一种那曲肝素钙的生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种那曲肝素钙的生产方法，使用肝素钠为原料，在特定的工艺参数下通过降解、还原、乙醇沉淀﹑离子交换树脂转钙﹑氧化﹑过滤沉淀脱水得到那曲肝素钙。氧化﹑除菌过滤﹑沉淀脱水实现了“一锅煮”的工艺，在操作上实现了简化，此方法相比已公开的方法从肝素钠制备那曲肝素钙工艺步骤更短，操作上更简便，转钙更彻底，收率更高。
【专利说明】一种那曲肝素钙的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，特别是一种那曲肝素钙的生产方法。
【背景技术】
[0002]肝素钠(Heparin Sodium)是粘多糖硫酸酯类抗凝血药。肝素钠是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。在体内外均具有抗凝血作用，是目前主流的抗凝血药品。但是普通肝素的生物利用度低，副作用大，后来人们发现肝素钠裂解获取的硫酸氨基葡聚糖片段的钠盐，平均分子量为4000~6000道尔顿，称为低分子肝素钠。低分子肝素钠注射液和肝素钠注射液一样属于抗凝血酶III (AT III)依赖性凝血酶抑制剂。但与肝素钠注射液相比，具有半衰期较长、抗血栓效果好、出血倾向较弱、给药方便，但价格比较贵。普通的肝素产品都是钠盐型，与钙盐型相比，后者更具有皮下注射时局部血肿现象减少和疼痛状况明显改善等优点，故目前肝素产品更倾向于制成钙盐型。那曲肝素钙具有预防和治疗静脉血栓栓塞性疾病，特别是预防普通外科手术或骨科手术的血栓栓塞性疾病，同时在血液透析中预防体外循环中的血凝块形成。
[0003]目前已有4篇专利公开了一种那曲肝素钙的制备工艺，目前均处在实质审查阶段。专利CN103204958A公开了一种低乙醇残留的那曲肝素钙的生产工艺，此专利着重讲述了在制备那曲肝素钙后，怎样用乙醇进行沉淀和脱水，得到乙醇含量< 0.5 %的那曲肝素钙。但是从专利对于怎样从肝素钠制备出那曲肝素钙的过程没有进行详细描述。专利CN103275246A以肝素钠粗品为原料，经木瓜蛋白酶、核糖核酸酶II酶解，提纯得到肝素钠精品，将其加入到冰醋酸缓冲溶液中，在一定温度和酸性条件下与亚硝酸盐反应，再经还原、紫外照射、氧化、钙置换得到那曲肝素钙粗品，将其经纳滤、超滤精制后，进行冻干处理，得到那曲肝素钙精品。专利CN103382232A通过将肝素钠原料在醋酸的酸性条件下用亚硝酸钠还原、硼氢化钠还原、乙醇重结晶得到低分子肝素钠、氯化钙转钙，乙醇重结晶、交换柱层析、洗拓液乙醇沉淀、过滤冻干得到那曲肝素钙。专利CN103408676A通过将肝素钠原料溶解在纯化水中，在一定温度和PH值条件下，加入亚硝酸钠进行降解，硼氢化钠还原，乙醇沉淀得到低分子肝素钠，此低分子肝素钠再经过双氧水氧化、过滤器过滤、阴离子交换柱洗拓、洗拓液再用乙醇沉淀，沉淀物再用双氧水氧化、氧化反应液再用乙醇沉淀得到那曲肝素钙粗品，此那曲肝素钙粗品依次用1000D超滤膜超滤和除菌过滤后得到那曲肝素钙精品。专利CN103204958A主要侧重是制备那曲肝素钙后如何通过乙醇洗脱得到低乙醇参量的那曲肝素钙，并没有详细阐明如何从肝素钠制备那曲肝素钙的工艺，和本文所要阐述的工艺过程不相同。专利CN103275246A、专利CN103382232A和专利103408676A均通过传统的降解还原方法得到低分子肝素钠，其中专利CN103275246A在得到那曲肝素钙后需要经过纳滤、超滤精制、冻干处理得到那曲肝素钙精品，专利CN103382232A将转钙和交换柱层析分开进行，增加了操作上的繁琐，同时那曲肝素钙也是经过冻干得到精品，增加了仪器设备的需求，专利103408676A经过两次过氧化氢氧化、两次过滤、阴离子交换柱转钙、1000D超滤膜超滤、冻干得到那曲肝素钙精品，同样工艺复杂，操作上繁复，需要冻干机设备。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是在现有技术的基础上，使用肝素钠为原料，通过降解、还原、乙醇沉淀、离子交换树脂转钙、氧化、过滤沉淀脱水得到那曲肝素钙。此方法相比已公开的方法从肝素钠制备那曲肝素钙工艺步骤更短，操作上更简便，转钙更彻底，收率更高，克服了目前生产那曲肝素钙存在的工艺路线较长，操作繁琐，依赖冻干机的问题。
[0005]本发明的目的可以通过以下措施达到:一种制备那曲肝素钙的工艺，其包括如下步骤:
[0006](I)低分子肝素钠的制备
[0007]取肝素钠加入纯化水溶解，调节溶液pH为2.7±0.1，加入亚硝酸钠，保持温度在25±2°C搅拌3-4h，得到降解液，再调节降解液pH至9.5-10.0，加入硼氢化钠搅拌≥15h，盐酸调节溶液pH至3.5±0.1搅拌20min。氢氧化钠调节溶液pH为7.3-7.5，254nm紫外灯光照射降解液20-25min，加入乙醇沉淀静置8h以上弃去上清液，测试样品分子量及分布。
[0008](2)阴离子树脂转钙
[0009]将上述湿固体加入纯化水溶解，再加入阴离子交换树脂吸附,吸附时间兰6h,配制与树脂同体积的氯化钙溶液加入树脂中洗涤，同条件洗涤2次，每搅拌Ih后排出，30min浙干洗涤液，合并洗拓液在15-20°C下搅拌5-10min，加入乙醇再搅拌5_10min，沉淀静置8h以上弃去上清液，检测沉淀物钙离子含量。
[0010]⑶氧化反应
[0011]将上述沉淀物用纯化水溶解，加入氯化钙固体，氢氧化钙溶液调节pH至10.8-11.0，30±2°C下加入过氧化氢氧化，维持pH在10.5-11.0氧化4h，用盐酸调节pH为
6.0-6.5。
[0012](4)过滤、沉淀和脱水
[0013]将0.45um及0.2um除菌过滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，滤液用2.0倍的乙醇沉淀，静置8h以上，真空抽去上清液，加入乙醇脱水，搅拌使之松散成细颗粒状，静置> Ih,真空抽去上清液，相同的操作重复四次，沉淀物离心脱水，真空干燥箱60-65°C干燥50-56h得到那曲肝素钙。
[0014]在步骤(1)中肝素钠和纯化水投料比(W/V)为1.0:8.5-10，优选为1.0:9.2-9.5。肝素钠和亚硝酸钠的投料比(W/W)为100:2.0-3.0，优选为100:2.5-3.0。亚硝酸钠和硼氢化钠的投料比(W/W)为1.0:0.3-0.5，优选为1.0:0.35-0.42。亚硝酸钠反应时体系温度维持在25±2°C，4mol/L盐酸调节pH为2.7±0.1，5mol/L氢氧化钠调节溶液pH至9.0-10.5。254nm紫外灯置于降解后的溶液中进行灭菌，加入溶液体积和乙醇体积(V/V)为
1.0:0.8-1.2，优选0.9-1.1来沉淀，测试样品分子量及分布。
[0015]在步骤(2)中低分子肝素钠粗品沉淀物和纯化水投料比(W/V)为1.0:8.5-10，优选为1.0:9.2-9.5。肝素钠和阴离子交换树脂投料比(W/V)为1.0:4.5-5.5，优选为1.0:
4.5-5.0。氯化钙的浓度为0.lmol/L吸附，同条件洗涤2次，每搅拌Ih后排出，30min浙干洗涤液，合并洗拓液15-20°C搅拌5-10min，加入乙醇再搅拌5_10min，沉淀静置8h以上弃去上清液。洗拓液和沉淀乙醇的投料比(V/V)为1.0:1.0-2.5，优选为1.0:1.5-2.0，检测沉淀物钙离子含量。
[0016]在步骤(3)中肝素钠和纯化水投料比(W/V)为1.0:3.5-5.5，优选为1.0:
4.0-5.0。溶液体积和氯化钙的投料比(W/V)为100:0.8-2.0，优选为100:1.5-2.0。调节溶液PH的氢氧化钙为饱和溶液。30%的过氧化氢进行氧化，溶液总体积和过氧化氢投料比(V/V)为 100:0.8-1.5，优选为 100:1.2-1.5。
[0017]在步骤(4)中用纯化水冲洗0.45um滤膜和0.2um滤膜至中性，将0.45um及0.2um的除菌过滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，用2.0倍滤液体积的乙醇来沉淀滤液，用来脱水的乙醇和沉淀的乙醇投料比(V/V)为0.3-0.5:1.0，优选为0.4-0.45:1.0。
[0018]本发明是针对现有的那曲肝素钙生产工艺进行优化和改进。使用肝素钠为原料，先通过降解、还原、乙醇沉淀得到低分子肝素钠粗品，低分子肝素钠粗品通过阴离子交换树脂吸附，然后用氯化钙溶液洗拓，经过两次洗拓，钙离子含量可以达到10%左右符合要求。乙醇沉淀洗拓液，沉淀物加入纯化水溶解，过氧化氢氧化、滤液除菌过滤、沉淀、干燥得到那曲肝素钙。氧化、除菌过滤、沉淀脱水实现了“一锅煮”的工艺，在操作上实现了简化，节省了时间和人力成本，该工艺在现有的技术基础上开发出了一条新的制备那曲肝素钙的方法，且在本公司实现了那曲肝素钙的工业化生产。
【具体实施方式】
[0019]为了使本【技术领域】的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0020]实施例1
[0021]加入45L纯化水和肝素钠5kg至降解罐内，搅拌使其完全溶解，用4mol/L盐酸调节罐内溶液pH为2.7，称取0.135kg亚硝酸钠加入烧杯中，向烧杯中加入1350mL纯化水，搅拌溶解后，加入降解罐内，维持罐内溶液pH在2.7±0.1，25±2°C下搅拌反应3.6h。用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH值为9.6,加入0.054kg硼氢化钠至降解罐内，搅拌反应18h,再用4mol/L盐酸调节溶液pH为3.5，搅拌20min，再用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH至7.3，用254nm的紫外灯照射降解液20min，溶液体积为48L，所以将48L乙醇倒入降解罐内，15-20°C搅拌5-10min，停止搅拌静置10h，弃去上清液，测试样品分子量及分布:分子量 4295 (应 3600-4500)，<2000 部分为 14.9 % (应兰 25.0 % )，2000-8000 部分为 76.5 %(应 65.0-85.0% ), 2000-4000 部分为 42.3% (应 35.0-55.0 % )。
[0022]加入45L纯化水和25L阴离子交换树脂至上述有沉淀物的罐内，搅拌3 6h，使树脂吸附充分，将0.2775kg氯化钙溶解在25L纯化水中得到0.1 %氯化钙溶液加入树脂中搅拌Ih后排出，再将0.2775kg氯化钙溶解在25L纯化水中得到0.1 %氯化钙溶液加入树脂中搅拌Ih后排出，合并两次的排出液并30min浙干洗涤液，洗涤液共30L，15_20°C搅拌5-10min,加入45L乙醇再搅拌5_10min，沉淀静置8h以上弃去上清液，检测沉淀物钙离子含量为 10.7% (应 9.5% -11.5% )。
[0023]将上述沉淀物用20L纯化水溶解，加入0.375kg氯化钙固体，搅拌使氯化钙完全溶解，氢氧化钙饱和溶液调节PH至10.8-11.0，溶液总体积为25L，30±2°C下加入0.25L30%过氧化氢氧化，维持体系pH在10.5-11.0,氧化反应4h,再用4mol/L盐酸调节pH为6.3。
[0024] 用纯化水冲洗0.45um滤膜和0.2um滤膜至中性，将0.45um及0.2um的除菌过滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，滤液总体积25L，加入50L乙醇搅拌10-15min沉淀静置10h，真空抽去上清液，加入20L乙醇脱水，搅拌使之松散成细颗粒状静置> lh，真空抽去上清液，相同的操作重复四次，沉淀物离心脱水，真空干燥箱60-65°C干燥50-56h得到那曲肝素钙3.918kg。
[0025]实施例2
[0026]加入42.5L纯化水和肝素钠5kg至降解罐内，搅拌使其完全溶解,用4mol/L盐酸调节罐内溶液pH为2.6，称取0.1Okg亚硝酸钠加入烧杯中，向烧杯中加入100mL纯化水，搅拌溶解后，加入降解罐内，维持罐内溶液pH在2.7±0.1，25±2°C下搅拌反应3.4h。用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH为9.5，加入0.03kg硼氢化钠至降解罐内，搅拌反应17h，再用4mol/L盐酸调节溶液pH为3.4，搅拌20min，再用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH至7.4，用254nm的紫外灯照射降解液20min，溶液体积为44.8L，所以将44.8L乙醇倒入降解罐内，15-20°C搅拌5-10min，停止搅拌静置10h，弃去上清液，测试样品分子量及分布:分子量 4312(应 3600-4500)，〈2000 部分为 14.4% (应兰 25.0% )，2000-8000 部分为 76.4%(应 65.0-85.0% ), 2000-4000 部分为 42.5% (应 35.0-55.0 % )。
[0027]加入42.5L纯化水和22.5L阴离子交换树脂至上述有沉淀物的罐内，搅拌3 6h，使树脂吸附充分，将0.2498kg氯化钙溶解在22.5L纯化水中得到0.1 %氯化钙溶液加入树脂中搅拌Ih后排出，再将0.2498kg氯化钙溶解在22.5L纯化水中得到0.1 %氯化钙溶液加入树脂中搅拌Ih后排出，合并两次的排出液并30min浙干洗涤液，洗涤液共27L，15_20°C搅拌5-10min，加入27L乙醇再搅拌5_10min，沉淀静置8h以上弃去上清液，检测沉淀物钙离子含量为 10.5% (应 9.5% -11.5% )。
[0028]将上述沉淀物用17.5L纯化水溶解，加入0.216kg氯化钙固体，搅拌使氯化钙完全溶解，氢氧化钙饱和溶液调节PH至10.8-11.0,溶液总体积为21.85L，30±2°C下加入
0.175L30%过氧化氢氧化，维持pH在10.5-11.0，氧化反应4h，再用4mol/L盐酸调节pH为
6.0。
[0029]用纯化水冲洗0.45um滤膜和0.2um滤膜至中性，将0.45um及0.2um的除菌过滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，滤液总体积21.85L，加入43.7L乙醇搅拌10-15min沉淀静置12h，真空抽去上清液，加入13.1lL乙醇脱水，搅拌使之松散成细颗粒状静置> Ih,真空抽去上清液，相同的操作重复四次，沉淀物离心脱水，真空干燥箱60-65°C干燥50-56h得到那曲肝素钙3.901kg。
[0030]实施例3
[0031]加入50L纯化水和肝素钠5kg至降解罐内，搅拌使其完全溶解，用4mol/L盐酸调节罐内溶液pH为2.8，称取0.15kg亚硝酸钠加入烧杯中，向烧杯中加入1500mL纯化水，搅拌溶解后，加入降解罐内，维持罐内溶液pH在2.7 ± 0.1，25 ± 2°C下搅拌反应3_4h。用5moI/L氢氧化钠溶液调节体系pH值为10.5，加入0.075kg硼氢化钠至降解罐内，搅拌反应16h，再用4mol/L盐酸调节溶液pH为3.6，搅拌20min，再用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH为
7.5，用254nm的紫外灯照射降解液20min，溶液体积为53.6L，所以将53.6L乙醇倒入降解罐内，15-20°C下搅拌5-10min，停止搅拌静置10h，弃去上清液，测试样品分子量及分布:分子量 4378(应 3600-4500)，〈2000 部分为 14.2% (应兰 25.0% )，2000-8000 部分为 76.4%(应 65.0-85.0% )，2000-4000 部分为 42.4% (应 35.0-55.0% )。
[0032]加入55L纯化水和27.5L阴离子交换树脂至上述有沉淀物的罐内，搅拌3 6h，使树脂吸附充分，将0.3053kg氯化钙溶解在27.5L纯化水中得到0.1 %氯化钙溶液加入树脂中搅拌Ih后排出，再将0.3053kg氯化钙溶解在27.5L纯化水中得到0.1 %氯化钙溶液加入树脂中搅拌Ih后排出，合并两次的排出液并30min浙干洗涤液，洗涤液共33L，15_20°C搅拌5-10min，加入49.5L乙醇再搅拌5_10min，沉淀静置8h以上弃去上清液，检测沉淀物钙离子含量为10.8% (应9.5% -11.5% )。
[0033]将上述沉淀物用27.5L纯化水溶解，加入0.66kg氯化钙固体，搅拌使氯化钙完全溶解，氢氧化钙饱和溶液调节PH为10.8-11.0，30 ±2 °C，溶液总体积为34.38L，30±2°C下加入0.52L30%过氧化氢氧化，维持pH在10.5-11.0，氧化反应4h，再用4mol/L盐酸调节pH 在 6.5。
[0034]用纯化水冲洗0.45um滤膜和0.2um滤膜至中性，将0.45um及0.2um的除菌过滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，滤液总体积34.38L，加入68.76L乙醇搅拌10-15min沉淀静置10h，真空抽去上清液，加入34.38L乙醇脱水，搅拌使之松散成细颗粒状静置> lh，真空抽去上清液，相同的操作重复四次，沉淀物离心脱水，真空干燥箱60-65°C干燥50-56h得到那曲肝素钙3.873kg。
[0035]对比例I
[0036]按专利CN103408676A中实施例1中的技术方案制备那曲肝素钙，即:将3Kg肝素钠加入15L~24L纯净水搅拌溶解后，用盐酸调节溶液的pH = 2~3，再加入60g亚硝酸钠后，在10~30°C下搅拌反应2~5h后在2~10°C下静置20~24h ;在制得的降解液中用氢氧化钠溶液调节溶液的pH = 9~11后,加入18g硼氢化钠还原10~16h,反应完毕后用氢氧化钠调节溶液的pH = 6.5~7.0后得到还原液；在还原液中加入95%体积浓度的乙醇进行沉淀后收集沉淀物；在收集的沉淀物中加入纯净水搅拌溶解后，加入0.2%~1.0%质量浓度的双氧水在25~35°C下氧化10~24h后加入95%体积浓度的乙醇沉淀，收集沉底物；在收集的沉淀物中加入纯净水搅拌溶解后用0.45um的过滤器过滤，再将滤液用离子交换柱进行吸附后用洗脱液洗脱，再将收集的洗脱液加入95%体积浓度的乙醇沉淀后，收集沉淀物；在收集的沉淀物中加入纯净水搅拌溶解后，加入0.2%~1.0%质量浓度的双氧水在25~35°C下氧化，氧化10~24h后加入95%体积浓度的乙醇进行沉淀，收集沉淀物得到达肝素钠粗品；将收集的那曲肝素钙粗品依次用1000D的超滤膜超滤和除菌处理后得到那曲肝素钙精品；将那曲肝素钙精品在_45°C下冻干后得到那曲肝素钙精品2250克。
[0037]试验例I
[0038]按欧洲药典EP7.0对实施例1-3提供的那曲肝素钙成品进行质量标准检测，将各指标检测结果记录在表1，同时为了与现有技术进行更好比对，也一并测试了对比例I中指的那曲肝素钙的相关指标。
[0039]
【权利要求】
1.一种那曲肝素钙的生产方法，其特征在于包括如下步骤: (1)肝素钠溶解在纯化水中调节溶液PH至2.7±0.1，加入亚硝酸钠25±2°C条件下搅拌3-4h，得到降解液，再调节降解液pH至9.5-10.0加入硼氢化钠搅拌> 15h，调节溶液pH至3.5±0.1搅拌20min，然后调节溶液pH至7.3-7.5，紫外灯照射溶液20_25min，乙醇沉淀，测试沉淀物分子量及分布； (2)将上述沉淀物加入纯化水溶解、再加入阴离子交换树脂吸附，配制与树脂同体积的氯化钙溶液加入树脂中洗涤，同条件洗涤2次，30min浙干洗涤液，合并洗拓液在15-20°C下搅拌5-10min，加入乙醇再搅拌5_10min，沉淀静置> 8h，检测沉淀物钙离子含量; (3)将上述沉淀物用纯化水溶解，加入氯化钙固体，氢氧化钙溶液调节pH至10.8-11.0，30±2°C下加入过氧化氢氧化，维持pH在10.5-11.0氧化4h，用盐酸调节pH至6.0-6.5 ； (4)将0.45um及0.2um除菌过滤膜串联，将反应液通过该串联的过滤膜过滤，滤液用2.0倍的乙醇沉淀，静置> 8h，真空抽去上清液，加入乙醇脱水搅拌使之松散成细颗粒状静置> lh，真空抽去上清液，相同的操作重复四次，离心脱水真空干燥得到那曲肝素钙。
2.根据权利要求1所述的那曲肝素钙的生产方法，其特征在于步骤(1)中肝素钠和纯化水投料比(W/V)为1.0:8.5-10，肝素钠和亚硝酸钠的投料比(W/W)为100:2.0-3.0，亚硝酸钠和硼氢化钠的投料比(W/W)为1.0:0.3-0.5，亚硝酸钠反应时体系温度维持在25 ± 2°C，4mol/L 盐酸调节 ρΗ2.7 ± 0.1，5mol/L 氢氧化钠调节溶液 pH 至 9.0-10.5，254nm 紫外灯置于降解后的溶液中 进行灭菌，乙醇沉淀时，加入溶液体积和乙醇体积(V/V)为1.0:0.8_1.2 ο
3.根据权利要求1所述的那曲肝素钙的生产方法，其特征在于步骤(2)中肝素钠和纯化水投料比(W/ν)为1.0:8.5-10，肝素钠和阴离子交换树脂投料比(W/V)为1.0:4.5-5.5，氯化钙的浓度为0.lmol/L,同条件洗涤2次，每搅拌Ih后排出，30min浙干洗涤液，合并洗拓液15-20°C搅拌5-10min，加入乙醇再搅拌5_10min，沉淀静置8h以上弃去上清液，洗拓液和沉淀乙醇的投料比(V/V)为1.0:1.0-2.5。
4.根据权利要求1所述的那曲肝素钙的生产方法，其特征在于步骤(3)中肝素钠和纯化水投料比(W/V)为1.0:3.5-5.5，溶液体积和氯化钙的投料比(W/V)为100:0.8-2.0，调节溶液PH的氢氧化钙为饱和溶液，溶液总体积和过氧化氢投料比(V/V)为100:0.8-1.5，所用的过氧化氢浓度为30 %。
5.根据权利要求1所述的那曲肝素钙的生产方法，其特征在于步骤(4)中用纯化水冲洗0.45um滤膜和0.2um滤膜至中性，将0.45um及0.2um的除菌过滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，用滤液体积2.0倍体积的乙醇来沉淀滤液，用来脱水的乙醇和沉淀的乙醇投料比(V/V)为0.3-0.5:1.0。
【文档编号】C08B37/10GK104072639SQ201410340558
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】唐咏群, 黄锡伟, 段艳冰, 娄媛媛, 刘玉辉 申请人:南京健友生化制药股份有限公司