绒毛白蜡耐盐SSR分子标记的制作方法

本发明涉及一种分子标记，尤其涉及一种绒毛白蜡耐盐SSR分子标记，属分子生物学技术领域。

背景技术：

盐害是黄河三角洲地区植物常见的非生物胁迫，是影响植物生长和产量的主要环境因子之一。因此植物耐盐新品种选育一直是国内外研究重点。植物的耐盐性是一个复杂的数量性状，涉及诸多基因和多种耐盐机制的协调作用(郝德荣等，2013)。通过形态学方法鉴定耐盐和盐敏感材料非常困难，尤其是从耐盐和盐敏感植物杂交后代筛选出耐盐个体，通常需要进行生理测定和耐盐试验，耗时、费力且许多表型特征不稳定，测定结果时常出现误差，并且破坏杂种植株。近年来，发展较快的分子标记鉴定与表型鉴定相比，具有不受环境条件和植物生长发育阶段影响、鉴定准确、多态性高、标记位点多且分布在整个基因组等优点，已成为植物遗传资源研究和辅助育种的重要手段。

杨青川等(2005)以耐盐苜蓿(Medicago)与敏盐苜蓿F2群体为试验材料，采用BSA法和RAPD相结合筛选出一个与苜蓿耐盐基因相连锁的分子标记，为苜蓿的耐盐性鉴定和分子标记辅助育种提供理论指导，加速了耐盐苜蓿新品种的育种进程。郭蓓等(2000)以大豆为材料筛选获得一个耐盐PCR标记，且利用该标记对300份大豆种质验证，研究结果与田间耐盐鉴定结果相一致，说明采用筛选的分子标记对大豆种质资源的耐盐性鉴定是可行的。陈宣等(2009)利用混合集群分析法以结缕草属植物耐盐性两极端类型材料进行筛选，再结合日本结缕草耐盐两极端材料对具有特异带的引物组合进行进一步筛选，获得了7个耐盐性紧密相关的SRAP分子标记，为开展结缕草属植物分子标记辅助育种奠定了基础。邵冰欣等(2015)以筛选出的27个盐敏感植株和10个耐盐植株为材料，获得8个与棉花耐盐性状相关的SSR标记，为棉花耐盐性状分子标记辅助选择育种奠定了基础。张丽娜等(2010)以棉花耐盐植株和盐敏感植株为试验材料，筛选出10对SSR引物耐盐标记，有望成为鉴定棉花耐盐性的标准引物，从而将耐盐棉花与盐敏感棉花鉴别开来，为棉花耐盐性分子鉴定等研究提供参考。王迎儿等(2015)以27份自交系南瓜为材料，以耐盐的南瓜NM083为父本、不耐盐的南瓜XBZM为母本构建F2群体，结合BSA法筛选耐盐相关的分子标记，筛选获得10条RAPD和8对SSR引物在双亲中显示出多态性，最终得到RAPD引物P597，并进行单株耐盐性验证，初步确定该RAPD标记与南瓜耐盐性紧密连锁，可加速耐盐南瓜材料的选育。孙叶红等(2015)以西府海棠×S19杂交组合的F1为试材，采用BSA法，筛选获得了4条与耐盐基因连锁的SRAP标记，并对单株进行分析验证，该标记可用于苹果砧木耐盐性的早期筛选鉴定和分子标记辅助育种。但检索发现，有关绒毛白蜡耐盐SSR分子标记未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种绒毛白蜡耐盐SSR分子标记。

本发明所述的绒毛白蜡耐盐SSR分子标记，其特征在于：所述绒毛白蜡耐盐SSR分子标记位点的引物为引物S78、引物S95，其核苷酸序列分别是：

引物S78：

正向引物5'–CTATTGACTCCACAACAAAACCC–3’

反向引物5'–TTTTTCCATTCATTTATGACGCT–3’；

引物S95：

正向引物5'–TAATAGATAAGCCTGCCTTTCCC–3’

反向引物5'–TTGTGGGTTCAAATCTGATCTTC–3’。

上述绒毛白蜡耐盐SSR分子标记主要通过以下步骤获得：

1.绒毛白蜡基因组DNA的提取

采用CTAB法提取基因组DNA，在提取缓冲液中加入2％β-巯基乙醇和2％PVP。紫外分光光度法测定DNA的浓度和纯度，稀释至30ng·μl^-1。

2.SSR位点开发

SSR分析以山东省林业科学研究省林木遗传改良重点实验室，通过转录组测序组装的绒毛白蜡Unigene作为参考序列。

利用Perl操作平台下的SSR软件Micro Satellite(MISA,http://pgrc.Ipk-gatersleben.de/misa/)进行SSR位点的搜索，参数设置：单、二、三、四、五、六核苷酸重复次数至少分别为12、6、5、5、4、4次，对所有SSR重复单元在unigene上前后序列的长度进行筛选，只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其设计引物。

3.SSR引物设计

使用软件primer3-2.2.2对筛选得到的SSR位点设计引物，引物设计原则：①引物长度18–25bp，最适长度22bp；②退火温度在52–64℃，最适退火温度58℃；③PCR产物长度80–300bp，最适长度150bp；④GC含量在40％–60％。

4.SSR-PCR反应体系

dNTP、Mg²⁺、TaqDNA聚合酶均购自山东塞恩斯科技有限责任公司。

SSR-PCR采用10μl反应体系：25mmol·l^-1Mg²⁺0.8μl、10μmol·l^-1引物0.2μl、10mmol·l^-1dNTP 0.3μl、5U·μl^-1Taq酶0.05μl、5–10ng·μl^-1DNA模板2.00μl、10×PCR缓冲液1.0μl，ddH2O 5.45μl；PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性1min，54℃–58℃退火1min，72℃延伸lmin，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃ 10min终止反应。

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：PCR产物用6％的变性PAGE电泳检测，电泳结束后用硝酸银染色观察结果，具体步骤参考赵梁军等(2015)的专利技术(ZL 201410318921.X,2015.9)。

5.引物筛选

对1800对引物的筛选结果显示，共有258对引物在6个材料间出现多态性。其中有2对引物S78和S95能将高抗盐材料与盐敏感材料区分开。2对引物扩增图谱如图1所示。

引物78在高抗盐材料R中扩增出2条大小在100bp–250bp范围的片段，在盐敏感材料H中扩增出2条100bp–150bp左右的片段；引物95在盐敏感材料H中扩增出1条130bp左右的片段，而高抗盐材料R则缺失130bp左右的片段，比盐敏感材料H少1条带。由此可见，这2对引物在抗盐材料中扩出的片段相同，在盐敏感材料中扩出的片段相同，且两者株系差异条带明显(差异条带在图1中已标出)，可将高抗盐材料与盐敏感材料区别开。

本发明利用SSR技术从中寻找具有特异性的条带，初步筛选出2条与耐盐相关的特异的DNA分子标记，公开的绒毛白蜡耐盐SSR分子标记有望成为鉴定白蜡耐盐性的标准引物，为白蜡耐盐种质的快速鉴定和白蜡耐盐育种提供准确的分子标记。本发明实现了将耐盐白蜡与盐敏感白蜡从分子角度进行鉴别，为白蜡耐盐性分子鉴定等研究提供了参考和依据。

附图说明

图1：分子标记S78和S95对6份已知耐盐绒毛白蜡材料的鉴定

其中：材料H：盐敏感植株；R：耐盐植株；M:Mark。

具体实施方式

实施例1

1.绒毛白蜡基因组DNA的提取

(1)材料

耐盐绒毛白蜡H(Fraxinus velutina Torr)和盐敏感绒毛白蜡S。取刚长出的新鲜叶片，用保鲜袋封存后置于冰盒带回山东省林业科学研究院，液氮冷冻后放置于–70℃冰箱中保存待用。

(2)采用CTAB法提取绒毛白蜡叶片基因组DNA

1)将配制好的CTAB提取缓冲液置于65℃的水浴锅中预热30min，氯仿:异戊醇(24:1)、无水乙醇、70％乙醇置于-20℃冰箱预冷备用，研钵需提前预冷，使用前再用少量液氮预冷。

2)取0.1-0.2g白蜡幼叶，加充足液氮(分两次加)研磨至粉末状，迅速转入2ml离心管中，加入600μl 2％的CTAB提取液(含2％β-巯基乙醇)，充分混匀。在65℃的水浴锅中水浴30min，其间轻轻颠倒3-4次。

3)冷至室温后加入600μl的氯仿：异戊醇(24：1)抽提10min，其间不停地轻轻地摇动，冷却至室温，在12000r·min^-1离心10min。

4)将上清液(约500μl)转入另一离心管中，加等体积氯仿:异戊醇(24:l)重复步骤3。

5)取出上清液并移到另一个干净的1.5ml的离心管中，再加1ml的预冷无水乙醇沉淀DNA(-20℃放置30min)，轻轻旋转离心管，出现絮状DNA，-20℃放置1h，观察沉淀生成。

6)8000rmp室温离心5min，倒掉上清液，沉淀用1ml 75％的酒精洗涤两次，超净工作台静置乙醇挥发干净。

7)待DNA风干后(DNA不宜过分干燥，否则极难溶解)，用适量的TE(PH8.0、50μl)或纯水溶解，4℃放置6-12h使其充分溶解。

8)加入2μl RNA酶10mg/ml，37℃水浴1h，利用微量分光光度计检测DNA质量，将DNA浓度按1:50稀释，置于-20℃保存备用。

2.SSR位点开发

SSR分析以山东省林业科学研究省林木遗传改良重点实验室，通过转录组测序组装的绒毛白蜡Unigene作为参考序列。

利用Perl操作平台下的SSR软件Micro Satellite(MISA,http://pgrc.Ipk-gatersleben.de/misa/)进行SSR位点的搜索，参数设置：单、二、三、四、五、六核苷酸重复次数至少分别为12、6、5、5、4、4次，对所有SSR重复单元在unigene上前后序列的长度进行筛选，只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其设计引物。

3.SSR引物设计

使用软件primer3-2.2.2对筛选得到的SSR位点设计引物，引物设计原则：①引物长度18–25bp，最适长度22bp；②退火温度在52–64℃，最适退火温度58℃；③PCR产物长度80–300bp，最适长度150bp；④GC含量在40％–60％。

4.SSR-PCR扩增反应

以提取的DNA样品为模板，采用No.1-84所示引物(序列明细列表见表1)进行SSR-PCR扩增；SSR-PCR采用10μl反应体系：Mg²⁺(25mmol·l^-1)0.8μl、引物(10μmol·l^-1)0.2μl、dNTP(10mmol·l^-1)0.3μl、Taq酶(5U·μl^-1)0.05μl、DNA模板(5-10ng·μl^-1)2.00μL、10×PCR缓冲液1.0μl，ddH2O 5.45μl；PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性1min，54℃-58℃退火1min，72℃延伸l min，共35个循环；最后72℃延伸5延伸l min，4℃10min终止反应，PCR反应于RCR System 9700(ABI Inc.)上进行。

表1：No.1-84所示引物序列明细列表

5.扩增产物的检测

PCR产物用6％的变性PAGE电泳检测，电泳结束后用硝酸银染色观察结果，步骤如下：

(1)清洗玻璃板：用自来水和洗涤灵把玻璃板反复擦洗干净，用双蒸水擦洗两遍，再用95％酒精擦洗两遍，晾干。

(2)组装胶板：用无屑纸巾在晾干的长板上均匀涂抹0.5％Binding Silane，在短板上均匀涂抹2％Repel Silane。干燥5min之后，将长板涂有Binding Silane的一面与短板涂有Repel Silane的一面相扣，两侧用夹子夹紧，水平放置。

(3)灌胶：取10mL双蒸水，加入8mL20％的Acr-Bis，2ml 10×TBE，8.4g尿素。尿素溶解以后加入24μL TEMED和300μL 10％的过硫酸氨(APS)，轻轻混匀，把胶沿灌胶口灌进，灌胶过程中注意防止出现气泡。然后插入梳子，静置使其聚合60min。

(4)PCR产物电泳前变性处理：PCR反应结束后，产物中加入等体积95％去离子甲酰胺，点样前95℃热变性5分钟，立即置于冰上，以保证变性后不会立即复性。

(5)加缓冲液：取出梳子，将聚合好的胶板组装到电泳槽上，然后将电泳槽连好导线并将导线接入电泳仪中，再将干净的1×TBE缓冲液加入电泳槽，注意让缓冲液没过梳子孔。插上电源，在60W恒功率预电泳30min。

(6)点样：用移液枪反复冲洗加样孔，然后将变性后的PCR产物加上6×Loading Buffer 3μL点样，每一个加样孔点样量为4μl，Marker为2μl，电泳缓冲液为1×TBE。

(7)电泳：60W恒功率电泳150min。

(8)硝酸银法进行染色：

具体步骤为：

1)脱色：加入2L固定液，在转速为60rpm的摇床上轻摇20min至胶完全脱色，

2)冲洗：倒出固定液，蒸馏水冲洗3次，每次2-5min,

3)染色：加入2L染色液，在转速为60rpm的摇床上轻摇染色30min；

4)冲洗：用蒸馏水冲洗胶板，不超过5s；

5)显影：把胶板迅速转移至预冷2L显影液中，轻摇，直至产物条带出现；

6)定影：将胶板迅速转移至原固定液中轻摇3-5min；

7)冲洗：蒸馏水清洗，胶板室温下干燥，使用相机拍照进行数据结果分析；

8)观察照相，记录。

上述试剂配制：

95％去离子甲酰胺10ml：(Formanide：9.5ml；溴酚蓝：0.025g；0.5M EDTA：0.2ml；二甲苯青FF：0.025g；无菌双蒸水：0.3ml)

固定液：10％冰醋酸2L；

染色液：一般于使用前10min配置，2L水中加入2g AgNO3，3ml甲醛；

显影液：2L水中加入60g Na2CO3，冷却至4℃，使用前5min加入甲醛3-6ml，10mg/ml硫代硫酸钠400μl。

6％变性聚丙烯酰胺凝胶500ml：(尿素：210g；10×TBE：50ml；丙烯酰胺：28.5g；灭菌双蒸水：450ml；甲叉双丙烯酰胺：1.5g)

6.引物筛选

对1800对引物的筛选结果显示，共有258对引物在6个材料间出现多态性。其中有2对引物S78和S95能将高抗盐材料与盐敏感材料区分开。该所述绒毛白蜡耐盐SSR分子标记位点的引物核苷酸序列分别是：

引物S78：

正向引物5'–CTATTGACTCCACAACAAAACCC–3’

反向引物5'–TTTTTCCATTCATTTATGACGCT–3’；

引物S95：

正向引物5'–TAATAGATAAGCCTGCCTTTCCC–3’

反向引物5'–TTGTGGGTTCAAATCTGATCTTC–3’。

上述2对引物扩增图谱如图1所示。引物S78在高抗盐材料R中扩增出2条大小在100bp–250bp范围的片段，在盐敏感材料H中扩增出2条100bp–150bp左右的片段；引物S95在盐敏感材料H中扩增出1条130bp左右的片段，而高抗盐材料R则缺失130bp左右的片段，比盐敏感材料H少1条带。由此可见，这2对引物在抗盐材料中扩出的片段相同，在盐敏感材料中扩出的片段相同，且两者株系差异条带明显(差异条带在图1中已标出)，可将高抗盐材料与盐敏感材料区别开。

上述研究初步筛选出2条与耐盐相关的标记，有望成为鉴定白蜡耐盐性的标准引物，从而将耐盐白蜡与盐敏感白蜡从分子角度进行鉴别，为白蜡耐盐性分子鉴定等研究提供参考。