一种大鼠角膜内皮细胞的分离、纯化及培养方法与流程

本发明涉及一种大鼠的角膜内皮细胞的分离、纯化及培养的方法，属于细胞生物学领域。

背景技术：

角膜内皮细胞形态学上的完整和功能上的健全是临床上评价角膜功能的指标，也是角膜保存质量评定的标准。而各种角膜疾病、外科损伤以及药物毒性等都会导致角膜内皮细胞受损，当损伤超过其生理代偿时，就会发生角膜病变，严重时会导致角膜盲。为此，观察药物以及其他一些因素对角膜内皮细胞活性的影响都离不开角膜内皮细胞的体外实验，而良好的体外角膜内皮细胞分离与培养方法则是体外实验的第一步，其对于角膜的药理学、病理学以及角膜移植的研究具有重要的意义。

来源于人的角膜组织少，而且其角膜内皮细胞的分裂增殖能力低，只有在胚胎时期具有一定的增殖能力。动物实验证明，猴和兔角膜内皮细胞在体外只有有限的分裂增殖能力，而鼠的角膜内皮细胞在外伤刺激或体外培养的条件下都具有良好的增殖能力。为此，大鼠的眼球是一个用于体外培养角膜内皮细胞的重要组织来源。

目前，角膜内皮细胞的体外原代培养包括：组织块贴壁法、酶消化法(胰酶、胶原酶和dispase酶)、显微解剖法等，但是显微解剖法操作复杂；酶消化法需要严格控制酶消化时间以及酶浓度，以防止酶对细胞的损伤，而组织贴壁法则细胞迁出和生长速率较慢。而组织分离细胞培养过程中，经常会出现基质 细胞污染的问题。为此，如何能通过较为简单的方法获得数量多、活性好且纯度高的角膜内皮细胞，一直是进行基础研究和临床研究亟待解决的重要问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种获得数量多、活性好且纯度高的大鼠角膜内皮细胞分离、纯化以及培养方法。

本发明提供的大鼠角膜内皮细胞分离、纯化以及培养方法，它包括如下步骤：

a、角膜组织样本的分离：大鼠麻醉消毒状态下，先取出大鼠眼球，剥离角膜，再用消毒刀片剪碎角膜，最后用消化酶处理角膜组织，得到单个细胞。

其中，所述大鼠眼球是来自于4周龄的雄性SD大鼠，体重质量为150±25g；

所述剥离角膜是沿角膜缘外1mm处环形剪取全层角膜；

所述的消化酶处理角膜组织，具体方法为：用37℃预热的0.25％(m/v)的dispase酶消化30-40min，然后加入0.05-0.1％(m/v)的胰酶和0.1％(m/v)的胶原酶I消化5-10min，加完全培养基终止消化，反复吹打消化液，100目筛孔过滤，收集滤液。滤液通过1500rpm离心5min，弃去上清，然后加入DMEM/F12完全培养基，重新悬浮细胞沉淀，收集角膜消化后单个细胞的细胞液。

b、角膜内皮细胞的纯化：制备特异性吸附角膜内皮细胞的免疫磁珠，特异性免疫磁珠对步骤a中单个细胞的细胞液进行纯化。

其中，所述的制备特异性免疫磁珠，具体方法为：将山羊抗兔的免疫磁珠在DMEM/F12基础培养基中清洗3次，然后在单克隆PECAM-1抗体中4℃过夜孵育，然后在DMEM/F12完全培养基中清洗3次，最后重悬浮在DMEM/F12完全培养基中；

所述的角膜内皮细胞纯化，具体方法为：将制备好的免疫磁珠加入到步骤a单个细胞的细胞液中，4℃旋转轻摇孵育30-60min，然后用DMEM/F12完全培养基中清洗免疫磁珠2-4次，通过流式细胞仪技术检测细胞的纯度，最后将其加入DMEM/F12完全培养基中培养增殖。

c、细胞培养基优化：制备大鼠角膜内皮细胞裂解液，添加碱性成纤维细胞生长因子，配置的大鼠角膜内皮细胞的完全培养基。

其中，所述的大鼠角膜内皮细胞裂解液的制备，具体方法为：将步骤b中纯化后的大鼠角膜内皮细胞在DMEM/F12完全培养基中培养，并传代，当细胞数量达到培养瓶面积的80％时，将细胞用胰酶消化下来，并通过反复冻融法获得细胞裂解液，最后通过BCA法获得裂解液的蛋白浓度。

其中，所述大鼠角膜内皮细胞完全培养基每升含有如下成分：10-100mg细胞裂解液、1-7.5mg碱性成纤维细胞生长因子、100mg胎牛血清、其余为DMEM/F12基础培养基。

更进一步的，所述大鼠角膜内皮细胞完全培养基每升含有如下成分：80mg细胞裂解液、5.5mg碱性成纤维细胞生长因子、100mg胎牛血清、其余为DMEM/F12基础培养基。

本发明的亮点和有益效果：

1.本发明通过简单的将角膜组织剪碎，然后通过酶消化获得角膜内皮细胞，该方法操作简单，而且可以获得大量并且具有良好活性的角膜内皮细胞。

2.本发明制备的特异性免疫磁珠，能很好的特异性吸附角膜内皮细胞，纯化率达到90％以上。

3.本发明提供了一种角膜内皮细胞培养基，可以促进细胞的大量增殖，大大缩短了细胞的培养时间。

附图说明

图1为磁珠分选后获得的大鼠角膜内皮细胞有无添加流式抗体的流式细胞对照图；其中A为未加流式抗体的流式细胞图；B为磁珠分选后获得的细胞，加入流式抗体后的流式细胞图；

图2为大鼠角膜内皮细胞在不同成分细胞培养基中24h后的细胞生长形态；其中A为DMEM/F12完全培养基培养24h后的细胞图(×100)；B为添加bFGF因子的DMEM/F12完全培养基培养24h后的细胞图(×100)；C为添加细胞裂解液的DMEM/F12完全培养基培养24h后的细胞图(×100)；D为添加bFGF因子与细胞裂解液的DMEM/F12完全培养基培养24h后的细胞图(×100)；

图3为大鼠角膜内皮细胞在添加bFGF因子与细胞裂解液的DMEM/F12完全培养基培养4d后的细胞图(×400)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的内容进一步具体的阐述说明，但以下实施例仅是阐述性的，不用于限制本发明的范围。

本发明以4周左右的SD大鼠，雄性，体重质量在150±25g为对象，获得角膜内皮细胞的组织来源。具体操作如下：

步骤一、剥离大鼠角膜组织，并获得单个细胞

给大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，以75％(v/v)的乙醇消毒，立即在无菌条件下以弯镊子取出大鼠的眼球，在含细胞培养工作浓度的青霉素(100U/ml)-链霉素(100μg/ml)的无菌生理盐水中去除多余组织，并清洗数次，然后置于 净化工作台中，将眼球移入无菌平皿中，在沿角膜缘外1mm处环形剪取全层角膜，在37℃温育的磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4，10mM)中漂洗3次。

用消毒刀片尽可能的将角膜切碎，充分混合均匀，用消化酶进行消化，具体方法为：用37℃预热的0.25％(m/v)的dispase酶消化30-40min，然后加入含0.05-0.1％(m/v)胰酶和0.1％(m/v)胶原酶I的混合消化液消化5-10min，加完全培养基终止消化，反复吹打消化液，100目筛孔过滤，收集滤液。上述三种方法获得的滤液均可通过1500rpm离心5min，弃去上清，然后加入DMEM/F12完全培养基(含有10％胎牛血清的DMEM/F12基础培养基)重新悬浮细胞沉淀。

步骤二、特异性免疫磁珠从分离的单个细胞中纯化角膜内皮细胞

特异性免疫磁珠的制备：将购买的山羊抗兔的免疫磁珠在无血清的DMEM/F12中清洗3次，然后在单克隆PECAM-1抗体中4℃过夜孵育，然后在DMEM/F12完全培养基中清洗3次，最后重悬浮在DMEM/F12完全培养基中。

角膜内皮细胞纯化：将制备好的免疫磁珠加入到步骤(a)中通过消化酶消化后在DMEM/12完全培养基中重悬浮的细胞液中，4℃旋转轻摇孵育30-60min，然后DMEM/F12完全培养基清洗免疫磁珠2-4次，通过流式细胞仪技术检测细胞的纯度，最后将其加入完全培养基中，置于37℃、5％(v/v)的CO₂饱和湿度的培养箱中培养增殖。

流式细胞仪检测消化酶消化后获得的角膜内皮细胞的纯度：(1)将细胞收集到15ml的离心管中，1500rpm离心5min，弃悬液；(2)用PBS洗涤细胞，1500rpm离心5min；(3)加入-20℃预冷的甲醇，吹打均匀；(4)用PBS洗涤细胞，1500rpm离心5min；(5)用200μl稀释单克隆PECAM-1抗体重悬细胞，37℃避光孵育1h；(6)用PBS洗涤细胞2次，1500rpm离心5min；(7)用400μl PBS重悬细胞，上机检测。

如图1所示：通过磁珠分选角膜内皮细胞纯化率达到90％以上。

步骤三、优化的细胞培养液，培养大鼠角膜内皮细胞

大鼠角膜内皮细胞裂解液的制备：通过纯化后的大鼠角膜内皮细胞在含有2ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM/F12完全培养基中培养，待细胞达到80％以上的融合度时，以1∶2的量传代，传数代以后，当细胞数量达到培养瓶面积的80％时，将细胞用胰酶消化下来，加入含有10％的胎牛血清培养基终止消化，然后1500rpm离心5min去上清，加入DMEM/F12基础培养基轻轻吹打细胞沉淀，使细胞悬浮，再1500rpm离心5min去上清，以上述同样的悬浮、离心方法重复3次以除去其中的胎牛血清成分，最后加入足量的基础培养基DMEM/F12重悬角膜内皮细胞，将其放置在-80℃中冷冻10-20min，然后迅速放置37℃的环境中解冻，如此重复3次以使大鼠角膜内皮细胞充分裂解，以0.22μm滤器过滤去除裂解液中的细胞碎片，此为大鼠角膜内皮细胞裂解液，留取0.5mL样本用BCA试剂盒检测蛋白含量。

大鼠角膜内皮细胞培养基优化：将生长至80％融合度的第3代大鼠角膜内皮细胞，用胰酶消化，加入DMEM/F12完全培养基终止消化，1000r/min离心5min，制成2×10⁴cells/mL的细胞悬液，按500μL/孔接种24孔板中，培养24h后弃掉培养液，用PBS冲洗数次，分别加入以下4种不同的培养基中：

(1)不添加任何添加物的DMEM/F12完全培养基中；

(2)含有2-15ng/ml bFGF的DMEM/F12完全培养基中；

(3)含有大鼠角膜内皮细胞裂解液蛋白10-100μg/ml的DMEM/F12完全培养基中；

(4)含有细胞裂解液蛋白10-100μg/ml和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)1-7.5ng/ml的DMEM/F12完全培养基中。

每种培养液设6个孔，每空500μL的细胞液，继续培养24h后在显微镜下观察细胞生长形态。继续培养细胞，并观察细胞生长状况。

如图2所示：在含有细胞裂解液蛋白10-100μg/ml与bFGF 1-7.5ng/ml的DMEM/F12完全培养基中细胞增殖明显高于其他组细胞，而且细胞的形态都非常良好。

如图3所示：角膜内皮细胞在含有细胞裂解液蛋白10-100μg/ml与bFGF 1-7.5ng/ml的DMEM/F12完全培养基中培养4d后，细胞基本铺满培养皿。