本发明涉及基因表达分析、细胞功能分析、生物体组织的分析方法、疾病的诊断、药物开发等技术领域，更具体而言，涉及能够针对单一细胞进行基因分析的细胞分析器件、装置以及使用了该装置的细胞分析方法。
背景技术：
单一细胞分析是高精度地对每个单一细胞的细胞中的生物体分子进行检测和/或定量的技术。为了进行单一细胞分析，需要为进行单独处理而将细胞分离，高效地提取成为细胞中的测量对象的核酸，合成互补链(例如cDNA)，并根据需要对扩增得到的产物进行序列分析。
专利文献1中公开了如下器件：通过将各个细胞捕获到细孔阵列片的细孔，接着用具有固定在细孔且每个细孔不同的标签序列的DNA探针捕获来自该细胞的核酸并合成cDNA，能够得到可识别来自哪种细胞的序列分析用的产物。图1示出了这样的器件的基本构成(相当于专利文献1的图8)。
图1的器件中，从入口106导入含有细胞101的细胞溶液。由于用细胞溶液充满平面基板形状的多孔质膜102的上部区域104，所以从上部出口107吸引细胞溶液。当从下部出口108吸引溶液而施加负压时，细胞溶液经由多孔质膜102被吸引，细胞101被诱导至细胞捕获部103。细胞101被构筑在多孔质膜102上的格子状的细胞捕获部103捕获，当破碎细胞时，该细胞中的核酸(例如mRNA)被固定在细胞正下方的多孔质膜中的DNA探针(例如聚T探针)捕获。
当使用图1这样的器件时，能够基本不与除反应区域即多孔质膜内壁以外的区域接触地捕获从被捕获的细胞提取的核酸，合成与被捕获的核酸对应的核酸(例如cDNA)。因此，能够将核酸吸附于与反应无关的器件的内壁的概率抑制得较低，从而高效率地制备用于序列分析的产物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2014/020657号
技术实现要素：
图1那样的器件中，为了高效地捕获核酸，构成多孔质膜102的孔的平均直径需要为数μm以下，特别优选为1μm以下。另外，多孔质膜102的膜厚优选为10μm以上，特别优选为数十μm以上。但是，当使用这样的多孔质膜时，使细胞溶液通过时的压力损失增大。当压力损失大时，从下部出口108吸引溶液时吸引速度降低，从而细胞101被细胞捕获部103吸引的速度降低。因此，观察到较多的细胞因重力而沉降，在到达细胞捕获部103之前留在器件上的其他区域的现象。图1中，109所示的细胞是未到达这样的细胞捕获部103的细胞的一个例子。
细胞停留在除细胞捕获部103以外的区域时，不仅能够分析的细胞的比例降低，而且还引起附带的问题。即产生下述问题：从细胞提取核酸时需要破碎细胞的工序，此时，存在于除细胞捕获部103以外的区域的细胞也同时被破碎，从该细胞提取的核酸流入多个细胞捕获部103，从而难以进行准确的单一细胞分析。
上述问题的原因在于为了提高核酸捕获效率，减小多孔质膜102的孔径、增大膜厚所导致的压力损失增大。因此，本质上的课题是提高核酸捕获效率和提高细胞捕获效率的权衡关系。
此外，在捕获核酸后，为了进行序列分析，需要核酸扩增工序。在该工序中，需要(如专利文献1所记载的那样)核酸扩增产物从核酸捕获部游离，作为溶液样品提取到器件的外部，进行序列分析。有时会产生该溶液中的扩增产物吸附于器件的内壁的问题。由于吸附导致序列分析所需的核酸扩增产物的收量降低，并且由于吸附率因核酸的碱基长度的不同而异，因此有可能会对与细胞中的本来的核酸组成不同的组成进行序列分析。
用于解决课题的手段
本发明者们研究了上述那样的问题，结果得出了以下结论。在从配置有核酸捕获部的基板(例如多孔质膜)的背面吸引细胞溶液时，采取对细胞施加不会靠近除细胞捕获部以外的基板上的区域那样的斥力的器件构成是有效的。即，作为一个例子，如图2所示，构成为对细胞的重力与对细胞的吸引方向沿相反的方向施加的器件是有效的。这样的斥力不仅在图2所例示的重力的情况下有效，而且在通过表面处理产生的静电力或介电泳力也是有效的。
另外，本发明者们发现，如图3所示，通过使用第2三维多孔质膜(三维多孔质体)增强吸引力，防止因其他力吸附在除细胞捕获部以外的区域的方法是有效的，但由于该第2三维多孔质膜的内壁需要是亲水性的，因此具有负电荷的DNA链有时以高概率吸附到内壁。因此，得到的扩增产物的收量有时会降低，会产生由DNA扩增产物的长度导致的收量变化，因此也有难以分析一个细胞中的核酸组成的情况。为了进一步改良这点，发现在扩增反应过程中设置将上述亲水性的三维多孔质膜和扩增反应部即上述核酸捕获部的溶液分离的手段是有效的。作为进行这样的分离的方法，发现在核酸捕获部即第1多孔质膜(或基板、即二维阵列芯片)与吸引辅助用的第2亲水性三维多孔质膜之间设置用于在适当的时间点注入空气或油等非极性溶剂的手段，或者在器件内部设置将第一与第2多孔质膜的设置距离相对于膜在垂直方向上分离这样的致动器是有效的。此外还发现，在第1与第2多孔质膜之间使用超滤膜或凝胶膜等分离膜使扩增产物不到达第2多孔质膜也是有效的。
因此，本发明的主旨如下：
(1)一种细胞分析器件，其特征在于，具备：
用于导入含有细胞的溶液的溶液导入流路；
具备多个细胞捕获部和核酸捕获部的组的基板，所述细胞捕获部与所述溶液导入流路相接、具有能够捕获1个细胞的凹部，所述核酸捕获部与所述细胞捕获部的各个凹部对应地设置、用于捕获从所述细胞捕获部捕获的细胞提取的核酸；
与所述基板的所述核酸捕获部相邻地设置、用于将所述核酸捕获部的溶液排出的排出流路；和
设置在所述排出流路上的压力控制手段；
其中，所述基板具有将细胞从所述基板吸离的方向的斥力，
所述压力控制手段在细胞捕获至所述细胞捕获部时，将从所述细胞捕获部向着所述核酸捕获部的方向的力控制为大于所述斥力的第一压力。
(2)根据(1)所述的细胞分析器件，其中，所述压力控制手段在所述核酸捕获部中进行核酸反应时，将从所述细胞捕获部向着所述核酸捕获部的方向的力控制为大于重力且小于所述第一压力。
(3)根据(1)所述的细胞分析器件，其中，所述基板上的除与含有所述细胞的溶液接触的所述凹部以外的区域是对细胞产生斥力的区域。
(4)根据(1)所述的细胞分析器件，其中，所述斥力是按照所述细胞捕获部在与重力相反的方向上捕获细胞的方式设置所述基板而产生的斥力。
(5)根据(1)所述的细胞分析器件，其中，所述斥力是所述基板的表面经抑制细胞吸附的处理而产生的斥力。
(5-1)根据(5)所述的细胞分析器件，其中，抑制细胞吸附的处理是利用涂布剂、例如MPC聚合物进行的表面处理。
(6)根据(1)所述的细胞分析器件，其中，所述器件还具备按照夹着所述基板的方式设置的电极对，所述核酸捕获部具备金属微粒，所述斥力是对所述电极对施加的电压与所述金属微粒的电感耦合产生的斥力。
(6-1)根据(6)所述的细胞分析器件，其中，金属微粒为金微粒、和/或基板为铂基板。
(7)一种细胞分析器件，其特征在于，具备：
用于导入含有细胞的溶液的溶液导入流路；
具备多个细胞捕获部和核酸捕获部的二维阵列芯片，所述多个细胞捕获部与所述溶液导入流路相邻地设置且能够逐个地捕获细胞，所述核酸捕获部与所述多个细胞捕获部的各细胞捕获部对应地设置、用于捕获从所述细胞捕获部捕获的细胞提取的核酸；
吸收滞留在所述核酸捕获部的溶液的三维多孔质体且用于将所述溶液排出的排出流路；和
将所述核酸捕获部和所述排出流路之间分离控制的分离控制部；
其中，所述分离控制部在所述核酸捕获部捕获到所述核酸之后进行分离控制，以使从被捕获的核酸扩增的产物不会被导入到所述排出流路。
(8)根据(7)所述的细胞分析器件，其中，所述分离控制部是设置于所述排出流路的吸引压力施加手段。
(9)根据(7)所述的细胞分析器件，其中，在所述二维阵列芯片与所述三维多孔质体之间配置用于防止所述扩增产物的分子大小的分子通过的超滤膜或凝胶膜。
(10)根据(7)所述的细胞分析器件，其中，所述分离控制部是将分离溶剂或空气导入到所述核酸捕获部与所述排出流路之间的手段。
(10-1)根据(10)所述的细胞分析器件，其中，分离溶剂为矿物油。
(11)根据(1)或(7)所述的细胞分析器件，其中，所述核酸捕获部具有用于捕获核酸的核酸探针，所述核酸探针具有与从细胞提取的核酸杂交的核酸捕获序列和与各细胞捕获部对应的不同的细胞识别序列。
(12)使用了(1)所述的细胞分析器件的细胞分析方法，其包含：
用含有细胞的溶液充满所述基板上的工序；和
向所述细胞捕获部施加负压，将所述含有细胞的溶液朝向所述基板地吸引，在所述细胞捕获部捕获单一细胞的工序。
(13)根据(12)所述的细胞分析方法，其还包含：在向所述细胞捕获部施加负压的状态下对所述细胞捕获部捕获到的单一细胞进行破碎，将从所述细胞提取的核酸捕获到所述核酸捕获部的工序。
(14)根据(13)所述的分析方法，其还包括：将具有与所述核酸捕获部捕获的核酸杂交的序列的第二核酸探针、以及用于以所捕获的核酸为模板的互补链合成的酶及底物供给至所述核酸捕获部、进行互补链合成的工序。
(15)使用了(7)所述的细胞分析器件的细胞分析方法，其包含：
用含有细胞的溶液充满所述二维阵列芯片上的工序；和
向所述细胞捕获部施加负压，从具备所述三维多孔质体的所述排出流路吸引所述含有细胞的溶液，同时将用于核酸扩增的试剂与所述含有细胞的溶液同样地通过吸引导入到核酸捕获部后，在扩增反应开始前或扩增反应开始后结束前将所述核酸捕获部或所述二维阵列芯片与所述三维多孔质体分离的工序。
(15-1)根据(15)所述的细胞分析方法，其还包含：将捕获到所述细胞捕获部的单一细胞在对所述细胞捕获部施加负压的状态下破碎，使从所述细胞提取的核酸捕获到所述核酸捕获部的工序。
(15-2)根据(15-1)所述的分析方法，其还包含：将具有与所述核酸捕获部捕获的核酸杂交的序列的第二核酸探针、以及用于以所捕获的核酸为模板的互补链合成的酶及底物供给至所述核酸捕获部、进行互补链合成的工序。
(16)一种细胞分析装置，其特征在于，具备(1)～(11)中任一项所述的细胞分析器件和细胞观察手段(例如荧光显微镜)。
发明效果
通过本发明的细胞分析器件、装置以及细胞分析方法，在从细胞捕获核酸时，成功地在维持核酸捕获部的核酸捕获效率的同时，与以往相比，提高了细胞捕获部捕获细胞的效率。其结果，能够比以往的器件等更高精度地制备提高了各个细胞的分离度的单一细胞分析用样品。另外，通过本发明的细胞分析器件、装置和细胞分析方法，在器件内部进行扩增反应时，能够高效率地回收扩增产物。
因此，通过本发明的细胞分析器件、装置以及细胞分析方法，不仅能够高效且高精度地对以组织平均计的基因的表达量进行定量分析，还能够高效且高精度地对构成组织的各个细胞的内容物进行定量分析。通过进行以单一细胞水平测量在生物体组织中活动的基因(例如mRNA)的单一细胞分析，能够详细地知道包含细胞间的相互作用在内的生物体内发生的各种现象，期待在生命科学领域、特别是医疗、药物研发、诊断、生命现象的基础研究等中具有很大效果。
附图说明
图1是表示作为本发明相关技术的专利文献1所记载的器件的基本构成的图。
图2是表示本发明一个方式的细胞分析器件的构成的实施方式的图。
图3是表示本发明另一方式的细胞分析器件的构成的实施方式的图。
图4是表示使用了本发明的细胞分析器件的细胞分析方法的流程图和分离时间点的图。
图5是表示实施例1-1中制造的器件的构成的概要的图。
图6是表示使用了本发明的细胞分析器件的分析方法中的核酸处理过程的图。
图7是表示实施例1-4中制造的器件的构成的概要的图。
图8-1是表示实施例2的器件的构成的概要的图。
图8-2是图8-1的后续。
图9是表示实施例2-2中制造的器件的构成的概要的图。
图10是表示实施例3的装置的构成的概要的图。
具体实施方式
在一个方式中，本发明的细胞分析器件中，在将细胞吸引至二维阵列芯片的细胞捕获部时，通过与从二维阵列芯片的基板将细胞吸离的方向的斥力(例如重力)对抗地进行吸引，防止细胞吸附到二维阵列芯片上。具体而言，本发明的细胞分析器件具备：用于导入含有细胞的溶液的溶液导入流路；具备多个细胞捕获部和核酸捕获部的组的基板，所述细胞捕获部与所述溶液导入流路相接、具有能够捕获1个细胞的凹部，所述核酸捕获部与所述细胞捕获部的各个凹部对应地设置、用于捕获从所述细胞捕获部捕获的细胞提取的核酸；与所述基板的所述核酸捕获部相邻地设置、用于将所述核酸捕获部的溶液排出的排出流路；和设置在所述排出流路上的压力控制手段；其中，所述基板具有将细胞从所述基板吸离的方向的斥力，所述压力控制手段在细胞捕获至所述细胞捕获部时，将从所述细胞捕获部向着所述核酸捕获部的方向的力控制为大于所述斥力的第一压力。
图2是表示本发明的上述方式的细胞分析器件的构成的一个实施方式的图，(a)表示仰视图(从下方观察的平面图)，(b)表示2A-2A’截面的剖视图，(c)表示2B-2B’截面的剖视图。其中，(d)是剖面图(c)中的区域2C的放大图。
本发明的细胞分析器件具有能够逐个捕获细胞的多个细胞捕获部203和与各细胞捕获部对应地存在、用于捕获从细胞捕获部所捕获的细胞提取的核酸的核酸捕获部210的组(以下也称为二维阵列芯片(213))，将在吸引前保持从细胞导入口211导入的细胞溶液的下部区域214与二维阵列芯片相邻地配置，相反侧的上部区域215与位于上部的上部出口207连接。在该上部出口207连接有泵或注射器，通过向该上部出口207施加负压，能够对二维阵列芯片上的核酸捕获部210及细胞捕获部203施加负压，区域214中的细胞溶液吸引到细胞捕获部203。如(d)的放大剖视图所示，在吸引细胞溶液时，由于溶液的粘度，力向上(箭头216的方向)作用于细胞。另一方面，重力作用在217方向上，成为与吸引方向相反的方向。由此，重力引起的细胞沉降作用在从二维阵列芯片吸离的方向上，因此细胞的吸引力仅作用在细胞捕获部203，防止细胞吸附到二维阵列芯片上的除细胞捕获部以外的区域。在该实施方式中，将重力用作从二维阵列芯片吸离的方向的斥力，对于可利用的其他斥力后述。
核酸捕获部210由多孔质材料或珠粒(优选为磁性珠)等构成，固定有用于捕获从细胞提取的核酸的核酸探针。核酸探针上具有与从细胞提取的核酸杂交的核酸捕获序列和与各细胞捕获部对应的不同的细胞识别序列，通过使用对这样的核酸探针中捕获的核酸进行扩增得到的产物，能够进行单一细胞分析。对于核酸探针，本领域技术人员可以根据分析目的、分析对象(mRNA、基因组DNA、ncRNA等)、所使用的器件的构成、扩增反应的种类等来适当设计。
细胞溶液从细胞导入口211导入。在图1所示的现有例中，以上下颠倒的形式用细胞溶液充满区域214，因此从样品回收口212吸引细胞溶液。接着，通过从上部出口207吸引溶液并施加负压，使单一细胞吸附到细胞捕获部203，这点也与现有例的器件相同。但是，本发明的器件与现有例的器件在将重力方向控制为适当方向方面不同。
在细胞吸引时接近二维阵列芯片的吸引力需要强于施加于相反方向的重力。该强的吸引在施加于上部出口的负压接近1个气压、区域215内部的压力设定得比细胞溶液的饱和蒸气压低时特别有效。为了使内部压力低于该饱和蒸气压，需要持续的吸引，因此与使用了吸引体积有限的注射器的泵相比，隔膜泵等连续吸引泵更有效。用于实现克服重力这样的强吸引力的另一种方法是配置三维多孔质体的方法。三维多孔质体具有如下性质：在配置于区域215时，能够迅速吸收因毛细管现象而接触的水溶液，且将该吸收的水溶液向外部、尤其是向不与核酸捕获部210接触的方向排出。通过排出所吸收的水溶液，能够维持三维多孔质体的由毛细管现象引起的溶液吸收性能。通过利用三维多孔质体的毛细管现象，与如图1所示的现有例那样仅施加负压的情况相比，能够更迅速地吸引滞留于核酸捕获部210的溶液，进而细胞捕获部203吸附细胞的能力也提高。关于使用三维多孔质体的实施方式，在用于在器件内进行至核酸扩增时高效率地回收核酸扩增产物的构成的记载中进行详述。
沿将细胞从二维阵列芯片吸离的方向对细胞施加的力不限于重力。例如，通过对二维阵列芯片(基板)进行相对于二维阵列芯片具有负电荷的表面处理，能够在二维阵列芯片附近对细胞施加斥力，抑制细胞吸附到二维阵列芯片。另外，也可以通过用MPC聚合物、聚乙二醇等涂布剂涂布表面来实现。
此外，也可以通过电泳沿将细胞从二维阵列芯片吸离的方向施加力。详细情况记载于实施例1-4。
另外，在另一方式中，本发明的细胞分析器件中，通过与二维阵列芯片相邻地配置三维多孔质体，通过毛细管现象使细胞的吸引高速化，减小细胞重力所引起的沉降的影响。本发明的细胞分析器件在具备三维多孔质体的情况下，同时具备在扩增反应中将二维阵列芯片与三维多孔质体分离的手段，以使二维阵列芯片上经扩增的扩增产物不会吸附于三维多孔质体。具体而言，本发明的细胞分析器件具备：用于导入含有细胞的溶液的溶液导入流路；具备多个细胞捕获部和核酸捕获部的二维阵列芯片，所述多个细胞捕获部与所述溶液导入流路相邻地设置且能够逐个地捕获细胞，所述核酸捕获部与所述多个细胞捕获部的各细胞捕获部对应地设置、用于捕获从所述细胞捕获部捕获的细胞提取的核酸；具备吸收滞留在所述核酸捕获部的溶液的三维多孔质体且用于将所述溶液排出的排出流路；和将所述核酸捕获部和所述排出流路之间分离控制的分离控制部；其中，所述分离控制部在所述核酸捕获部捕获到所述核酸之后，进行分离控制，以使从被捕获的核酸扩增的产物不被导入到所述排出流路
图3是表示本发明的上述方式的细胞分析器件的构成的一个实施方式的图，(a)表示仰视图(从下方观察的平面图)，(b)表示3A-3A’截面的剖视图，(c)以及(d)表示3B-3B’截面的剖视图。
本发明的另一方式的细胞分析器件涉及下述构成，其特征在于，设置有能够将从细胞提取的核酸的扩增产物高效地回收到外部的手段。具备能够逐个捕获细胞的多个细胞捕获部303和与各细胞捕获部对应、捕获从细胞捕获部捕获的细胞提取的核酸的核酸捕获部310的二维阵列芯片313与上述方式同样，用于保持从细胞导入口311导入的细胞溶液的下部区域314与二维阵列芯片相邻地配置，相反侧的上部区域315与上部出口307连接，这些也是同样的。此外，该上部出口307连接有泵或注射器，通过向该上部出口307施加负压，能够对二维阵列芯片上的核酸捕获部310及细胞捕获部303施加负压，区域314中的细胞溶液被吸引到细胞捕获部303，这些也是同样的。但是，本方式中，在通过在上部区域配置三维多孔质体而增加吸引力来捕获细胞的构成中，在设置用于将三维多孔质体与二维阵列芯片分离的手段这点上不同。作为该分离手段，设有图3的323的“潴留部”(装有空气或非极性溶剂(例如矿物油)等分离溶剂的空间)、和作为向三维多孔质体与二维阵列芯片之间的区域注入空气或分离溶剂的手段的注射器333。本实施方式中，由于二维阵列芯片由具有弹性的材料(在此为PDMS树脂)制作，因此通过向上部出口307施加用于吸引的负压，如图3的(C)的313所示的二维阵列芯片那样，二维阵列芯片在负压施加下弯曲而密合于三维多孔质体319。通过这样的密合，能够利用三维多孔质体的毛细管效应进行吸引。停止施加负压，将空气或分离溶剂从各介质的“潴留部”323注入到三维多孔体319与二维阵列芯片313之间，由此切断介由溶液的物质移动。通过该切断，能够防止扩增产物DNA吸附到三维多孔体内壁。
具体而言，为了维持构成二维阵列芯片中的核酸捕获部310的大量珠粒被打包的状态，使防珠粒流出膜(亲水性多孔质膜)318密合于二维阵列芯片313的背面。三维多孔质体与二维阵列芯片的密合通过珠粒保持膜318与三维多孔质体的密合而准确地实现。这里，由于防珠粒流出膜318与二维阵列芯片313成为一体而发挥功能，因此利用所述毛细管效应的吸引是有效的。
作为分离手段，也可以在三维多孔体上连接致动器，改变三维多孔质体与二维阵列芯片之间的距离来进行分离。
此外，也可以通过设置在密合状态下扩增产物不会到达三维多孔体表面这样的隔离膜来进行分离。这通过例如在三维多孔质体与二维阵列芯片之间配置防止扩增产物的分子大小的分子(例如DNA分子)通过的孔径的超滤膜或凝胶膜来实现。
本发明中使用的三维多孔质体是具有无规地具有数十nm至零点几μm的细孔、具有能够利用因该细孔的存在而产生的毛细管现象来吸收水溶液这样程度的表面亲水性的材料。作为其具体例子，可举出多孔质玻璃材料、玻璃纤维集合体(例如使玻璃纤维在同一方向上对齐成束)、玻璃珠集合体(更优选平均粒径为0.1～30μm的范围)等。三维多孔质体不容易变形时，由于所吸收的溶液非期望地排出而向核酸捕获部310、细胞捕获部303逆流的可能性变低，因此优选。3维多孔质体的表面亲水性具有下述任一特征：使用纯水测定的水接触角为90°以下、优选为80°以下、更优选为50°以下、特别优选为40°以下；或者向具有保持1μL液体所需的足够体积的三维多孔质体滴加1μL纯水时，在10秒以内、优选5秒以内、更优选3秒以内、特别优选1秒以内所滴加的液体被吸收。需要说明的是，液滴被三维多孔质体吸收是指从与三维多孔质体表面垂直的面观察时，为液滴的存在无法通过目视确认的状态。
另外，构成溶液保持部319的三维多孔质体优选其孔径充分大于由多孔质膜或珠粒等构成的核酸捕获部310所具有的孔，例如平均孔径优选为0.2μm以上，特别优选为3μm以上。如果是这样的大小，则空气等气体通过溶液保持部319时，不会产生过大的压力损失。另外，如果三维多孔质体的孔径为上述那样的大小，则从上部出口307施加负压时，能够在核酸捕获部310的上部-下部间产生充分的压力差。
优选设置有溶液保持部319且与上部出口307连通的流路经由压力调整部件320与向装置外部开放的吸气口321连通。图3的装置中，吸气口321沿装置上部方向向外部开放。设置有吸气口321时，若从上部出口307施加负压，则经由压力调整部件320从吸气口321摄入外部空气，产生空气气流322，由此将溶液保持部319所吸收的溶液排出。通过为设置有吸气口321的构成，仅在从上部出口307施加负压时，溶液保持部319能够通过毛细管现象吸收溶液，即能够通过毛细管现象再次吸收溶液保持部319所排出的溶液的容量这样的量的溶液。另外，为不设置吸气口321的构成的情况下，仅溶液充满上部区域314时，溶液不会到达溶液保持部319而无法开始吸收，另一方面吸收开始后，直至溶液保持部319的容量充满吸收也不停止，控制性不充分，而通过设置吸气口321能够补充控制性。若在吸气口321进一步设置空气阀，则溶液吸收的控制性进一步提高，因此优选。
压力调整部件320优选在气体通过时产生比溶液通过核酸捕获部310时产生的压力损失大的压力损失。通过设置这样的压力调整部件320，在从上部出口307施加负压时，不仅向吸气口321、而且向对溶液保持部319、核酸捕获部310以及细胞捕获部302施加足够的负压。作为压力调整部件320，例如使用具有比核酸捕获部310所具有的孔更微细的孔的材料、例如具有核酸捕获部310所具有的孔的平均孔径的约1/5～约1/10、更优选约1/7～约1/9，具体而言约1/8的平均孔径的材料时，从空气与水的粘度差的观点出发，可以说平衡性良好。
另外，本发明者们对具备三维多孔质体的细胞分析器件已经申请了国际专利申请(2015年9月30日申请的PCT/JP20102015/077849)。该申请的说明书、权利要求书以及附图所记载的内容直接作为参考而纳入本说明书中。
图4表示使用了本发明的器件的细胞分析方法的流程图。由此，说明在哪个时间点将三维多孔质体与二维阵列芯片分离。
起始步骤中，在如上述那样将细胞捕获至细胞捕获部303之后，在(步骤2)中从上部出口307施加负压的状态下，通过裂解缓冲液(lysis buffer)等将细胞破碎时，从该细胞提取的核酸(例如mRNA)被固定于核酸捕获部310的核酸探针捕获。(步骤3)中，在核酸捕获部310表面上捕获的核酸通过将含有酶的试剂导入至核酸捕获部，合成所捕获的核酸(例如mRNA)的互补链1st strand(例如cDNA)。(步骤4)中，通过将与测量对象的基因对应的第二DNA探针和酶试剂导入核酸捕获部，合成2nd strand。到目前为止的反应全部在核酸捕获部表面发生，必要的反应产物固定在上述表面上。在接下来的扩增反应(例如PCR)中，扩增产物从表面上游离，作为最终产物从器件回收。此时，为了防止扩增产物吸附于三维多孔体内壁，将扩增反应所需的含有酶和底物的试剂通过吸引导入至核酸捕获部之后，关闭吸引力，将分离用的空气或分离溶剂从“潴留部”323压入注射器333，由此注入到三维多孔质体与二维阵列芯片之间。由此，能够阻断扩增产物从二维阵列芯片中向三维多孔质体移动，从而防止吸附。扩增时扩增产物通过扩散而从二维阵列芯片扩散到区域314。
通过注入空气或分离溶剂进行的分离的时间点可以是导入试剂后的扩增反应(例如PCR循环反应)前的时间点，但在通过扩散从核酸捕获部向三维多孔质体移动之前的数个循环的扩增反应完成后进行分离更好。通过在这样的时间点进行，能够将温度变化引起的溶液移动的影响抑制到最小限度。
扩增工序完成后，扩增产物通过吸引从样品回收口312回收。此时，细胞导入口311开放，溶液从311向312移动。由于得到的扩增产物中包含分析所不需要的长度的DNA链(特别是短的DNA链)，因此为了在(步骤7)中除去而实施精制，在(步骤8)中通过新一代测序仪进行序列分析。最后，通过将与细胞捕获位置对应的每个标签序列所得到的序列重新汇总(步骤9)，得到单一细胞分析结果，这点与现有例是同样的。另外，核酸的扩增优选为PCR扩增，但并不限定于此，也可以使用滚环扩增(RCA)反应、NASBA法、LAMP法等其他的扩增法。这样的其他扩增法在本技术领域中是公知的，本领域技术人员可以适当选择所使用的核酸探针、试剂。
另外，在通过致动器将三维多孔质体与二维阵列芯片分离的情况下，也在与上述相同的时间点进行分离。
此外，在使用超滤膜或凝胶膜的分离方法中，扩增产物向多孔质体的移动始终被切断，因此无需设定分离的时间点。这里，通过将超滤膜或凝胶膜的孔径设定为1～10nm、例如5nm(30kDa)，能够将无负压施加状态下的扩增产物的核酸的移动量减少至1/10以下。
实施例
以下，使用实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
(实施例1-1)器件的制造
图5是表示本实施例中制造的器件的构成的概要的图，(a)表示仰视图(从下方观察的平面图)、(b)表示5A-5A′截面的剖视图。器件500具备多个反应室524，在其各反应室524中配置有具备多个细胞捕获部503和与该各个细胞捕获部503对应的核酸捕获部510的组的二维阵列芯片513。细胞溶液通过从细胞导入口511朝向样品回收口512地在共用流路525中流动而供给到二维阵列芯片513上，在芯片上由细胞溶液充满。单独入口527在单独向每个芯片导入试剂的情况下，具体而言，用于例如在导入含有具有用于识别芯片的标签序列的引物的试剂时等。
在二维阵列芯片513的制造中，使用通过注塑成型得到的二甲基聚硅氧烷(PDMS)制树脂芯片(边长为1.125mm的正方形)，形成直径小于细胞的直径为3～10μm左右的贯通孔，作为细胞捕获部503。另外，二维阵列芯片的制造可以使用通过使用了其他树脂(聚碳酸酯、环状聚烯烃、聚丙烯等)的注塑成型而得到的树脂芯片来进行，或者也可以使用纳米压印技术、半导体工艺来进行。用于制造二维阵列芯片的材料优选为疏水性材料，由此可以减少细胞、试剂等在阵列芯片上的吸附。通过在这样的二维阵列芯片的基板的表面进行抑制细胞吸附的处理，也能够对细胞施加斥力(参照实施例1-3)。
在细胞捕获部503的正下方设置直径数十μm(例如10～50μm)的圆筒状的空间，在其中填充固定有核酸捕获用探针的磁性珠，构成核酸捕获部510。磁性珠的填充分别使用喷墨打印机头进行。在使芯片上下颠倒的状态下，将固定有每个区域不同的序列的珠粒溶液分别向核酸捕获部510各填充2nL。用于填充的珠粒溶液以5×109个/mL的数密度悬浮有直径为1μm的磁性珠。在磁性珠上固定有链霉抗生物素蛋白，通过该链霉抗生物素蛋白固定经5’生物素基修饰的DNA探针。为了增加填充的磁性珠的数量来提高核酸捕获效率，使珠粒的直径为数μm以下(例如1μm以下)。为了使填充的磁性珠不流出，使孔径比珠粒直径小的防珠粒流出膜518(孔径为0.8μm的树脂制多孔膜：Isopore膜，Millipore公司制)密合于二维阵列芯片513。
本实施例中，利用重力作为斥力，防止细胞因重力引起的细胞沉淀而与二维阵列芯片上的除细胞捕获部以外的区域接触、吸附。但是，本实施例中，由于重力作用在从二维阵列芯片吸离的方向上，因此需要克服重力来吸引细胞。但是，由于二维阵列芯片513的核酸捕获部510填充有微细的磁性珠，因此仅通过向使用了注射器的二维阵列芯片513的上部和下部施加压力差，细胞溶液不会以充分的流速流动，有时也无法得到充分的吸引力。因此，本实施例中，作为更优选的实施方式，吸引方法如下实现：将隔膜泵不与注射器而是与上部出口连接，将上部流路526的区域保持在水溶液的饱和蒸气压以下，使到达二维阵列芯片的背面的溶液蒸发而迅速排出。这样使溶液蒸发，能够促进核酸捕获部的毛细管效应，由此能够实现高速的吸引，抵抗重力而捕获细胞。
(实施例1-2)使用了器件的单一细胞分析方法
图4是表示使用了图5所示的实施例1-1中制造的本发明器件的单一细胞分析方法的概略的流程图。本实施例中，在器件中进行(步骤1)细胞捕获、(步骤2)细胞裂解(破碎)、(步骤3)互补链(1st strand)(例如cDNA合成)、(步骤4)捕获核酸分解(例如mRNA分解)、(步骤5)2nd strand合成、(步骤6)扩增反应。另外，(步骤5)之前的反应在核酸捕获部510上固定有反应产物，进行固相反应。(步骤6)中，从二维阵列芯片游离的扩增产物扩散到反应室524的反应试剂中。扩增反应完成后，通过吸引从样品回收口512回收含有该扩增产物的试剂。
另外，也可以在(步骤4)的互补链(1st strand)合成(例如cDNA合成)完成后，将二维阵列芯片从器件上取下，将芯片下沉到装有试剂的管中，在管中(器件外)进行将珠粒回收到溶液中(步骤5)之后的反应。
(步骤7)是为了除去核酸序列分析中不需要的扩增时的副产物的精制工序。此外，(步骤8)是利用新一代测序仪的序列分析工序，只要是并行度高的测序仪，则可使用任意的序列分析平台。最后的(步骤9)是数据分析工序，是对每个细胞识别标签或芯片标签的序列分析结果进行汇总，构建每个单一细胞的基因分析数据的工序。
首先，进行用二维阵列芯片513上的细胞捕获部503捕获细胞溶液中的细胞的工序。因此，从细胞导入口511导入细胞溶液，从样品回收口512进行吸引，由此用细胞溶液充满二维阵列芯片513上。接着，通过对下部出口507施加负压，细胞溶液从二维阵列芯片513上的细胞捕获部503和核酸捕获部510中通过，细胞被细胞捕获部503捕获。图5(a)的501表示细胞捕获部捕获的细胞。此时，通过由隔膜泵进行的连续排气和核酸捕获部的毛细管效应实现高速吸引，能够克服重力引起的沉降地进行吸引。吸引时间每1μL为1分钟以内。此时，因沉降而吸附在二维阵列芯片上的细胞为10％以下。
为了破碎细胞，从细胞导入口511导入裂解缓冲液，通过从样品回收口512吸引，用裂解缓冲液充满二维阵列芯片513上，对下部出口507施加负压，以得到所需的吸引速度。所施加的负压力设为与细胞吸引时相同的压力。另外，为了完全完成细胞吸引，在导入裂解缓冲液之前导入1μL左右的PBS缓冲液也是有效的。
接着，进入互补链(1st strand)合成(例如逆转录、cDNA合成)的步骤。再次设定负压的值，以得到互补链合成(逆转录)用试剂混合物所需的导入速度。设定后，从细胞导入口511导入试剂，用试剂充满二维阵列芯片513上。然后，为了推进互补链合成反应(逆转录反应)，使器件的温度上升，仅维持反应所需的时间。此外，为了使试剂(例如逆转录酶)失活，升温至85℃。为了清洗、排出不需要的清洗液，从细胞导入口511导入清洗缓冲液，为了将清洗缓冲液导入、排出到核酸捕获部，再次设定负压。下一工序的捕获核酸分解(mRNA分解)和2nd strand合成与上述互补链(1st strand)合成(逆转录)的工序大致相同。
最后的工序为扩增反应。将扩增反应试剂混合物导入细胞导入口511，进行负压设定，以将试剂混合物以所需的溶液速度导入到核酸捕获部510。为了进行扩增反应(特别是PCR)，开始温度循环，在第1～第N个循环停止施加负压的同时变更压力设定，以进行冲洗。然后，重复温度循环直至达到所需的扩增产物浓度，为了回收扩增产物，对下部出口507施加负压进行吸引，将回收的扩增产物溶液排出到管中。
接着，详细说明使用了二维阵列芯片513的测序用样品的制备顺序。图6表示如何通过本实施例器件的核酸捕获部510所捕获的核酸(例如mRNA)的处理来制备样品。该工序分为细胞捕获(步骤1)后的细胞破碎和核酸(mRNA)捕获(步骤2)和互补链(1st strand)(例如cDNA)的合成(步骤3)和捕获核酸(例如mRNA)的分解(步骤4)、导入核酸扩增(PCR)和测序所需的已知末端序列的2nd strand的合成(步骤5)、以及核酸扩增(步骤6-1)(步骤6-2)的步骤。
将细胞用500μL的1×PBS缓冲液按照不损伤细胞的方式清洗后，从细胞导入口511导入悬浮在冷却至4℃的1×PBS缓冲10μL中的1000个细胞，从上部出口512进行吸引，以使反应室524被该溶液充满。由此，二维阵列芯片513上被含有细胞的PBS缓冲液充满。接着，按照溶液朝向上部流路526地从细胞捕获部503流通的方式，向下部出口507例如利用隔膜泵施加0.95个气压的负压来吸引溶液。细胞随着溶液的流动移动，到达细胞捕获部503，细胞捕获部503的开口直径小于细胞的直径，因此细胞被捕获至此。被捕获的细胞对溶液流发挥栓的作用，因此溶液流移动到尚未捕获有细胞的细胞捕获部503。因此，剩余的细胞移动到尚未捕获有细胞的捕获部并而被捕获。
当足够数量的细胞被捕获后，将未被捕获的过剩细胞和PBS缓冲液从样品回收口512排出。接着，从细胞导入口511向样品回收口512流入裂解缓冲液(例如Tween20等表面活性剂)，用缓冲器充满二维阵列芯片513上后，立即对下部出口507施加负压进行吸引。以下全部的溶液通过同样的方法从二维阵列芯片513的核酸捕获部510通过。此时，防珠粒流出膜518是由直径为0.8μm的多孔质材料构成的流路、压力损失大，因此通过使用这样的防珠粒流出膜518，能够容易地使裂解缓冲液从细胞捕获部503通过而向上部流路526缓慢地持续流动5分钟左右。
在裂解缓冲液作用下，被捕获的细胞501被破碎，核酸606(例如mRNA)露出到细胞外，由于细胞捕获部503周边的细胞溶液流以被吸入到构成细胞捕获部503的孔中的方式继续流动，因此核酸606(例如mRNA)不向周边扩散而是从细胞捕获部503通过而到达核酸捕获部510。这样，通过导入裂解缓冲液，同时进行细胞的破碎、和固定在核酸606(例如mRNA)的核酸捕获部510的珠粒上的第一DNA探针601的捕获。该情况表示在图6的步骤2中。
这里，为了将捕获有细胞的二维阵列芯片513上的位置的信息、即图5的(a)所示的排列成格子状的细胞捕获部503的位置坐标纳入基因分析的数据中，在核酸捕获部510的珠粒表面上固定有导入了每个细胞捕获部503不同的序列的细胞识别序列602的第一DNA探针601。图6中，各步骤图中的左端的斜线表示固定壁面，在此表示珠粒表面。该第一DNA探针601在3’末端区域具有与欲捕获的核酸互补的序列(例如捕获mRNA的情况下为聚T序列)，通过与欲捕获的核酸的序列杂交(例如与mRNA的3’末端的聚A序列杂交)，捕获核酸606(例如mRNA)。另外，也可以在5’末端侧设置用于扩增反应的通用引物(604、反向)。
本实施例中，该第一DNA探针601从5’末端起依次排列有约30个碱基的扩增用通用引物(604、反向)、约7个碱基的细胞识别序列(602)、以及约18个碱基的寡聚(dT)序列+2个碱基的VN序列。本实施例中，为了分析mRNA而在捕获用DNA探针601的一部分中使用了聚T序列，但为了进行microRNA或基因组分析，可以使用与分析对象的核酸序列互补的序列的一部分或随机序列代替聚T序列，这样的捕获用探针的序列设计可以由本领域技术人员根据常用技术适当进行。
接着，如图6的步骤3所示，以第一DNA探针601捕获的核酸(mRNA)606为模板，合成1st strand 607。本实施例中，为了从mRNA合成cDNA，作为1ststrand合成试剂，将含有0.1％Tween20的10mM Tris Buffer(pH＝8.0)58.5μL、10mM dNTP 4μL、5×RT Buffer(SuperScript III、Invitrogen公司)225μL、0.1M DTT 4μL、RNaseOUT(Invitrogen公司)4μL和Superscript III(逆转录酶、Invitrogen公司)4μL混合，从细胞导入口511与前工序同样地导入。将上述溶液在充满用含有合成试剂(例如逆转录酶)和合成底物的溶液填充的珠粒的空隙部分的状态下，一边从反应室524非常缓慢地流入到上部流路526，一边缓慢升温至50℃进行50分钟这样的互补链合成反应(1st strand合成反应)。其结果，对于每个细胞，得到固定于多个珠粒表面的核酸(例如cDNA)的文库。这被称为一个细胞核酸(cDNA)文库阵列，与以往由大量细胞得到的平均化的核酸(cDNA)文库根本不同。
合成1st strand 607后，将器件整体在85℃下保持1.5分钟，使合成试剂(例如逆转录酶)失活。进而，冷却至4℃后，从上部入口511注入含有例如RNase及0.1％Tween20的10mM Tris Buffer(pH＝8.0)0.2mL，从上部出口512进行吸引，用溶液充满反应室524，然后从下部出口507排出，将反应室524中的缓冲液从上部出口512除去，将上述工序重复5次，由此将捕获核酸(mRNA)分解，将核酸捕获部中的残留物及分解物除去、清洗。此外，用含有碱改性剂的液体和清洗液同样地清洗5次。通过到此为止的工艺，构建如图6的步骤4所示那样的、与每个捕获的细胞的全部细胞对应的核酸文库阵列、例如cDNA文库阵列。
接着，将灭菌水69μL、10×Ex Taq Buffer(TaKaRa Bio公司)10μL、2.5mM dNTP Mix 100μL和添加有各10μM的扩增用通用序列(反向)609的Ex Taq Hot start version(TaKaRa Bio公司)1μL混合，将该混合试剂与前工序同样地从上部入口511导入到核酸捕获部510。带芯片识别标签610的第二DNA探针608的单独导入方法在后面叙述。然后，在95℃下用3分钟将核酸的2次结构解开，然后在44℃用2分钟以1st strand为模板对引物的基因特异性序列611进行退火。图6的步骤5表示第二DNA探针608与1st strand杂交而合成2nd strand 612的情况。通过用6分钟将温度升高到72℃，完成互补链延长反应。
第二DNA探针608向反应室524的导入如下进行。首先，从细胞导入口511导入矿物油，从上部出口512排出。接着，使含有试剂的缓冲溶液从上部流路526流向单独入口527，将反应室内的多余矿物油从单独入口527排出。由此，在二维阵列芯片513下部的反应室524中充满缓冲液的区域被矿物油分离。发生这样的分离是因为，反应室524的内壁是亲水性的，而反应室之间的区域528实施了表面处理而成为疏水性。另外，为了维持高的反应效率，优选将1st strand牢固地(例如通过生物素-抗生物素蛋白结合)固定在珠粒上。反应室524的分离完成后，将含有芯片识别序列分别不同的第二DNA探针的缓冲溶液从单独入口527导入，通过上部流路526从上部出口512排出。由此，核酸捕获部510附近被每个反应室524不同的第二DNA探针充满，该探针与1st strand杂交。在2nd strand的合成结束后，从细胞导入口511向样品回收口512流入大量的缓冲溶液，冲洗位于区域528的矿物油。由于流路可以相连，因此矿物油可多少残留在区域528。
最后的工序如图6的步骤6-1和步骤6-2所示那样，是利用通用引物的扩增反应。本实施例中，进行PCR反应，将灭菌水49μL、10×High Fidelity PCR Buffer(Invitrogen)10μL、2.5mM dNTP mix 10μL、50mM MgSO4 4μL、10μM PCR扩增用通用引物(正向)10μL、10μM PCR扩增用通用序列引物(反向)10μL、以及Platinum Taq Polymerase High Fidelity(Invitrogen公司)1.5μL混合，制备试剂，然后与前工序同样地从细胞导入口511导入。接着，将器件整体保持在94℃30秒，重复94℃30秒→55℃30秒→68℃30秒这3阶段工序40个循环，最后在68℃下保持3分钟后，冷却至4℃进行扩增工序。该反应是共通反应，通过对所有芯片在共通条件下进行扩增反应，能够实现芯片间的扩增效率的均一化。回收溶液中蓄积的扩增产物溶液，为了除去该溶液中所含的游离的扩增用通用序列引物(正向/反向)、酶等残留试剂，例如使用PCR Purification Kit(QIAGEN公司)进行精制。
得到的扩增产物615是可进行序列分析的序列，被称为序列库。即使在上述工序中，在基因间或分子间产生扩增偏差，也能够在获得序列数据后利用分子识别标签进行扩增偏差的校正，因此能够得到高精度的定量数据。通过对该序列库进行序列分析，可针对每个细胞识别序列、芯片识别序列获得基因表达量。即，能够同时分析在器件中同时导入的细胞识别序列的种类和芯片识别序列的种类之积的数量以下的细胞数。由此，能够进行事前比导入到二维阵列芯片中的细胞识别序列数多很多的细胞数的分析。
另外，本发明者们已经对能够同时实现针对单一细胞的基因分析和针对包含该细胞的细胞集团的综合性基因分析的细胞分析方法进行了国际专利申请(2014年9月9日申请的PCT/JP20102014/073753)。该申请的说明书、权利要求书以及附图所记载的内容直接作为参考纳入本说明书中。
(实施例1-3)除重力以外的斥力的施加方法(表面处理)
二维阵列芯片可以使用PDMS树脂制作。在注入构成核酸捕获部的珠粒之前，通过对PDMS树脂制的二维阵列芯片(基板)的表面进行涂敷，斥力在二维阵列芯片表面附近沿从二维阵列芯片(基板)吸离的方向作用于细胞，能够抑制细胞在芯片表面的吸附。本实施例中，涂覆MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)聚合物(日油制Lipidure(注册商标)-CM5206)，能够使细胞的吸附率降低至1/10以下。作为涂布方法，制备0.5w％乙醇溶液，在PDMS树脂膜上每个芯片滴加2μL，将芯片用溶液覆盖放置5分钟，回收芯片。器件的结构与图5相同，几乎不吸附细胞，在所有芯片中回收95％以上的细胞。作为涂布剂，除了MPC聚合物以外，还有以PEG(聚乙二醇)为基础的物质(JSR Life Science公司制的Blockmaster)等，可以使用任意的涂布剂。
(实施例1-4)除重力以外的斥力的施加方法(基于电泳的构成)。
图7表示使用电泳对细胞施加斥力来减少细胞对二维阵列芯片的吸附的构成。与图5所示的基本构成的不同在于，在上下配置有用于电泳的电极、以及将核酸捕获部的珠粒设为金属性的金微粒而不是磁性珠，此外还配置了高频电源。
用于抑制细胞吸附的电极构成如下。上部电极729配置在上部流路726中，是铂制的平板基板。配置在二维阵列芯片的正上方且与二维阵列芯片大致相同尺寸的1.1毫米见方的方形电极按芯片的数量串联连接。另外，电极的厚度为0.1mm。在本实施例中的使用方法中，由于施加电压低，所以腐蚀的可能性低，材质也可以是除铂以外的金属。另外，下部电极730将直径为0.1mm的导线配置成格子状，通过超声波焊接将电极结构成型。此外，如图7(a)所示，将导线配置在细胞捕获部之间。另外，核酸捕获部731将直径为400nm的金微粒封装，在其表面使用硫醇基固定DNA探针。通过使该核酸捕获部为金微粒(金胶体)，从而通过电感耦合，吸引力朝向细胞捕获部作用。另外，从高频电源732施加到两电极的交流电压为数kHz、10Vpp的正弦波，施加比从介电引力反转为介电斥力的频率低的频率。当然，也可以使频率高于数MHz(根据细胞的大小、介电常数的不同，该频率不同)的介电强度作为斥力，与吸引力对抗使用。
(实施例2)
图8是表示本发明的另一方式的器件的构成的概要的图，(a)是上表面图，(b)是8A-8A’截面的剖视图、示出了细胞溶液吸引时的构成。另外，图8(c)表示扩增反应时的三维多孔质体与二维阵列芯片分离时的剖视图。本实施例的器件中为下述构成：如实施例1那样，不将重力和吸引力设置为相反方向(也可以设置为相反方向)，通过使用三维多孔质体增加吸引力，将重力引起的沉降的影响抑制到最小。对于为了抑制成为课题的扩增产物向配置于溶液保持部819的三维多孔体内部的吸附而设置有将三维多孔质体和二维阵列芯片分离的手段的器件构成和动作方法，以与实施例1的不同点为中心进行说明。
图8(b)是细胞捕获时的器件的剖面图。二维阵列芯片813由具有弹性的PDMS树脂制作，作为用于防止形成核酸捕获部810的珠粒流出的防珠粒流出膜818，使用孔径为0.8μm的树脂制多孔膜(Isopore膜，Millipore公司制)。
器件800具备多个反应室824，在该各个反应室824中配置有具备多个细胞捕获部803、和与该各个细胞捕获部803对应的核酸捕获部810的二维阵列芯片813。细胞溶液通过从细胞导入口811朝向样品回收口812地在共用流路825中流动，供给到二维阵列芯片813上，芯片上被细胞溶液充满。单独入口827用于在向每个芯片单独导入试剂的情况，具体而言，例如用于在导入含有用于识别芯片的具有标签序列的引物的试剂时等。
在核酸捕获部810的下部流路837中配置作为三维多孔质体的多孔质Shirasu烧结体(Shirasu多孔质玻璃：SPG膜，SPG Techno公司制)，作为溶液保持部819。通过使用该三维多孔质体，能够高速地进行吸引，能够排除重力引起的沉降的影响。下部流路837与下部出口838及吸入空气的吸气口835连通，在吸气口835附近设置压力调整过滤器836(本实施例中考虑水与空气的粘度之差，使用了孔径为0.1μm的树脂制多孔膜(Isopore膜，Millipore公司制))及空气阀834。在使细胞捕获部803捕获细胞时，二维阵列芯片813上被细胞溶液充满后，在打开了气阀834的状态下通过与下部出口838连接的注射器泵施加负压。当然，也可以使用隔膜泵等其他泵来代替注射泵。
通过向下部出口838施加负压，二维阵列芯片弯曲，防珠粒流出膜818与三维多孔质体(819)密合。由此，能够充分发挥三维多孔质体的毛细管效应而高速地吸引细胞溶液。
以下记载充分利用毛细管效应的高速吸引的方法。在图8所示的器件中，将图中所示的位置A(二维阵列芯片813的上部)、位置B(溶液保持部819与压力调整过滤器836之间的下部流路837)、位置C(二维阵列芯片813与溶液保持部819之间)、以及位置D(比溶液保持部819更靠近下部出口838的下部流路837)中的压力关系设定为A>>B>C>D的大小关系，此时，核酸捕获部810被溶液充满，进而溶液与溶液保持部819接触，发生构成溶液保持部819的三维多孔体中的毛细管现象，从而产生大的吸引力。该毛细管现象产生的吸引力例如在三维多孔质体的孔径为10μm时，就本实施例的构成而言，可计算出在细胞捕获部803(假定为直径为5μm的圆形)产生约100kPa的吸引力。由此，能够几乎不会受到重力引起的沉降的影响地对细胞进行吸引。
从吸气口835吸入的空气在位置B、位置C和位置D之间的压力差作用下通过溶液保持部819，由此溶液保持部819所吸收的水溶液向位置D排出。通过该排出，由溶液保持部819的毛细管现象产生的吸引力恢复，因此只要继续从下部出口838进行吸引，溶液保持部819的吸引力就持续。另一方面，如果来自下部出口838的吸引停止，则构成溶液保持部819的三维多孔质体的孔内壁迅速被水溶液覆盖，吸引力消失。
接着，对三维多孔质体和二维阵列芯片的分离方法进行记载。与实施例1同样地，在用扩增反应(PCR反应)用的试剂充满反应室824后，通过对下部出口838施加负压，将扩增试剂(PCR试剂)导入到核酸捕获部。之后，压入注射器833，将积存于“潴留部”823的矿物油以10秒左右、缓慢地注入到防珠粒流出膜818和三维多孔质体之间。此时，三维多孔质体由于为高度亲水性而作为非极性溶剂的矿物油不会大幅度浸润到多孔质内。这样，如图8(c)所示，能够将残留于三维多孔质体的扩增试剂(PCR试剂)溶液与位于二维阵列芯片中的核酸捕获部的扩增试剂(PCR试剂)隔离。在使用空气代替矿物油的情况下，空气进入三维多孔质体中，能够将扩增试剂(PCR试剂)溶液与二维阵列芯片中隔离，这点是同样的。
(实施例2-2)利用三维多孔质体的移动机构的分离
实施例2-1中为了分离注入了非极性溶剂或油，但本实施例中，也可以在适当的时间点使三维多孔质体和二维阵列芯片拉开两者的间隔，分离溶液。具体而言，只要在三维多孔质体的正下方插入用于移动的机构即可。本实施例中示出使用了空气压的例子，但也可以使用伺服机构等移动机构。
图9表示利用空气压分离二维阵列芯片和三维多孔体的构成。939为聚乙烯树脂制的气囊。大小与二维阵列芯片同样地为1×1mm左右，通过使用注射器940等泵，向气囊中注入空气，气囊的厚度被设计为在0.1mm～0.3mm左右内变化。在按压注射器940注入空气时，二维阵列芯片与三维多孔质体密合，能够利用毛细管效应进行溶液的吸引。通过拉动注射器940，气囊939的内压降低，厚度变薄，利用这点将三维多孔质体从二维阵列芯片分离。
在导入扩增试剂(PCR试剂)之前，预先提高气囊的内压，在扩增反应(例如PCR循环)开始后降低气囊的内压，由此能够防止扩增产物吸附于三维多孔体内壁。
另外，也可以不进行伴随可动部的分离，而防止扩增产物向三维多孔质体的吸附。作为防珠粒流出膜918，也可以使用孔径为5nm左右的超滤膜代替0.8μm孔的ISOPORE。在该情况下，虽然二维阵列芯片和三维多孔体在全部工序中保持密合，但由于在扩增反应时将负压的施加设为关闭，因此能够大幅降低扩增产物通过超滤膜的速度。由此，也能够防止扩增产物吸附于三维多孔质体。
(实施例3)。
本实施例对组合有实施例1的器件构成和用于观察所捕获的细胞的荧光显微镜的装置构成进行说明。
图10表示构成图。器件1001的构成与实施例1的构成基本相同。但是，也包括用于高速吸引的三维多孔质体319、819、919。即，重力方向217设定为与细胞吸引方向216相反的方向。图中的二维阵列芯片513表示细胞溶液吸引时的状态，密合于三维多孔质体319、819、919。501是所捕获的细胞。
另外，为了施加负压，使用隔膜泵1002。悬浮在细胞溶液用管1003中的缓冲液中的细胞通过注射器1004的吸引而从细胞导入口511通过、被导入反应室。过剩的细胞溶液、试剂经由样品排出口512和三通阀1005被排出到废液用管1006。在细胞溶液被导入反应室的状态下使隔膜泵1002工作，捕获细胞。为了利用荧光显微镜观察此时的情况，如图10那样配置具有适于物镜1007和对细胞进行染色的荧光体的激发波长的激光光源1008、将激发光和来自细胞的荧光分离的分色镜1009和摄像照相机CCD照相机1010。1011为用于改变调焦和摄像区域的XYZ载物台。在通过荧光显微镜观察细胞的情况下，需要对细胞进行荧光染色。这里，采用对细胞膜进行染色的染色方法。为了经由装置1001上的显微镜观察窗1012进行荧光图像的获取，包含窗口在内的器件的材质使用了丙烯酸(PMMA)。当然，也可以使用其他透明的树脂材料(聚碳酸酯、环烯烃等)。
本说明书中引用的所有刊物、专利及专利申请直接作为参考纳入本说明书中。
符号说明
101、201、301 细胞
102 多孔质膜
103、203、303 细胞捕获部
104、204、304 上部区域
105 下部区域
106 入口
107、207、307 上部出口
108 下部出口
109 细胞
210、310 核酸捕获部
211、311 细胞导入口
212、312 样品回收口
213、313 二维阵列芯片
214、314 吸引前用于保持细胞溶液的下部区域
215、315 上部区域
216 细胞吸引(力)方向
217 重力方向
318 防珠粒流出膜(亲水性多孔质膜)
319 溶液保持部(三维多孔质体)
320 压力调整部件
321 吸气口
322 空气流
323 潴留部
333 注射器
500、700、800、900 器件
501、701、801、901 细胞
503、703、803、903 细胞捕获部
507、707 下部出口
510、810、910 核酸捕获部
511、711、811、911 细胞导入口(上部入口)
512、712、812、912 样品回收口(上部出口)
513、713、813、913 二维阵列芯片
518、718、818 防珠粒流出膜
524、724、824、924 反应室
525、725、825、925 共用流路
526、726、826、926 上部流路
527、727、827、927 单独入口
528、728、828、928 反应室间的区域
601 第一DNA探针
602 细胞识别序列
604 通用引物
606 核酸(mRNA)
607 1st strand
608 第二DNA探针
609. 扩增用通用序列(反向)
610 芯片识别标签
611 基因特异性序列
612 2nd strand
613 通用引物
614 扩增用通用序列(正向)。
615 扩增产物
729 上部电极
730 下部电极
731 金微粒核酸捕获部
732 高频电源
819、919 溶液保持部(三维多孔质体)
823 潴留部
833 注射器
834、934 空气阀
835、935 吸气口
836、936 压力调整过滤器
837、937 下部流路
838、938 下部出口
939 气囊
940 注射器
1001 器件(框体)
1002 隔膜泵
1003 细胞溶液用管
1004 注射器
1005 三通阀
1006 废液用管
1007 物镜
1008 激光光源
1009 分色镜
1010 CCD照相机
1011 XYZ载物台
1012 显微镜观察窗