关于联邦资助的研究或开发的声明本发明在国立卫生研究院授予的合作协议下，在授予号dk040949和dk074176下以政府支持进行。美国政府对本发明可具有一定的权利。发明背景本发明涉及显示增强的药学性质的多肽激素类似物，所述增强的药学性质例如热力学稳定性增加、对高于室温的热纤维化的抗性增强、促有丝分裂性降低和/或药代动力学和药效学性质改变，即，相对于(a)类似于对应的膳食或野生型人激素的可溶性制剂的速效组分和(b)类似于野生型胰岛素或胰岛素类似物的微晶nph制剂的长效组分，赋予双相性作用时程。更特别地，本发明涉及由单一多肽链组成的胰岛素类似物，其(i)包含一类新的在a和b结构域之间缩短连接的(c)结构域，其中第一和第二位置为酸性残基；(ii)包含位置a8的氨基酸置换；和(iii)包含位置a14的酸性残基。长度6-11个残基的该类型的c结构域由类似于野生型前胰岛素的n-末端酸性元件和c-末端区段碱性元件组成。本发明的单链胰岛素类似物可任选地包含在a或b结构域的其它位点的标准或非标准氨基酸置换，例如本领域已知赋予速效作用的位置b28和b29。非标准蛋白质，包括治疗剂和疫苗的工程改造，可具有广泛的医学和社会益处。天然存在的蛋白质—如通常在人类、其它哺乳动物、脊椎生物、无脊椎生物或真核细胞的基因组中所编码的—经常赋予多种生物学活性。非标准蛋白质的益处将实现选择性活性，例如与无意和不利的副作用(例如促进癌细胞的生长)有关的同源细胞受体的结合降低。社会益处的又一实例将是对室温或高于室温的降解的抗性增强，促进运输、分配和使用。治疗性蛋白质的实例提供为胰岛素。野生型人胰岛素和其它哺乳动物的基因组中编码的胰岛素分子结合在多种器官和各种类型的细胞中的胰岛素受体，不管由可选的rna剪接模式或由可选的翻译后糖基化模式产生的受体同种型如何。野生型胰岛素还以较低的亲和力结合同源的1型胰岛素-样生长因子受体(igf-1r)。其它医学益处的实例将是可溶性制剂的药代动力学性质的优化，使得胰岛素作用时程具有两个阶段，快速阶段和延迟阶段(图1)。快速和延迟阶段的这样的组合在本领域已知由锌胰岛素类似物六聚体的溶液(如通过但不限于赖脯胰岛素和门冬胰岛素提供)与所述类似物的微晶混悬液(与锌离子和鱼精蛋白或鱼精蛋白相关的碱性肽组合制备)的混合物赋予；后一组分在本领域被称为neutralprotaminehagedorn(nph)微晶混悬液。本领域已知的预混合胰岛素产品包含各种比率的这两种组分，例如25％可溶相和75％微晶相、30％可溶相和70％微晶相、或50％的各相。由于这样的预混合产品易于使用，相对于单独给予膳食(速效)胰岛素制剂(或膳食胰岛素类似物制剂)和野生型胰岛素或胰岛素类似物的nph微晶混悬液，每天皮下注射次数减少，因此它们广泛用于发展中国家的糖尿病患者。由预混合双相性胰岛素产品提供的胰岛素的胰岛素方案的简化还已证明了对以下患者的益处：富裕人社会的糖尿病患者，(i)对于他们而言，单独通过膳食胰岛素类似物制剂治疗导致亚最佳的糖血控制或过度体重增加；(ii)对于他们而言，单独通过nph胰岛素产品或基础胰岛素类似物制剂治疗导致亚最佳的糖血控制，这是由于在餐后3小时内血糖浓度向上偏移导致；或(iii)上述两种类型的患者，对于他们而言，加入口服药(例如二甲双胍)不导致令人满意的糖血控制。由于发酵后和纯化后步骤需要生长nph微-结晶，现有的双相性胰岛素产品需要复杂和昂贵的生产方法。此外，这样的产品经受可溶性和微晶组分二者对高于室温的物理和化学降解的内在敏感性。由于在可溶相和微晶相之间胰岛素分子的互换，这些预混合产品的双相性药代动力学性质可随小管在高于室温下的贮存而变化。最后，因为抽吸入注射器的微-结晶的数量可随不同抽吸而(即使来自同一小管)变化，使用微晶混悬液可能伴有剂量的不确定性。根据目前的双相性胰岛素产品的上述缺点，双相性胰岛素制剂的治疗性和社会益处会通过工程改造胰岛素类似物来提高，所述胰岛素类似物作为单一组分可溶性溶液的药代动力学性质赋予双相性模式的胰岛素作用。如果该新型的可溶性胰岛素类似物制备较简单和成本较低(即，避免对于微-结晶的需要)和/或如果该新型的可溶性胰岛素类似物比野生型胰岛素更耐受在室温下或高于室温的化学或物理降解，会获得另外的益处。所述耐受高于室温的降解将预期促进在发展中国家地区(其中不能持续获得电力和冷藏)中使用。这样的降解造成的挑战通过非洲和亚洲的即将发生的糖尿病大流行被加深。因为纤维化造成在高于室温的降解主要途径，抵抗纤维化的制剂的设计可提高在这样的受到挑战的地区中胰岛素替换疗法的安全性和功效。如果可溶性双相性胰岛素类似物应在经开发以监测胰岛素-刺激的人癌细胞系增殖的测定法中显示促有丝分裂性降低，会获得再另外的治疗性和社会益处。很久以前就已将给予胰岛素确立为用于糖尿病的治疗。在糖尿病患者中常规胰岛素替换疗法的主要目的是紧密控制血糖浓度以防止其高于或低于健康人受试者特有的正常范围的偏移。低于正常范围的偏移伴随有直接肾上腺素能症状或神经性低血糖症状(neuroglycopenicsymptoms)，其在严重发作时其导致惊厥、昏迷和死亡。高于正常范围的偏移伴随有微血管疾病的长期风险增加，包括视网膜病变、失明和肾衰竭。胰岛素是一种小的球状蛋白质，其在脊椎动物的新陈代谢中起重要作用。胰岛素包含两条链，包含21个残基的a链和包含30个残基的b链。该激素在胰腺β-细胞中作为zn2+-稳定的六聚体贮存，但在血流中作为无zn2+-单体发挥作用。胰岛素是单链前体前胰岛素的产物，在该前胰岛素中连接区域(35个残基)连接b链的c-末端残基(残基b30)与a链的n-末端残基。各种证据表明，其由胰岛素-样的核心和杂乱的连接肽组成。认为三个特定的二硫桥(a6–a11、a7–b7和a20–b19)的形成与前胰岛素在粗糙内质网(er)中的氧化折叠有关。前胰岛素在从er输出至高尔基体后不久装配形成可溶性zn2+-配位的六聚体。内部蛋白水解消化和转化为胰岛素在未成熟的分泌颗粒中发生，接着形态学浓缩。在成熟贮藏颗粒中晶状排列的锌胰岛素六聚体已通过电子显微术(em)可视化。每个残基通过氨基酸的身份(通常使用标准三字母代码)、链和序列位置(通常作为上标)指明。本发明涉及长度6-11个残基的新型缩短的c结构域的发明，其包含n-末端酸性基序和c-末端碱性基序，替换了人前胰岛素特有的36-残基野生型c结构域；和与a链的位置a8和a14，和任选地b链的位置b28和b29的氨基酸置换组合。纤维化，其为一种在用于治疗糖尿病的胰岛素和胰岛素类似物的生产、储存和使用中的严重顾虑，随更高温度、更低ph、搅动或存在脲、胍、乙醇共溶剂或疏水表面而增强。当前的美国药物条例要求如果发生1％或更高水平的纤维化，则胰岛素被丢弃。因为纤维化在较高温度下增强，糖尿病患者最好在使用前必须保持胰岛素冷藏。胰岛素显示在高于25℃的温度下每10℃增量，降解速率增加10倍或更高；因此，指导方针要求在<30℃的温度下贮存和优选地冷藏。现有的双相性胰岛素产品的nph微晶组分对高于室温的纤维化，以及由于a链内的蛋白水解裂解导致的不同的化学降解模式敏感；这样的裂解使胰岛素或胰岛素类似物失活。在nph微-结晶中胰岛素a链的上述裂解代表了一个涉及化学键断裂的过程。这样的断裂可导致胰岛素分子内的原子丢失或重排或在不同的胰岛素分子之间化学键的形成，导致形成聚合物。尽管认为在nph微-结晶中a链的裂解在折叠状态的表面上发生，但在蛋白质的未折叠状态下或以部分未折叠形式的蛋白质，介导化学键的其它变化，并且增加其热力学稳定性的这样的胰岛素修饰也有可能延迟或阻止化学降解。因此，胰岛素类似物的一种合乎需要的性质为，其变性自由能(如通常通过在螺旋-敏感性波长下作为化学变性剂的浓度的函数通过圆二色性所测量)应该等于或大于野生型胰岛素的变性自由能，或等于或大于当前临床使用的膳食(速效)胰岛素类似物的变性自由能。胰岛素还对物理降解敏感。蛋白质纤维化的当前理论假定纤维化机制通过部分折叠的中间状态进行，其进而聚集以形成淀粉状蛋白发生核心。在该理论中，可能的是，稳定天然状态的氨基酸置换可能或不可能稳定部分折叠的中间状态，和可能或不可能增加(或降低)在天然状态和中间状态之间的自由能屏障。因此，当前理论表明，在两条链的胰岛素分子中给定氨基酸置换增加或降低纤维化风险的趋势是高度不可预测的。胰岛素分子的结构模型构思了几乎完全展开三个α-螺旋(如天然状态中所见到的)，以及平行排列的β-片形成连续堆积的b链和连续堆积的a链；各链之间和a链内的天然二硫键配对得到保持。这样的平行交叉-β片需要a链的n-末端和b链的c-末端之间的显著分离在胰岛素单体的天然状态下末端通常靠近具有缩短的c-结构域的单链胰岛素类似物显著抵抗纤维化是本领域已知的，和其被认为反映了在胰岛素原细丝中的平行交叉-β片的伸展结构和具有天然二硫键配对的单链胰岛素类似物的结构之间的拓扑学不相容性，其中缩短的c-结构域迫使在a链的n-末端和b链的c-末端之间的距离不利于原细丝。单链胰岛素类似物的带状模型显示于图2；胰岛素部分的空间填充模型显示于图3，突出了工程改造的连接结构域(c结构域；图3中的棍状表示)的作用。本发明受医学和社会需要的启发，工程改造了预期用于每天两次注射(即，按照类似于当前预混合常规-nph双相性胰岛素产品的时间表)的中性ph的可溶性和单相制剂中双相性单链胰岛素类似物。我们的单链设计预期组合(i)抵抗降解与(ii)显著的体内低血糖功效与(iii)与igf-1r交叉结合降低和(iv)在不存在由微晶混悬液组成的组分情况下内在的双相性药代动力学和药效学。因此，将需要的是，发明单链胰岛素类似物，其在中性ph下作为可溶性蛋白质溶液，在皮下注射时显示双相性药代动力学和药效学性质，使得实现快速开始作用和作用结束延长(prolongedtailofaction)两者，导致类似于预混合产品例如“mix75/25”或“30”的总体特征。因此，本发明的双相性胰岛素类似物制剂会提供简化的基于一天两次推注的方案，这在发达国家和发展中国家将具有临床优点。单链双相性胰岛素类似物制剂也可在不受二甲双胍(一种广泛用于治疗t2dm的一线口服药)充分控制的未用过胰岛素的患者中引入。当前常规nph预混合产品基于两种组分的药代动力学性质的双相性作用机制，以图示形式显示于图4a。尽管不希望受理论的约束，本发明类推的双相性药代动力学的可能机制以图示形式显示于图4b。我们展望本发明的产品将不相称地使西方社会的患者获益，所述西方社会的患者与较复杂的方案的相容性是不确定的。本领域已知健康护理结果—以及对慢性疾病例如t2dm和代谢综合征的处方方案的长期坚持—是社会经济状态、正式教育、家庭结构和文化信念体系的一项复杂功能。事实上，鉴于在缺乏代表性的少数人中，包括非洲裔美国人、西班牙人裔美国人和本土美国人，越来越多的肥胖症和t2dm负担，这些社会问题日益受到关注。因此预期本发明的单链双相性胰岛素类似物制剂使需要胰岛素的t1dm和t2dm患者获益，所述患者用仅基础胰岛素的疗法具有不充足的糖血控制，但对其而言，完全基础推注的方案是不实际的。发明概述因此，本发明的一个方面提供单链胰岛素类似物，在皮下注射时其提供双相性药代动力学和药效学性质。本发明的类似物包含在位置b10的组氨酸，因此回避了关于与该位置的酸性置换(天冬氨酸或谷氨酸)有关的致癌物的顾虑。本发明的另一方面是，相对于野生型人胰岛素，单链胰岛素类似物对ir-a和ir-b的绝对体外亲和力在范围5-100％内，因此不可能在激素-受体复合物中显示延长的停留时间。上述特征组合由新型的c-结构域设计赋予，其中缩短的连接多肽(长度6-11个残基)包含n-末端酸性元件(残基c1和c2)、柔性连接或铰链(c3和c4)，和包含一对类似于天然前胰岛素中见到的那些的碱性残基的c-末端区段(c5和c6)。对于c-结构域长度，选择上限11，其低于描述于具有提高的igf-1r结合活性的嵌合胰岛素类似物中的12个残基igf-i衍生的接头(kristensen,c.等1995)。选择下限4，以保持连接结构域的n-末端部分的酸性基序(例如但不限于glu-glu)和连接结构域的c-末端部分的碱性基序(例如但不限于arg-arg)。尽管不希望受理论的约束，我们设想在所述类似物结合igf-1r时，两个-残基的酸性残基引入不利的静电斥，但被胰岛素受体同种型充分耐受。也不希望受理论的约束，我们进一步设想，c-末端碱性基序有助于部分皮下聚集，而不是仅仅的系链或空间元件(tetherorspaceelement)。总体而言，本发明提供单链胰岛素类似物，其包含本发明的c-结构域和包含位置a8和a14的置换的修饰的a链。本发明因此涉及一类新的单链胰岛素类似物，其中连接结构域(c结构域)具有长度4-11和由两个元件组成。n-末端元件由前两个残基组成(称为c1和c2，对应于延伸的胰岛素b链的残基b31-b32)，其中c1和c2包含至少一个酸性侧链和在ph7.4时-1或-2的净形式静电荷。c-末端元件包含两个碱性残基，例如arg-arg、lys-lys、arg-lys或lys-arg。对于4个残基的连接结构域，本发明的序列会因此包括但不限于glu-glu-arg-arg、glu-ala-arg-arg、ala-glu-arg-arg、asp-glu-arg-arg、glu-glu-lys-arg、glu-glu-arg-lys和glu-glu-lys-lys。在长度大于4(即，范围5-11)的连接结构域的情况下在n-和c-末端元件之间，连接结构域包含柔性连接。在6个残基的连接结构域的实例中，这样的序列可包含位置c3和c4的gly-pro、ser-pro、ala、pro、gly-ser、ser-ser、gly-gly或ala-ala，但本发明的范围不限于这些可能性。a链包含在a8的碱性置换(赖氨酸、精氨酸或组氨酸)和在a21的置换(gly、ala或ser)，以避免酸-催化的脱酰胺作用或其它asn-相关的化学降解模式。在一个实例中，b链还包含置换lysb29→arg，以避免在酵母中进行生物合成的过程中lys-特异性的蛋白水解裂解。本发明的类似物还包含位置a8的置换(ala、glu、gln、his、lys或arg)，预期提高稳定性和活性；和a14的置换(glu)，预期避免推测由野生型tyra14导致的反-疏水作用和提供另外的负电荷。也考虑位置a14的其它可能的置换。附图简述图1.双相性胰岛素产品的图示目标。最初的实施使用野生型胰岛素(常规和nph)，而当前的产品使用膳食胰岛素类似物。该图获自r.beaser&s.braunstein,medscapemultispeciality(education/cmesection；2009)(http://www.medscape.org/viewarticle/708784)。图2.57-残基sci的带状模型。α-螺旋以红色(外侧)和黄色(内侧)显示，和b24-b28β-链以蓝色(箭头)显示。显示了三个二硫桥(胱氨酸)(星号)。c-结构域(序列gggprr)是充分有序的(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))。图3.57-残基sci平台的分子结构。6个残基的c-结构域(棍；蓝绿色)提供了在a和b结构域之间的系链(空间填充图)。根据静电位以标准grasp格式将表面颜色编码(红色，负电；紫色，正电；和白色，中性)。该图获自pdb条目2jzq，其基于weiss实验室的nmr研究(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))。图4.旧范例和新范例。(a)当前的双相性胰岛素产品包含可溶相(锌六聚体；绿色)和不可溶相(nph微晶混悬液；蓝色)。(b)提议的新范例试图利用在单体胰岛素类似物(i)、无锌二聚体(i2)、锌稳定的和/或无锌六聚体(i6)和可溶性聚集物(i6n)中的配对平衡。未显示：tr跃迁。图5.在酵母巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)中thermalin-双相性(形式1和2)的过表达。考马斯染色的sds-page凝胶：(a)sci-57pe(泳道b-d)，相对于分子量标记(a)。(b)sci-57dp(泳道g)，相对于作为阳性对照的hisa8-微小前胰岛素(mpi)(f)和标准品(e)。sci迁移≈6千道尔顿(kd)；微小-前胰岛素接近5.8kd。图6.糖尿病大鼠(时间0血糖为400±20mg/dl)用1单位的指定胰岛素类似物/300g体重注射s.q.。a.humalog(赖脯胰岛素)对比(δ)humalog25/75-premix对比sci-57pe(在图中标记为sci-1)新鲜对比(◆)sci-57dp(标记为sci-2)新鲜对比(●)稀释液。b.注射后在前1小时期间的血糖减少(相同的符号代码)。指出了各组的大鼠数量(n)；误差棒，标准误差。图7.在1单位指定胰岛素类似物s.q.注射后，[血糖]降低的初始速率：+表示在45℃搅动25天的sci-57pe(标记为sci-1)；++表示在45℃搅动57天的sci-57dp(标记为sci-2)。*p<0.05，与所有其它胰岛素相比。**p<0.05，与预混合赖脯胰岛素75/25相比。数据关于注射后的前1小时(见图8b)；误差棒，标准误差。图8.糖尿病大鼠(时间0血糖为410±20mg/dl)用1单位的指定类似物/300g体重注射s.q.。a.新鲜样品：(◆)sci-57dp(标记为sci-2)，(δ)lantus(甘精胰岛素)，humalog(赖脯胰岛素)和(●)稀释液。a.新鲜胰岛素。b.在高温下搅动的影响：(◆)新鲜sci-57dp对比(□)在45℃搅动57天的sci-57dp对比(○)在45℃搅动11天的lantus(甘精胰岛素)。图9.lillyco2+–edta螯合测定法：在25℃下在加入edta(以10倍摩尔过量)至r6钴胰岛素六聚体或sci-1六聚体的溶液后，在可见波长574nm处的标准化吸光度作为时间的函数显示。野生型胰岛素(黑线)：单-指数跃迁，时间常数6.3(±0.1)min。sci-1(绿线)：双相性跃迁，时间常数0.9(±0.1)min(快速相)和14.1(±0.1)min(慢速相)；r2＝0.998。蛋白质为3.5mg/ml，在包含1mmnascn、0.2mmcocl2和50mm苯酚的50mmtris-hcl(ph7.4)中。发明详述本发明涉及单链胰岛素类似物，其提供延长的作用持续时间、类似于具有范围为5-100％的绝对亲和力的野生型胰岛素(所选下限对应于前胰岛素)的ir-a/ir-b受体结合亲和力的比率、对igf-1r增加的辨别力、推测增强的对位置a21的化学降解的抗性(由于asn置换为gly、ala或ser)，推测增强的对高于室温的纤维化的抗性(由于单链拓扑学)和推测增加的热力学活性(部分地由于thra8置换为碱性侧链；arg、lys、his、orn)。本发明的特征在于当作为澄清和可溶的蛋白质单相溶液配制时，可通过单链胰岛素类似物产生自皮下储库的双相性吸收动力学。本领域已知的常规预混合产品，提供了在自装配的状态之间连续的可能配对平衡的最终末端(图4a)。考虑了提供组合快速和延迟吸收的备选策略，其依赖于管理这些配对平衡和相对热力学稳定性的速率常数，如图4b中图示形式所示。该策略的分子实施需要胰岛素类似物，其(i)作为无锌单体和二聚体是超级稳定的，和(ii)还顺从于形成稳定的锌介导的六聚体，其对高级聚集敏感(在小瓶或笔中可溶，但在储库中可能不溶)。尽管不希望受理论的约束，无锌单体和二聚体可提供膳食组分；锌稳定的六聚体聚集物会提供长效组分。还不希望受理论的约束，进一步可能的是，单链胰岛素类似物，当在血流中作为单体蛋白质分子提供时，可通过它们的激素-受体信号转导复合物的固有特征，显示对靶细胞的双相性信号转导性质，使得它们的药效学性质可以此方式模拟现有的常规-nph预混合产品的双相性药代动力学性质。本发明的特征在于单链类似物的等电点为6.8-7.8，使得在存在2-3个锌离子/6个蛋白质单体的情况下或在存在少于2个锌离子/6个蛋白质单体的情况下在中性条件下(ph7.0-8.0)可溶性制剂是可行的，以至于不能完成六聚体装配。因此，本发明的特征在于单链胰岛素类似物保留经历锌离子依赖性形成蛋白质六聚体的能力，这类似于本领域称为t6胰岛素六聚体、t3rf3胰岛素六聚体或r6胰岛素六聚体的经典的锌胰岛素六聚体。还考虑了单链类似物也可用衍生自动物胰岛素的a-和b-结构域序列制成，非限制性实例有，例如猪、牛、马和犬胰岛素。此外或备选地，本发明的胰岛素类似物可包含残基b1-b3的缺失，或可与缺少赖氨酸(例如，野生型人胰岛素中的lysb29)的变体b链组合，以避免在巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、酿酒酵母(saccharomycescerevisciae)或其它酵母表达物种或菌株中在酵母生物合成中前体多肽的指向lys(lys-directed)的蛋白水解。本发明的单链胰岛素的b-结构域可任选地包含非标准置换，例如位置b20和/或b23的d-氨基酸(预期增加热力学稳定性、受体结合亲和力和对纤维化的抗性)、在pheb24的2环位置的卤素修饰(即，邻位-f-pheb24、邻位-cl-pheb24或邻位-br-pheb24；预期提高热力学稳定性和对纤维化的抗性)、pheb24的2-甲基环修饰(预期提高受体结合亲和力)和/或在tyrb16和/或tyrb26的芳环内引入碘-取代(3-单-碘-tyr或[3,5]-二-碘-tyr)；预期提高热力学稳定性和受体结合活性)。还考虑了thrb27、thrb30或c-结构域中的一个或多个丝氨酸残基可单独或组合通过单糖加合物而被修饰；实例为o-连接的n-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖苷(称为galnac-oβ-ser或galnac-oβ-thr)、o-连接的α-d-吡喃甘露糖苷(甘露糖-oβ-ser或甘露糖-oβ-thr)和/或α-d-吡喃葡糖苷(葡萄糖-oβ-ser或葡萄糖-oβ-thr)。此外，根据人和动物胰岛素之间的相似性，和在过去动物胰岛素在人糖尿病患者中的使用，还考虑了在胰岛素序列中可引入其它较小修饰，特别是认为“保守的”那些置换。例如，可在具有类似侧链的氨基酸组内进行另外的氨基酸置换，而不背离本发明。这些包括中性疏水氨基酸：丙氨酸(ala或a)、缬氨酸(val或v)、亮氨酸(leu或l)、异亮氨酸(ile或i)、脯氨酸(pro或p)、色氨酸(trp或w)、苯丙氨酸(phe或f)和甲硫氨酸(met或m)。同样，中性极性氨基酸可在甘氨酸(gly或g)、丝氨酸(ser或s)、苏氨酸(thr或t)、酪氨酸(tyr或y)、半胱氨酸(cys或c)、谷氨酰胺(glu或q)和天冬酰胺(asn或n)的组内彼此置换。认为碱性氨基酸包括赖氨酸(lys或k)、精氨酸(arg或r)和组氨酸(his或h)。酸性氨基酸是天冬氨酸(asp或d)和谷氨酸(glu或e)。除非另外注明或从上下文显而易见，本文所述的氨基酸应认为是l-氨基酸。标准氨基酸还可被属于相同化学类别的非标准氨基酸置换。通过非限制性实例，碱性侧链lys可被较短侧链长度的碱性氨基酸(鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸)置换。lys还可被中性脂族电子等排体正亮氨酸(nle)置换，其可进而被包含较短脂族侧链的类似物(氨基丁酸或氨基丙酸)置换。为比较目的，提供了人前胰岛素的氨基酸序列，作为seqidno:1。seqidno:1(人前胰岛素)phe-val-asn-gln-his-leu-cys-gly-ser-his-leu-val-glu-ala-leu-tyr-leu-val-cys-gly-glu-arg-gly-phe-phe-tyr-thr-pro-lys-thr-arg-arg-glu-ala-glu-asp-leu-gln-val-gly-gln-val-glu-leu-gly-gly-gly-pro-gly-ala-gly-ser-leu-gln-pro-leu-ala-leu-glu-gly-ser-leu-gln-lys-arg-gly-ile-val-glu-gln-cys-cys-thr-ser-ile-cys-ser-leu-tyr-gln-leu-glu-asn-tyr-cys-asn提供了人胰岛素的a链的氨基酸序列，作为seqidno:2。seqidno:2(人a链)gly-ile-val-glu-gln-cys-cys-thr-ser-ile-cys-ser-leu-tyr-gln-leu-glu-asn-tyr-cys-asn提供了人胰岛素的b链的氨基酸序列，作为seqidno:3。seqidno:3(人b链)phe-val-asn-gln-his-leu-cys-gly-ser-his-leu-val-glu-ala-leu-tyr-leu-val-cys-gly-glu-arg-gly-phe-phe-tyr-thr-pro-lys-thr提供了kp-胰岛素(赖脯胰岛素，的活性组分，elilillyandco.)的修饰的b链的氨基酸序列，作为seqidno:4。seqidno:4(人“kp”b链)phe-val-asn-gln-his-leu-cys-gly-ser-his-leu-val-glu-ala-leu-tyr-leu-val-cys-gly-glu-arg-gly-phe-phe-tyr-thr-lys-pro-thrseqidno5提供了之前应公开的单链胰岛素类似物的氨基酸序列(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))，其结构显示在图1和2。与本发明的类似物不同，该序列缺少位置a14、c1和c2的酸性残基，并包含位置b10的酸性残基；得到的单链胰岛素类似物不显示本发明的需要的双相性药效学性质。本发明的单链胰岛素类似物的氨基酸序列在seqidno6-19中部分地给出，对应于单链胰岛素类似物。这些序列使用标准单字母代码，使得ala由a表示，半胱氨酸由c表示，天冬氨酸由d表示，谷氨酸由e表示等等，如本领域已知的。红色的元件表示在野生型胰岛素或野生型前胰岛素中不存在的序列或置换。seqidno13和19中的短划线表示缺失n-末端残基b1-b3(称为des-b1-b3类似物)。本发明的单链胰岛素类似物的氨基酸序列还在seqidno20-34中给出，对应于在由x1、x2等表示的位置具有任选元件的单链胰岛素类似物；这些位置以绿色表示。按上所述，红色的元件表示在野生型胰岛素或野生型前胰岛素中不以另外形式存在的序列或置换。seqidno13和19中短划线表示缺失n-末端残基b1-b3(称为des-b1-b3类似物)。其中x1选自ala,arg,asn,asp,gln,glu,或lys；x2选自ala,arg,gln,glu,或lys；x3选自gln,glu,phe,trp,或tyr；和x1选自ala,arg,glu,lys,或pro。本发明的单链胰岛素类似物的氨基酸序列还在seqidno35-49中给出，对应于在由y1、y2等表示的连接结构域的位置(紫红色)具有任选元件并包括以绿色表示的上述任选序列特征x1、x2等的单链胰岛素类似物。如上述，红色的元件表示在野生型胰岛素或野生型前胰岛素中不以另外形式存在的序列或置换。seqidno13和19中的短划线表示缺失n-末端残基b1-b3(称为des-b1-b3类似物)。其中x1选自ala,arg,asn,asp,gln,glu,或lys；x2选自ala,arg,gln,glu,或lys；x3选自gln,glu,phe,trp,或tyr；x1选自ala,arg,glu,lys,或pro；和其中y1和y2各自是asp或glu。本发明的单链胰岛素类似物的氨基酸序列还在seqidno50-64中给出，对应于具有另外1-5个氨基酸残基(称为b1-5，在下文以蓝色表示)的单链胰岛素类似物，其在由y1、y2等表示的连接结构域的位置(紫红色)具有任选元件并包括以绿色表示的上述任选序列特征x1、x2等。如上述，红色的元件表示在野生型胰岛素或野生型前胰岛素中不以另外形式存在的序列或置换。seqidno13和19中的短划线表示缺失n-末端残基b1-b3(称为des-b1-b3类似物)。其中x1选自ala,arg,asn,asp,gln,glu,或lys；x2选自ala,arg,gln,glu,或lys；x3选自gln,glu,phe,trp,或tyr；x1选自ala,arg,glu,lys,或pro；其中y1和y2各自是asp或glu；和其中残基b1,b2,b3,b4,b5各自任选地存在和可选自ala,asn,gln,gly,pro,ser或thr。以下dna序列编码seqidno6(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)中的使用模式进行优化。seq.id.no65ttcgtcaatcaacacttgtgtggttcccacttggttgaggcattgtacttggtctgtggtgagagaggattcttctacaccgatccaactggtggtggtcctagaagaggaatcgtcgagcaatgttgccactccatttgttccttggaacaattggaaaactactgcaactaa以下dna序列编码seqidno7(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no66ttcgtcaatcaacacttgtgtggttcccacttggttgaggcattgtacttggtctgtggtgagagaggattcttctacaccgatccaactggtgagggtcctagaagaggaatcgtcgagcaatgttgccactccatttgttccttggaacaattggaaaactactgcaactaa以下dna序列编码seqidno8(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no67ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgatccaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列编码seqidno9(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no68ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgatccaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttcctgggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列编码seqidno10(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no69ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactccagaaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列编码seqidno11(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no70ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactccaagaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列编码seqidno12(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no71ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgagccaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列编码seqidno13(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no72ttcgtcaaacagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactccagaaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列编码seqidno15(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no73ttcgttaaccagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgatccaactgaagagagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactaa以下dna序列编码seqidno16(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no74ttcgttaaccagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgatccaactgaagagagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactaa以下dna序列编码seqidno17(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no75ttcgttaaccagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgatccaactgaagagagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactaa以下dna序列编码seqidno18(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no76ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttcaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactccagaaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列编码seqidno19(见上文)指定的单链胰岛素类似物，其密码子对于巴斯德毕赤酵母中的使用模式进行优化。seq.id.no77ttcgtcaaacagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgacccaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga制备类似的合成基因并克隆至巴斯德毕赤酵母，其编码sci-59a(见下文)以及sci-59a和sci-59b的衍生物，其包含另外的置换glub13→gln，如seq.idno31-37所具体表达的。本发明的两个单链胰岛素类似物(由seqidno8和seqidno10编码；分别称为sci-57dp和sci-57pe)通过在巴斯德毕赤酵母中生物合成前体多肽来制备；该系统分泌包含天然二硫桥以及裂解的n-末端延伸肽的折叠的蛋白质。过表达的效率(>200mg/l发酵培养基)显示于图5。裂解的单链胰岛素产物具有长度57，其为30个残基的b-结构域、6个残基的c-结构域(在各情况下序列为eegprr)和21个残基的a-结构域的总和。sci-57dp和sci-57pe的形式等电点(pi)在各情况下通过除去野生型位置b29(lysb29)的正电荷，通过b28或b29的酸性置换，通过a14的酸性置换(tyra14→glu)和通过抵消c-结构域中的碱性和酸性侧链，预测转变至低于5.0。单链类似物的热力学稳定性通过cd-监测的胍变性来探查，如(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))所述。结果(表1的第2栏)表明，sci-57dp和sci-57pe各自比野生型胰岛素或kp-胰岛素对化学变性更稳定。在各情况下，需要较高浓度的盐酸胍以实现蛋白质的50％解折叠(表1的第3栏)；观察到向较大的m值的趋势(第4栏)，表明折叠状态的非极性表面的更有效的去溶剂化。发现相对于野生型胰岛素或kp-胰岛素(表1的第5栏)，在37℃轻轻搅动时sci-57pe对纤维化的易感性显著延长。尽管在这些条件下在少于10天内野生型胰岛素和kp-胰岛素形成原纤维，但sci-57pe耐受纤维化至少9个月。sci-57dp和sci-57pe的受体-结合亲和力相对于野生型人胰岛素进行测定。该测定法使用胰岛素受体的a同种型。相对于人胰岛素(平衡解离常数为0.05(±0.01)nm)，sci-57dp和sci-57pe各自显示0.06(±0.01)nm和0.08(±0.01)nm的结合常数。sci-57dp对促有丝分裂1型igf-i受体的亲和力是野生型人胰岛素的至多1/5。受体-结合活性的测定法方案如下。微量滴定条板(nuncmaxisorb)在4℃下用au5igg(100μl/孔，40mg/ml，在磷酸盐缓冲盐水中)孵育过夜。通过两位点连续模型分析结合数据。数据针对非特异性结合(在存在1μm人胰岛素的情况下保持膜关联的放射性的量)进行校正。在所有测定法中，在不存在竞争性配体的情况下结合的示踪剂的百分比少于15％，以避免配体-耗尽假象。解离常数(kd)通过拟合至数学模型确定，如whittaker和whittaker(2005.j.biol.chem.280:20932-20936)所述；该模型使用假定异源竞争的非线性回归(wang,1995,febslett.360:111-114)。表1.在25℃的胰岛素类似物的热力学和物理稳定性aa热力学稳定性自在25℃下cd-检测的胍变性(222nm)推断，通过外推至零变性浓度的两状态模型分析。bδgu表示在盐酸胍中变性自由能的表观变化，通过两状态模型外推至零变性浓度。ccmid定义为50％的蛋白质被解折叠的盐酸胍的浓度。dm值是揭示(unfolding)自由能δgu相对于变性剂的摩尔浓度的斜率；其与变性时非极性表面的暴露程度相关。e纤维化滞后时间是硫磺素-t-阳性聚集开始之前的天数的度量；一式三份的类似物在45℃下在tris-hcl制剂中以标称强度u-100轻轻摇动。fnd；未检测生物学活性和药效学在通过链脲菌素导致糖尿病的雄性sprague-dawley大鼠(约300g)中测试(图6)。相对于和25-75预混物，评价s.q.注射u-100(0.6mm)sci-57pe和sci-57dp的pd影响；得到的血糖浓度总体特征(图6a)表明，我们的两个候选物的pd性质类似于预混合lilly产品，概况了其长效(120-540min)和速效组分两者(图6b)。在注射后的前1小时内降低血糖浓度的初始速率显示于图7。sci的热稳定性。在上述大鼠中在有利于快速降解当前的胰岛素产品的条件下(即，在存在空气-液体界面的情况下在45℃下在玻璃小瓶中轻轻搅动；图8)，评价sci-57dp的效力保留或损失。在图8a中使用新鲜材料。对照为和尽管在11天后失活(图8b中的○)和在5天内失活(未显示)，但sci-2(◆和□)当在57天后作为澄清溶液测试时保持完全活性(图8b)。sci-57pe(其gu大于sci-dp；上表1)显示类似的对降解的抗性(未显示)。结构研究使用圆二色性(cd)和nmr光谱。sci-57dp和sci-57pe的远紫外线cd谱表明主要是α-螺旋，与人胰岛素的天然结构和单链胰岛素类似物的溶液结构一致(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))。nmr研究集中于在缺少锌离子的情况下根据蛋白质浓度<1mm的单体状态的sci-57dp的水溶液(ph7-8)。以质子频率700mhz获得光谱。2d-nmrnoesy光谱和1h-15n异核单量子相干性(hsqc)2d“指纹”光谱提供了折叠结构的证据；noes和化学位移的模式与57个残基的单链胰岛素类似物的在先分析一致(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))。六聚体分解的速度在sci-1的r6钴六聚体中在25℃和ph7.4下通过可见吸收光谱评价。该测定法利用在r6胰岛素六聚体中的两个四面体co2+位点的蓝色d-d吸收谱带以监测通过过量螯合剂edta的金属离子释放和螯合的速率；八面体co2+–edta络合物是无色的。值得注意的是，尽管野生型胰岛素的lillyco2+–edta螯合测定法在这些条件下导致574nm吸光度的单指数损失(图9中的黑线)，但sci-1显示具有快速相(比赖脯胰岛素更快；未显示)和慢速相(比野生型胰岛素更慢；图9中的绿线)的双指数跃迁。在由cwru的weiss小组测试的两条链胰岛素类似物的列表中，在edta测定法中这样的双相性动力学行为是无先例的。与pk有关的该测定法在动物(随后在人)中研究，这些光谱结果启示我们提出的假设，即本发明的sci可在皮下储库中显示双相性pk性质(如在大鼠中)。该双相性行为的分子机制仍然待定，但可能涉及酚依赖性rt跃迁，如在德谷胰岛素(一种新的基础类似物，来自novo-nordisk)中发现的。用于治疗糖尿病患者的方法包括给予本文所述的单链胰岛素类似物。本发明的另一方面，单链胰岛素类似物可在酵母(巴斯德毕赤酵母)中制备或通过天然片段连接进行全化学合成。在非标准修饰的情况下，例如d-氨基酸置换、phe或tyr的芳环内的卤素取代，或丝氨酸或苏氨酸通过碳水化合物的o-连接的修饰，合成制备途径是优选的；然而，通过扩展遗传密码技术或四碱基密码子技术制备包含非标准修饰的单链类似物的亚组会是可行的(对于综述，参见hohsaka,t.,&sisido,m.,2012)。本发明的又一方面，使用非标准氨基酸置换可增加单链胰岛素类似物对化学降解或物理降解的抗性。我们进一步考虑了本发明的类似物提供用于治疗糖尿病或代谢综合征的方法。胰岛素类似物的递送途径为通过使用注射器或笔式装置的皮下注射。本发明的单链胰岛素类似物还可包含其它修饰，例如位置b24、b25或b26的卤素原子，如在同时待审的美国专利申请号13/018,011中更全面描述的，其公开内容通过引用结合到本文中。本发明的胰岛素类似物还可包含由于缺失残基b1-b3导致的缩短的b链，如在同时待审的美国临时专利申请61/589,012中更全面描述的。药物组合物可包含这样的胰岛素类似物，和其可任选地包含锌。锌离子可以各种锌离子:蛋白质比率包括在内，范围为2.2个锌原子/胰岛素类似物六聚体至10个锌原子/胰岛素类似物六聚体。制剂的ph范围为ph7.0-8.0；缓冲液(通常为磷酸钠或tris-盐酸)可存在或可不存在。在这样的制剂中，胰岛素类似物的浓度通常会为约0.6-5.0mm；至多5mm的浓度可用于小瓶或笔；更浓缩的制剂(u-200或更高)可在具有明显的胰岛素抵抗的患者中具有特别的益处。赋形剂可包括甘油、甘氨酸、精氨酸、tris、其它缓冲液和盐，和抗微生物防腐剂，例如苯酚和间甲酚；后面的防腐剂已知提高胰岛素六聚体的稳定性。这样的药物组合物可用于通过给予具有糖尿病或其它医学病况的患者生理学有效量的组合物来治疗所述患者。根据前述公开内容，现在应该显而易见的是，提供的单链胰岛素类似物将实现上文所述的目标。即，这些胰岛素类似物显示提高的对纤维化的抗性，同时保留需要的药代动力学和药效学特征(赋予双相性作用)和保持野生型胰岛素的至少一部分的生物学活性。因此，应理解，在未背离本文所公开和描述的发明精神的情况下，可确定明显落入所要求保护的发明的范围内的任何变化，以及因此可确定特定组分要素的选择。引用以下文献以证实本文描述的试验和测定方法会被本领域普通技术人员所理解。brangejeditor.(1987)galenicsofinsulin:thephysico-chemicalandpharmaceuticalaspectsofinsulinandinsulinpreparations.berlin:springerberlinheidelberg.hohsaka,t.andsisido,m.(2012)incorporationofnon-naturalaminoacidsintoproteins.curr.opin.chem.biol.6,809-15.hua,q.x.,nakagawa,s.h.,jia,w.,huang,k.,phillips,n.b.,hu,s.和weiss,m.a.(2008)designofanactiveultrastablesingle-chaininsulinanalog:synthesis,structure,andtherapeuticimplications.j.biol.chem.283,14703-14716.ilag,l.l.,kerr,l.,malone,j.k.andtan,m.h.(2007)prandialpremixedinsulinanalogueregimensversusbasalinsulinanalogueregimensinthemanagementoftype2diabetes:anevidence-basedcomparison.clin.ther.29,1254-70.jang,h.c.,guler,s.andshestakova,m.(2008)whenglycaemictargetscannolongerbeachievedwithbasalinsulinintype2diabetes,cansimpleintensificationwithamodernpremixedinsulinhelp？resultsfromasubanalysisofthepresentstudy.int.j.clin.pract.62,1013-8.kalra,s.,balhara,y.,sahay,b.,ganapathy,b.anddas,a.(2013)whyispremixedinsulinthepreferredinsulin？novelanswerstoadecade-oldquestion.j.assoc.physiciansindia61,9-11.lee,h.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