Hz,2H)。MS：[M+H]+972.3合成JM360：JM360将Ir二聚体(150mg,0,065mmol)、吡啶-2-甲酸(17mg,0.137mmol)和Na2CO3(70mg,0.65mmol)在20mL二氯甲烷/乙醇(4:1)中的混悬液回流过夜。在冷却后，将混合物浓缩至干。将残留物通过快速色谱法在二氯甲烷/MeOH中纯化(梯度为100:0-10:1)。将化合物在二氯甲烷/Et2O中重结晶。收率：30％。NMR：1HNMR(300MHz,CDCl3)δ9.06(d,J＝8.2Hz,1H),8.98(d,J＝8.1Hz,1H),8.61(m,3H),8.46-8.21(m,4H),8.13(d,J＝8.9Hz,1H),7.83(m,4H),7.61(m,2H),7.57-7.41(m,3H),7.30(d,J＝7.2Hz,1H),7.24-7.12(m,1H),6.89(t,J＝7.2Hz,1H),6.76(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.61(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),6.54(d,J＝2.5Hz,1H),5.99(d,J＝2.6Hz,1H),3.85-3.41(m,32H),3.34(s,3H),3.33(s,3H)。MS：[2M+2Na]2+计算值1258.4012,实测值1258.4030.[M+H]+计算值1236.4197,实测值1236.4227实施例5使用新的铱复合物的ECL在分析仪(RocheDiagnosticsGmbH)中评价数种金属复合物的电化学发光信号。测量在不存在抗生蛋白链菌素包衣的顺磁性微粒的情况下相似地进行。将0.1mg/mlDMSO的每一金属复合物的储备溶液用PBS缓冲剂稀释，得到10nM溶液。将10nM溶液作为样品在分析仪上处理。将20μl样品与90μl试剂1(ProCell)和90μl试剂2(ProCell)一起在37℃孵育9分钟，并随后量化电化学发光信号。ECL结果：参照Ru(bpy)3＝10000计数，以10nmolar浓度-JM360＝31258计数，以10nmolar浓度-RC72＝45512计数，以10nmolar浓度RC72实施例6合成具有用于生物缀合的反应性基团的铱复合物将Ir(6-苯基菲啶)22-(羧基乙基-苯基)吡啶-2-羧酸(15mg)溶解在5mL无水乙腈和0.01mL无水吡啶的混合物中。添加碳酸二琥珀酰亚氨基酯(DSC)(1.5当量)，并将混合物在氮气下在室温搅拌过夜。将溶液添加至氯仿(10mL)，用0.5MHCl(1x2mL)、饱和NaHCO3水溶液(1x2mL)和水(2x5mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩，得到红色粉末状物。Ir(6-苯基菲啶)22-(羧基乙基-苯基)吡啶-2-羧酸N-琥珀酰亚氨基酯：1H-NMR(400MHz,CD3CN)δ9.25(m,1H),9.17(d,J＝8.0Hz,1H),8.83(d,J＝8.4Hz,1H),8.75-8.68(m,1H),8.60-8.54(m,3H),8.47(d,J＝8.1Hz,1H),8.43(d,J＝2.1Hz,1H),8.30(d,J＝8.1Hz,1H),8.06(t,J＝15.4,7.2Hz,1H),7.97-7.95(m,3H),7.77-7.70(m,2H),7,61(t,J＝15.2,7.0Hz,1H),7.52-7.44(m,3H),7.36(d,J＝8.3Hz,2H),7.18(t,J＝15.2,7.0Hz,1H),7.12-7.09(m,3H),7.04-6.98(m,2H),6.78(t,J＝14.9,7.2Hz,1H),6.71(t,J＝14.8,7.5Hz,1H),6.57(d,J＝7.6Hz,1H),3,07-3,01(m,4H),2,80(s,4H)。MS：[M+H]+1069.3实施例7合成具有生物素的铱复合物缀合物将Ir(6-苯基菲啶)22-(羧基乙基-苯基)吡啶-2-羧酸NHS酯(12mg)和4mgN-生物素基-3,6-二氧杂辛烷-1,8-二胺三氟乙酸盐溶解在5mL无水DMF中。添加吡啶(0.016mL，在2mLDMF中)，并将混合物在氮气下在室温搅拌过夜。将溶液添加至氯仿(10mL)，用0.5MHCl(1x2mL)、饱和NaHCO3水溶液(1x2mL)和水(2x5mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩，得到红色粉末状物。将产物通过柱色谱法纯化(硅胶,正己烷/乙酸乙酯)，得到红色粉末状物。MS：[M+H]+1328.6。