本发明涉及中药及中药材、中药提取物鉴定技术领域，特别是一种能够特异性鉴定金钱白花的pcr方法及其特异引物。主要用于乌梢蛇药材、乌梢蛇提取物、极限条件提取物，含有乌梢蛇的制剂以及极限条件处理的乌梢蛇制剂快速鉴定。
背景技术：
乌梢蛇(zaocysdhumnades(cantor))为游蛇科动物，其干燥体可作为中药材，性甘，平，归肝经。具有祛风，通络，止痉等作用，应用于风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼歪斜，半身不遂，抽取痉挛，破伤风，麻风等症。
乌梢蛇多于夏、秋二季捕捉，剖开其腹部或先剥皮留头尾，除去内脏，盘成圆盘状，干燥。中药乌梢蛇多盘径约16cm，表面黑褐色或绿色，密被菱形鳞片，被鳞行数成双，背中央2～4行鳞片强烈起棱，形成两条纵贯全体的黑线。头盘在中间，扁圆形，眼大而下凹陷，有光泽。成品则为黄色粉末。
pcr方法：pcr是聚合酶链式反应的简称，是一种酶促化学反应，可以在试管里将待测的目的基因在很短的时间内扩增物十万倍乃至上百万倍，大大提高了基因诊断的灵敏度，降低了分析的难度。pcr法是目前基因诊断中使用最多的方法。
《中国药典》中已有pcr方法鉴定乌梢蛇药材的报道，但鉴定极限条件处理后的药物制剂中乌梢蛇的pcr方法至今未见报道。由于在制剂的生产过程中，存在粉碎、混合等环节，水煎煮提取、醇煎煮提取等工艺环节，甚至是高温高压等条件处理，这些条件要么使乌梢蛇粉末变为混合物，要么使乌梢蛇因提取过程而被破坏掉大量有机成分，使得制剂中乌梢蛇的鉴定变得困难。而有的制剂使用多种蛇类药材，或者使用多种蛇类和非蛇类动物药材，使得其它几味蛇类药材或非蛇类动物药材也存在干扰鉴定的可能，因而使制剂中乌梢蛇的鉴定变得十分困难。
技术实现要素：
本发明提供了一种用于鉴定乌梢蛇药材、乌梢蛇提取物、极限提取物以及含乌梢蛇制剂、极限条件处理后的制剂的引物及鉴定方法，该pcr鉴定方法操作简单，能快速准确的鉴定乌梢蛇粉末、提取物、极限提取物、混合制剂、甚至极限条件下处理的制剂。
一对鉴定乌梢蛇的特异引物：上游引物、下游引物，其序列为：
上游引物：5’-gcgaaagctcgacctagcaaggggaccaca-3’
下游引物：5’-caggctcctctaggttgttatggggtaccg-3’
一种乌梢蛇的pcr鉴定方法，包括以下步骤：分为以下四个步骤：
1、制备样品：制备乌梢蛇粉末、采用加热冷凝回流装置制备乌梢蛇水提物、醇提物和高压制备极限条件提取物，混合得到几种同类药材粉末并采用加热冷凝装置制备混合水提物、醇提物，高压条件下制备极限条件下混合粉末、混合水提物、混合醇提物。
2、样品dna提取：从以上样品中提取dna。
3、pcr反应：采用pcr方法得到pcr产物，95℃5min，30个循环(95℃30s，64℃45s)，72℃5min，得到扩增产物。
4、以电泳鉴定扩增产物大小，以此鉴定乌梢蛇真伪，通过实验验证方法的稳定性。方法：1.5％凝胶、130v电泳25min，在370bp处有单一条带，则确定所检材料为乌梢蛇。
附图说明
图1为乌梢蛇粉末和其他蛇类药材粉末的pcr鉴定结果，结果如图1所示，乌梢蛇在370bp处有均一条带，而其他易混淆品没有条带说明该方法可区分乌梢蛇粉末与易混淆品。m为marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为乌梢蛇对照药材，2～3为乌梢蛇粉末，4～6为蕲蛇粉末。
图2为金钱白花水提物和醇提物的pcr鉴定结果。金钱白花蛇水提物、醇提物提取物均在370bp处有均一条带，说明该方法可鉴定金钱白花蛇的提取物。m为marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为乌梢蛇对照药材，2为乌梢蛇水提物，3为乌梢蛇醇提物，4为蕲蛇水提物，5为蕲蛇醇提物，6金钱白花蛇水提物，7为金钱白花蛇醇提物。
图3为极限(高温、高压、长时间)条件下金钱白花蛇水提物和醇提物的pcr鉴定结果。金钱白花蛇极限提取物均在230bp处有均一条带，说明该方法可鉴定金钱白花蛇的提取物。m为marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为乌梢蛇对照药材，2为乌梢蛇极限条件水醇提物，3为乌梢蛇极限条件醇提物，4为蕲蛇极限条件水提物，5为蕲蛇极限条件醇提物，6金钱白花蛇极限条件水提物，7为金钱白花蛇极限条件醇提物。
图4为几种同类药材混合粉末、混合水提物、混合醇提物、极限条件下混合粉末、混合水提物、混合醇提物鉴定结果。含有金钱白花蛇的制剂有条带，说明可以区分金钱白花蛇的真伪。m为marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为乌梢蛇对照药材，2为多种同类药材混合粉末，3为混合水提物，4为混合醇提物，5为极限条件处理混合粉末，6为极限条件混合水提物，7为极限条件混合醇提物，8为金钱白花蛇和蕲蛇混合粉末，8为金钱白花蛇和蕲蛇混合水提物，9为金钱白花蛇和蕲蛇混合醇提物，10为极限条件下金钱白花蛇和蕲蛇混合粉末，11为极限条件金钱白花蛇和蕲蛇混合水提物，12为极限条件金钱白花蛇和蕲蛇混合醇提物。
具体实施方法：
1材料
金钱白花蛇粉末、乌梢蛇粉末、蕲蛇粉末均由通化金马公司提供，乌梢蛇对照药材购自中国食品药品检查所。
2特异引物
上游引物：5’-gcgaaagctcgacctagcaaggggaccaca-3’
下游引物：5’-caggctcctctaggttgttatggggtaccg-3’
3样品dna提取
本发明采用的dna提取方法为：取金钱白花蛇样品约0.1g至1.5ml离心管中，加入275μl消化液(细胞核裂解液200μl，0.5mol/ledta50μl，蛋白酶k(20mg/ml)20μl，rna酶溶液5μl)，55℃温育1h，加入250μlwizardsvlysisbuffer混匀，加到离心管柱中，10000r/min离心2分钟；弃掉过滤液，加入800μl洗脱液(醋酸钾162.8mmol/l，tris-hcl(ph7.5)22.6mmol/l，edta(ph8.0)0.019mmol/l，60％乙醇)，10000r/min离心1min；弃掉过滤液，用洗脱液反复洗脱3次，每次10000r/min离心1分钟；弃掉最后一次过滤液后再离心2min，将过滤柱转移入新的离心管中，加入100μlddh2o，室温放置2min后，10000r/min离心2min，滤液-20℃保存备用。
4pcr反应
表1pcr反应体系(25μl)
反应条件：95℃5min，30个循环(95℃30s，64℃45s)，72℃5min。
5电泳检测
配制含gelred的1.5％琼脂糖凝胶，130v电泳25min，在凝胶在紫外透射仪上观察，产物应在370bp处有单一条带。